Name: Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprenda a detectar splicing alternativo durante a transição epitélio-mesenquimal usando células epiteliais mamárias humanas e modelo induzível por tamoxifeno. Este método auxilia pesquisadores a estudar alterações de isoformas em nível de RNA e proteína.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores gostariam de agradecer a Wensheng Liu pela ajuda inestimável com imagens celulares. Este trabalho foi apoiado por doações dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (R01 CA182467), American Cancer Society (RSG-09-252-01-RMC), Lynn Sage Foundation e A Sister's Hope Foundation.

1 Cultura de Células da EMT Indução Nota: EMT pode ser induzida por meio de tratamento de TGF-p ou expressão ectópica de factores de transcrição de torção, Snail, ou ZEB1 / 2 em células epiteliais. Descrito neste protocolo é um sistema EMT induzida via expressão da proteína de fusão Twist-ER nas células mamárias humanas imortalizadas epiteliais (HMLE / Twist-ER, um presente do Dr. J Yang, UCSD) 9,11,29. Após o 4-hidroxitamoxifeno (TAM) de tratamento, a proteína de fusão Twist-ER transloca-se para o núcleo para dirigir a transcrição e resulta numa transição EMT completo em 12-14 dias 9,11,29. Sistemas induzíveis EMT adicionais, como HMLE / Caracol-ER, HMLE / TGF e MCF10A / TGF, pode ser encontrada em nossas publicações anteriores 11,30. <ol><li> Manter células HMLE / tvist ER mamária em meio de crescimento de células epiteliais sem soro (MEGM) em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2. Passagem das células a cada 2-3 dias, quando chegar a 80% de confluência. Incubar as células com tripsina a 0,15% a 37 ° C durante 5-10 minutos, e, em seguida, inactivar a tripsina com 5% de soro de vitelo / DMEM. Gire as células e ressuspender-los em MEGM. Células da placa em uma nova placa de cultura de tecidos a uma razão de 1 a 4. </li><li> Dissolve-se em etanol a TAM para fazer uma solução 200 uM. Proteger da luz e da TAM armazenar a -20 ° C. Antes da utilização, adicionar recém TAM para os meios de MEGM a uma diluição de 1: 10000 para fazer uma concentração final de 20 nM a TAM. </li><li> Para a indução da EMT, placa células 1,6 x 10 6 HMLE / Torção-ER em um 10 centímetros de cultura de tecidos prato em duplicado. Células de cultura com 20 nM mídia TAM contendo MEGM. </li><li> Placa células 1,6 x 10 6 HMLE / Torção-ER em uma placa de 10 cm em duplicado e tratar as células com etanol 0,01% como controle tratados com não-TAM. </li><li> Dois dias após a incubação, para tirar fotos sob um microscópio de luz em aumento de 10x para gravar alterações morfológicas de células. </li><li> Aspirar o meio de um prato de controlo ou tratados com a TAMcélulas. Lavar as células com PBS frio, e as células da colheita pela demolição metade da placa em tampão de lise de ARN para o isolamento de ARN e a outra metade em tampão RIPA para análise de proteínas. </li><li> Células passagem do controle ou pratos tratados com TAM por re-chapeamento de 1,6 x 10 6 células em um prato de 10 cm em duplicado. Continuamente tratar as células com 20 nM de TAM ou veículo. </li><li> Repita os passos 5-7 em dias alternados até ao dia 14, altura em que as células tratadas Twist-ER-TAM mostram uma morfologia mesenquimal em forma de fuso, ao passo que as células de controlo tratadas com veículo a manutenção da morfologia epitelial de tipo paralelepípedo. </li></ol> 2 Caracterização de EMT Nota: A conclusão da EMT é indicado por: (1) Celulares alterações morfológicas de uma morfologia epitelial calçada semelhante a uma aparência de fibroblastos-like fusiforme; (2) Perda de localização de E-caderina nas junções célula-célula; e (3) a expressão dos marcadores de comutação EMT, definida pela perdade marcadores epiteliais e ganho de marcadores mesenquimais. Celulares alterações morfológicas são captadas por microscópio de luz em aumento de 10x durante o curso do tempo de indução EMT, descrito na Seção 1 detecção de Imuno-fluorescência de E-caderina em junções celulares é descrita nesta seção. A expressão dos marcadores de EMT é detectada por imunotransferência. Marcadores epiteliais comuns são a E-caderina, γ-catenina, e ocludina e marcadores mesenquimais incluem fibronectina, N-caderina e vimentina. Procedimentos gerais de immunoblotting estão descritos na Seção 4. <ol><li> No dia 12 do tratamento TAM, semente de 1 x 10 5 células em um de 12 milímetros de vidro lamela circular colocado num poço de uma placa de 24 poços. </li><li> 48 horas depois que as células de semeadura, médias Aspirar e lavar com pré-aquecido PBS. </li><li> Fix células com pré-aquecido a 4% de paraformaldeído durante 15 min. </li><li> Lave as células três vezes com PBS. </li><li> Incubar as células com 0,2% de Triton X-100 em PBS por 15min à temperatura ambiente. </li><li> Lave as células três vezes com PBS. </li><li> Incubar as células em 5% de BSA / PBS, durante 1 hora à temperatura ambiente para bloquear a ligação não específica. </li><li> Incubar as células com o anticorpo de E-caderina primário numa diluição 1:50 em BSA a 1% / PBS em uma câmara humidificada S / N a 4 ° C. NOTA: O intervalo para a diluição de anticorpo primário é normalmente entre 1:50 e 1: 200, e a diluição óptima para cada anticorpo deve ser determinada experimentalmente. </li><li> Decantar o anticorpo primário e lava-se as células três vezes com PBS. </li><li> Incubar as células com o anticorpo secundário marcado com fluorescência em uma diluição 1: 500, durante 1 h à TA. A partir deste passo, a proteger as células da luz. </li><li> Decantar o anticorpo secundário e lava-se três vezes com PBS. </li><li> Células mancha com 0,1-1 g / ml DAPI ou Hoechst para 10 min. </li><li> Lavar as células com PBS três vezes. </li><li> Monte lamelas com uma gota de meio de montagem, e lamelas de vedação com unha polonês. </li><li> Observar células e tomarimagens em um microscópio fluorescente 63X. </li></ol> A coloração com anticorpos adicionais podem ser realizados para confirmar o fenótipo de EMT. Por exemplo, N-caderina e actina de músculo liso-α pode ser corado por um 29,31,32 fenótipo mesenquimal. Reorganização de estrutura do citoesqueleto podem ser monitorizadas por coloração das células com faloidina para F-actina 11. Além disso, ensaios para a motilidade das células e resistência à morte celular podem ser realizados para examinar as propriedades dos EMT 11. 3 Detecção de Splice isoformas utilizando qRT-PCR Ensaios <ol><li> Projeto Primer NOTA: Os pares de primers devem ser cuidadosamente projetado para amplificar isoformas de splicing distintas. Exon pular, o acontecimento de processamento alternativo mais frequentemente observados, é mostrado como um exemplo para ilustrar a estratégia de desenho de primers. Figura 1A ilustra um exão de quatro pré-ARNm, com o terceiro exão de um exão variável. Inclusão de exão 3 resultaa produção de uma isoforma de emenda mais tempo, enquanto que o salto do exon 3 gera uma isoforma mais curta de splicing. Os iniciadores devem ser concebidos para distinguir a isoforma incluído exão-3-e isoforma do exão-3-ignorado, e para detectar o transcrito total deste ARNm. <ol><li> Para a detecção de inclusão exão, desenhar cuidadosamente um iniciador para a frente no interior do exão 3 variável, e uma sequência iniciadora reversa no interior do exão 4 constitutiva vizinhas, permitindo a amplificação específica da isoforma variável incluído-exão. Certifique-se não tanto à frente e conceber os iniciadores no seio da mesma exão variável inversa, a fim de evitar produtos de PCR amplificados a partir de ADN genómico ou de pré-ARNm. </li><li> Para amplificar especificamente os eventos ignorando exão, design um dos iniciadores, abrangendo a junção do exão 2 e constitutiva exão 4, que de outra forma seriam destruídos quando exão variável 3 está incluído. Conceber o outro iniciador no interior do exão 4 constitutiva Como tal, os produtos de PCR são gerados apenas quando o exão 3 é variável, excluied eo constitutivo exon 2 e exon 4 são posteriormente unidas. </li><li> Para detectar as transcrições totais do gene, desenhar os iniciadores de dentro de dois exons constitutivos 1 e 2 Assim, os produtos de PCR são amplificados a partir de todas as isoformas. </li><li> Certifique-se de que a temperatura de fusão (Tm) para todos os iniciadores é de aproximadamente 55 ° C, a duração de cada um dos iniciadores é aproximadamente 18-22 nucleótidos, e o tamanho dos produtos de PCR é entre 80 e 150 pares de bases. </li></ol></li><li> Extração de RNA: Extrato RNA usando um kit de isolamento total RNA (ver Tabela de Materiais). <ol><li> Recolher as células em 350 ul de tampão de lise de ARN. </li><li> Adicionar 350 mL de etanol a 70% ao ligado e misture bem. </li><li> Transfira a amostra para a coluna de purificação de ARN. </li><li> Centrifuga-se a 10000 xg durante 1 min e descarte de fluxo. </li><li> Lava-se a coluna uma vez com 500 ul de tampão de lavagem de RNA I e duas vezes com tampão de lavagem de ARN II. </li><li> Remover o tampão de lavagem residual ARNII a partir da coluna através de centrifugação à velocidade máxima durante 2 min. </li><li> Transferir a coluna para um novo tubo de 1,5 ml, adicionar 50 mL de água isenta de nuclease, no centro da matriz da coluna e eluir o ARN por centrifugação à velocidade máxima. </li></ol></li><li> Síntese da primeira cadeia de cDNA <ol><li> Determinar a concentração e a qualidade do RNA por medição da absorção de UV. NOTA: qualidade RNA bom deve ter uma relação absorbância / 280 nm 260 nm de aproximadamente 2,0. </li><li> Defina-se a transcriptase reversa (RT), de reacções que contêm 250 ng de ARN total, a 0,05 ug iniciadores de hexâmeros ao acaso, 50 pmol de MgCl2, 10 pmol de dNTPs, 2 ul de tampão 5 × GoScript, e 1 ul da enzima RT, num volume final de 20 ul. </li><li> Realizar as reacções de RT a 42 ° C durante 1 hora, seguido de incubação a 70 ° C durante 5 min, para inactivar a enzima RT. </li></ol></li><li> PCR em tempo real <ol><li> Configure 20 reacções ul que consistem em 10 mL SYBR master mix verde,0,1-1,0 modelo de cDNA ul e 5 pmol de iniciadores directos e inversos. </li><li> Executar PCR em tempo real com 40 ciclos dos seguintes passos: 95 ° C desnaturação durante 10 seg, 58 ° C, emparelhamento durante 10 segundos, e extensão a 60 ° C durante 30 seg. Realizar reações de PCR em triplicado. </li><li> Confira curvas de dissociação e certifique-se que um único pico é observado para cada conjunto de primers. </li><li> Obtenção dos valores de ciclo de quantificação (Cq), calculando os segundos valores derivados das curvas de amplificação. </li><li> Calcula-se a quantidade relativa (RQ) de mRNAs alvo em amostras induzidas, em comparação com a amostra não induzido utilizando o "delta delta Cq (ΔΔCq) 'método, como mostrado pela seguinte fórmula. Use genes de manutenção, tais como GAPDH ou TBP, como referência. </li></ol></li></ol><img alt="Equação 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51845/51845eq1.jpg"> Para calcular com mais precisão os valores relativos das isoformas de splicing, tele utilizar de múltiplos genes de referência deverá ser considerada. Os resultados podem ser analisados ​​utilizando um método de quantificação de valor absoluto modificado descrito por Pfaffl et al 33,34. 4. Exame da Splice isoformas no nível de proteína <ol><li> Recolher as células em 100 de tampão RIPA arrefecido em gelo ul. </li><li> Definir lisados ​​em gelo durante cerca de 10 min. </li><li> Centrifuga-se a 14000 xg durante 10 min a 4 ° C, e recolher o sobrenadante. </li><li> Medir a concentração de proteína por meio de ensaios de Bradford. </li><li> Diluir as amostras de proteína em tampão de carga de SDS e carregar 20-40 ug de proteínas em géis de 10% SDS-PAGE. </li><li> Execute géis SDS-PAGE a 20 mA durante 1,5 horas. </li><li> Proteínas de transferência para membranas de PVDF em um sistema de transferência húmida a 4 ° C durante 3 horas a 85 V. Ajustar o tempo de transferência de acordo com o peso molecular de proteínas alvo. </li><li> Bloco de membrana em 5% de leite desnatado durante 30 minutos a 1 hora a RT. </li><li> Incubar wi membranapo um anticorpo primário a 4 ° CO / N. O intervalo para a diluição de anticorpo primário é normalmente entre 1: 200 e 1: 5000, determinar a diluição óptima para cada anticorpo experimentalmente. A diluição dos anticorpos usados ​​no presente protocolo podem ser encontrados em "Tabela de reagentes e equipamentos específicos". <ol><li> Para detectar as isoformas de splicing, utilizar anticorpos específicos que reconhecem uma isoforma particular. Em alternativa, utilizar um anticorpo que reconhece o epitopo na região de codificação de exão constitutiva e detectar as isoformas de splicing, simultaneamente, com base nos seus tamanhos diferentes de proteína. </li><li> Ao mesmo tempo, controlar EMT por imunotransferência por marcadores EMT. Use E-caderina, γ-catenina, e ocludina como marcadores epiteliais, e fibronectina, N-caderina e vimentina como marcadores mesenquimais. </li></ol></li><li> Membrana de lavagem três vezes com TBS-T (50 mM Tris, 150 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20, pH 7,4) em um intervalo de 5 minutos. </li><li> Incubar membrana com uma formiga secundário conjugado com HRPibody em uma diluição de 1: 10000 a 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Membrana de lavagem três vezes com TBS-T com um intervalo de 5 minutos. </li><li> Visualizar proteína com um sistema de detecção de quimioluminescência e expor a membrana a uma película de auto-radiografia. </li></ol>

<ol><li>Thiery, J. P., Sleeman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+networks+orchestrate+epithelial-mesenchymal+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 131-142 (2006).</li>
<li>Yang, J., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+at+the+crossroads+of+development+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis.</a> Dev Cell. 14, 818-829 (2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+master+regulator+of+morphogenesis%2C+plays+an+essential+role+in+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">a master regulator of morphogenesis, plays an essential role in tumor metastasis.</a> Cell. 117, 927-939 (2004).</li>
<li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nat Cell Biol. 2, 84-89 (2000).</li>
<li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nat Cell Biol. 2, 76-83 (2000).</li>
<li>Comijn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-handed+E+box+binding+zinc+finger+protein+SIP1+downregulates+E-cadherin+and+induces+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The two-handed E box binding zinc finger protein SIP1 downregulates E-cadherin and induces invasion.</a> Mol Cell. 7, 1267-1278 (2001).</li>
<li>Bolos, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Slug+represses+E-cadherin+expression+and+induces+epithelial+to+mesenchymal+transitions%3A+a+comparison+with+Snail+and+E47+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Slug represses E-cadherin expression and induces epithelial to mesenchymal transitions: a comparison with Snail and E47 repressors.</a> J Cell Sci. 116, 499-511 (2003).</li>
<li>Eger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeltaEF1+is+a+transcriptional+repressor+of+E-cadherin+and+regulates+epithelial+plasticity+in+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">DeltaEF1 is a transcriptional repressor of E-cadherin and regulates epithelial plasticity in breast cancer cells.</a> Oncogene. 24, 2375-2385 (2005).</li>
<li>Shapiro, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+EMT-driven+alternative+splicing+program+occurs+in+human+breast+cancer+and+modulates+cellular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An EMT-driven alternative splicing program occurs in human breast cancer and modulates cellular phenotype.</a> PLoS Genet. 7, e1002218(2011).</li>
<li>Warzecha, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ESRP-regulated+splicing+programme+is+abrogated+during+the+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">An ESRP-regulated splicing programme is abrogated during the epithelial-mesenchymal transition.</a> EMBO J. 29, 3286-3300 (2010).</li>
<li>Brown, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+splice+isoform+switching+in+human+and+mouse+epithelium+is+essential+for+epithelial-mesenchymal+transition+and+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD44 splice isoform switching in human and mouse epithelium is essential for epithelial-mesenchymal transition and breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 121, 1064-1074 (2011).</li>
<li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Liu, S., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+RNA+splicing+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Alternative RNA splicing and cancer.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, 547-566 (2013).</li>
<li>Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+RNAs+transcribed+from+the+human+abl+gene+and+from+the+bcr-abl+fused+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene.</a> Cell. 47, 277-284 (1986).</li>
<li>Krangel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+HLA-A+and+-B+antigens+via+an+alternative+RNA+splicing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Secretion of HLA-A and -B antigens via an alternative RNA splicing pathway.</a> J Exp Med. 163, 1173-1190 (1986).</li>
<li>Brickell, P. M., Latchman, D. S., Murphy, D., Willison, K., Rigby, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+a+Qa%2FTla+class+I+major+histocompatibility+antigen+gene+is+a+general+feature+of+oncogenesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of a Qa/Tla class I major histocompatibility antigen gene is a general feature of oncogenesis in the mouse.</a> Nature. 306, 756-760 (1983).</li>
<li>Barbaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+splice-site+mutations+in+WT1+are+responsible+for+Frasier+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Donor splice-site mutations in WT1 are responsible for Frasier syndrome.</a> Nat Genet. 17, 467-470 (1997).</li>
<li>Charlet, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+muscle-specific+chloride+channel+in+type+1+myotonic+dystrophy+due+to+misregulated+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing.</a> Mol Cell. 10, 45-53 (2002).</li>
<li>Hutton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+missense+and+5%27-splice-site+mutations+in+tau+with+the+inherited+dementia+FTDP-17%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of missense and 5'-splice-site mutations in tau with the inherited dementia FTDP-17.</a> Nature. 393, 702-705 (1998).</li>
<li>Kohsaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+9+mutations+in+the+WT1+gene%2C+without+influencing+KTS+splice+isoforms%2C+are+also+responsible+for+Frasier+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Exon 9 mutations in the WT1 gene, without influencing KTS splice isoforms, are also responsible for Frasier syndrome.</a> Hum Mutat. 14, 466-470 (1999).</li>
<li>Philips, A. V., Timchenko, L. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+splicing+regulated+by+a+CUG-binding+protein+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Disruption of splicing regulated by a CUG-binding protein in myotonic dystrophy.</a> Science. 280, 737-741 (1998).</li>
<li>Savkur, R. S., Philips, A. V., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+regulation+of+insulin+receptor+alternative+splicing+is+associated+with+insulin+resistance+in+myotonic+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy.</a> Nat Genet. 29, 40-47 (2001).</li>
<li>Spillantini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+the+tau+gene+in+familial+multiple+system+tauopathy+with+presenile+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mutation in the tau gene in familial multiple system tauopathy with presenile dementia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 7737-7741 (1998).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotonic+dystrophy+evidence+for+a+possible+dominant-negative+RNA+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Myotonic dystrophy evidence for a possible dominant-negative RNA mutation.</a> Hum Mol Genet. 4, 599-606 (1995).</li>
<li>Graubert, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+mutations+in+the+U2AF1+splicing+factor+in+myelodysplastic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent mutations in the U2AF1 splicing factor in myelodysplastic syndromes.</a> Nat Genet. 44, 53-57 (2012).</li>
<li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+SF3B1+mutation+in+myelodysplasia+with+ring+sideroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Somatic SF3B1 mutation in myelodysplasia with ring sideroblasts.</a> N Engl J Med. 365, 1384-1395 (2011).</li>
<li>Yoshida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+pathway+mutations+of+splicing+machinery+in+myelodysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia.</a> Nature. 478, 64-69 (2011).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133, 704-715 (2008).</li>
<li>Reinke, L. M., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail+represses+the+splicing+regulator+epithelial+splicing+regulatory+protein+1+to+promote+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Snail represses the splicing regulator epithelial splicing regulatory protein 1 to promote epithelial-mesenchymal transition.</a> J Biol Chem. 287, 36435-36442 (2012).</li>
<li>Serini, G., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+myofibroblast+activity+and+phenotypic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation.</a> Exp Cell Res. 250, 273-283 (1999).</li>
<li>Zavadil, J., Bottinger, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+and+epithelial-to-mesenchymal+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions.</a> Oncogene. 24, 5764-5774 (2005).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, e45(2001).</li>
<li>Hellemans, J., Mortier, G., De Paepe, A., Speleman, F., Vandesompele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qBase+relative+quantification+framework+and+software+for+management+and+automated+analysis+of+real-time+quantitative+PCR+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data.</a> Genome Biol. 8, R19(2007).</li>
<li>Boutz, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+post-transcriptional+regulatory+switch+in+polypyrimidine+tract-binding+proteins+reprograms+alternative+splicing+in+developing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A post-transcriptional regulatory switch in polypyrimidine tract-binding proteins reprograms alternative splicing in developing neurons.</a> Genes Dev. 21, 1636-1652 (2007).</li>
<li>Salomonis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+regulates+mouse+embryonic+stem+cell+pluripotency+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing regulates mouse embryonic stem cell pluripotency and differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 10514-10519 (2010).</li>
<li>Calarco, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vertebrate+nervous+system+alternative+splicing+and+development+by+an+SR-related+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of vertebrate nervous system alternative splicing and development by an SR-related protein.</a> Cell. 138, 898-910 (2009).</li>
<li>Grabowski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+takes+shape+during+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing takes shape during neuronal development.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 388-394 (2011).</li>
<li>Seol, D. W., Billiar, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caspase-9+variant+missing+the+catalytic+site+is+an+endogenous+inhibitor+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A caspase-9 variant missing the catalytic site is an endogenous inhibitor of apoptosis.</a> J Biol Chem. 274, 2072-2076 (1999).</li>
<li>Srinivasula, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+endogenous+dominant-negative+short+isoform+of+caspase-9+that+can+regulate+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of an endogenous dominant-negative short isoform of caspase-9 that can regulate apoptosis.</a> Cancer Res. 59, 999-1002 (1999).</li>
<li>Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Bcl-2-related+genes+functional+consequences+and+potential+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Bcl-2-related genes functional consequences and potential therapeutic applications.</a> Cell Mol Life Sci. 61, 2189-2199 (2004).</li>
<li>Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+minigene+systems+to+dissect+alternative+splicing+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements.</a> Methods. 37, 331-340 (2005).</li>
<li>Cheng, C., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD44+alternative+splicing+by+SRm160+and+its+potential+role+in+tumor+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD44 alternative splicing by SRm160 and its potential role in tumor cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 26, 362-370 (2006).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O processo aqui descrito permite a detecção de splicing alternativo de um modelo de EMT indutível. Como tal, as alterações dinâmicas de emenda de expressão da isoforma pode ser captado em todo o curso de tempo de EMT. Este método tem vantagens sobre o uso de diferentes epithelial- ou linhas de células-representando mesenquimais para a comparação de splicing alternativo, porque origens genéticas distintas de linhas celulares relacionadas un poderia influenciar indevidamente splicing alternativo. No entanto, a indução bem...

A transição epitelial-mesenquimal (EMT) é um programa de desenvolvimento que impulsiona a morfogênese de órgãos e remodelação do tecido durante a embriogênese. Quando activados anormalmente, EMT promove a metástase do tumor e órgão fibrose 1,2. Obrigando estudos descreveram a importância da regulação da transcrição durante o processo de EMT, definida por vários factores de transcrição, tais como torção, Snail, e ZEB, que reprimem a expressão da proteína de junção aderente E-caderina, que resultam na perda de um cobble- pedra, como morfologia epitelial e ganho de um fenótipo mesenquimal fusiforme 3-8. Estudos recentes por meio de análise de todo o genoma de ARN revelou que existe um grupo de genes cujos padrões de splicing estão associadas quer epiteliais ou mesenquimais fenótipos 9,10. Trabalho de nosso laboratório de funcionalmente ligados splicing alternativo e EMT. Ao estudar a molécula de adesão de superfície celular CD44, foi demonstrado que CD44 alternative splicing é rigidamente controlado durante a EMT, e mais importante, que isoforma CD44 emenda comutação causalmente contribui para EMT 11. O splicing alternativo representa um modelo disseminado e conservada da regulação de genes, tal como até 95% de genes de multi-exões humanos são de splicing alternativo 12-14. Através da produção de vários produtos de proteínas a partir de um único gene, o splicing alternativo constitui um mecanismo essencial para a diversidade de proteínas, a adição de uma outra camada de complexidade para o genoma humano. Como tal, a desregulação de splicing alternativo pode potencialmente levar a profundos efeitos biológicos que causam doenças humanas. Na verdade, o splicing alternativo aberrante em doenças tem sido documentada por mais de uma década de 15-25, incluindo as recentes descobertas de que as mutações em genes que codificam a maquinaria spliceosome são comumente encontrados em síndromes mielodisplásicas 26-28. Portanto, o desenvolvimento de métodos confiáveis ​​para a detecção de i de splicing alternativosoforms é de grande importância no estudo de processos biológicos diversos, incluindo EMT. Aqui nós fornecemos um protocolo para detectar mudanças no splicing alternativo utilizando um modelo EMT induzida. Os métodos para a concepção de iniciadores de PCR e detectar as isoformas de splicing são adequadas não apenas para o estudo de splicing alternativo durante EMT, mas também para o estudo de splicing alternativo em outros processos biológicos. Investigando splicing alternativo durante EMT é imprescindível, a fim de compreender melhor os mecanismos da EMT ea metástase do tumor, facilitando, assim, o desenvolvimento de estratégias eficazes para tratar a metástase do câncer.

<table><tbody><tr><td>4-hidroxitamoxifeno</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td>Faça a solução de estoque dissolvendo o 4-hidroxitamoxifeno em etanol a 200 &#956;M. Mantenha a solução em -20 &#176; C protegido da luz.</td></tr><tr><td>Kit de isolamento de RNA total EZNA</td><td>Omega Bio-Tek</td><td>R6731</td><td>Kit de isolamento de RNA total</td></tr><tr><td>GoScript Sistema de transcrição reversa Promega</td><td></td><td>A5001</td><td>Reagente para ensaio qRT-PCR</td></tr><tr><td>GoTaq qPCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Reagente para ensaio qRT-PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 480 Sistema de PCR em tempo real</td><td>Equipamento Roche</td><td></td><td>para ensaio qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anticorpo CD44</td><td>R& D Systems</td><td>BBA10</td><td>diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo E-caderina</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>4065</td><td>Diluição 1:2.500 para immunoblotting; diluição 1:50 para imunofluorescência</td></tr><tr><td>&gama;-Catenina anticorpo</td><td>Cell Signaling</td><td>Technology 2309</td><td>Diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>Anticorpo oclusina</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-5562</td><td>diluição 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo de fibronectina</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>610077</td><td>1:5.000 diluição</td></tr><tr><td>Anticorpo N-caderina</td> BD <td>Transduction Laboratories</td><td>610920</td><td>Diluição 1:2.000</td></tr><tr><td>Anticorpo Vimentina</td><td>NeoMarkers</td><td>MS-129-p1</td><td>Diluição 1:500</td></tr><tr><td>Anticorpo GAPDH</td><td>Millipore Corporation</td><td>MAB374</td><td>Diluição 1:10.000</td></tr><tr>Sistema de <td>quimioluminescência</td> do <td>RPN2209</td> da <td>ciência da vida</td> <td>da saúde do reagente GE da detecção de blotting ocidental de Amasham ECL</td></tr></tbody></table>

detecção de splicing alternativo durante epitelial-mesenquimal transição

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

O splicing alternativo desempenha um papel crítico na transição epitelial-mesenquimal (EMT), um programa celular essencial que ocorre em vários processos fisiológicos e patológicos. Aqui descrevemos uma estratégia para detectar splicing alternativo durante EMT usando um modelo EMT induzível expressando o repressor de transcrição Twist. A EMT é monitorada por mudanças na morfologia celular, perda de localização da E-caderina nas junções célula-célula e a expressão comutada de marcadores EMT, como perda dos marcadores epiteliais E-caderina e γ-catenina e ganho dos marcadores mesenquimais N-caderina e vimentina. Usando conjuntos de primers específicos da isoforma, o splicing alternativo de mRNAs interessados é analisado por RT-PCR quantitativo. A produção de isoformas proteicas correspondentes é validada por ensaios de immunoblotting. O método de detecção de isoformas de emenda descrito aqui também é adequado para o estudo de splicing alternativo em outros processos biológicos.

Os procedimentos descritos acima fornecem um método robusto para detectar splicing alternativo durante EMT. Os resultados representativos de CD44 splice isoforma de comutação durante EMT induzida por torção são dadas abaixo como um exemplo. EMT induzida por torção em células HMLE / twist-ER foi caracterizado por uma transição de uma calçada de pedra como fenótipo epitelial para um fenótipo fibroblástica alongada (Figura 2A), a ausência de marcadores epiteliais E-caderina, γ-...

A regulação alternativa do splicing demonstrou contribuir para a transição epitelial-mesenquimal (EMT), um programa celular essencial em vários processos fisiológicos e patológicos. Aqui descrevemos um método utilizando um modelo EMT induzível para a detecção de splicing alternativo durante EMT.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar mudanças no splicing alternativo durante a EMT. Isso é obtido utilizando um modelo EMT induzível no qual a expressão da proteína de fusão torce. Nas células epiteliais mamárias humanas, as células são submetidas a EMT após o tratamento com tamoxifeno como um segundo passo.A expressão de isoformas de splice é analisada por RTPCR quantitativo usando conjuntos de primers específicos de isoformas, que revelam mudanças alternativas de splicing no nível de RNA. Em seguida, a abundância de proteína correspondente a cada isoforma é determinada por immuno blotting para confirmar a expressão de isoformas de splice no nível da proteína, são obtidos resultados que mostram mudanças no splicing alternativo em genes de interesse durante a EMT, com base em análises quantitativas de R-T-P-C-R e immuno blotting, Este método pode ajudar a responder questões-chave no campo do splicing alternativo de RN e EMT, como a forma como o splicing alternativo é regulado durante a EMT e como essa regulação afeta a EMT e os processos patológicos relacionados à EMT. As implicações desta técnica são para a terapia do câncer, pois a EMT desempenha um papel importante na promoção da invasão tumoral e metástase.Embora este método possa fornecer informações sobre splicing alternativo durante EMT. O método para detecção de MRA específica da isoforma também pode ser aplicado em outros sistemas, como o estudo de splicing alternativo na diferenciação de neurônios e no programa de mortes celulares. O primeiro passo é colocar as células em placas que expressam a proteína de fusão ER de torção, semear as células em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros em duplicata, em seguida, preparar e proteger a luz da solução de tamoxifeno para induzir a transição mesenquimal epitelial ou células de tratamento EMT com 20 nanomolares contendo tamoxifeno contendo meios para um grupo de controle não tratado com tamoxifeno, adicionar 0,01% de etanol a um conjunto adicional de células dois dias após a incubação.Tire fotos sob um microscópio de luz com ampliação de 10x para registrar quaisquer alterações morfológicas. Em seguida, lave as células com PBS frio. Raspe as células de uma metade da placa em tampão de lise de RNA para isolamento de RNA e a outra metade em 100 microlitros de tampão ripa gelado para análise de proteínas, passe as células de ambos os grupos como mostrado anteriormente e trate continuamente com tamoxifeno ou veículo 20 nanomolares.Repita essas etapas em dias alternados até o dia 14, quando as células ER de torção tratadas com tamoxifeno devem mostrar uma morfologia mesenquimal em forma de fuso. Considerando que os controles tratados com veículos devem manter a morfologia epitelial semelhante à do paralelepípedo. Aqui, um NNA de quatro exon prem é usado como exemplo para detecção de inclusão de exons.Projete um primer direto dentro do éxon variável três e um primer reverso dentro do éxon quatro constitutivo próximo. Permitindo a amplificação específica da variável exon incluiu isoforma para amplificar especificamente os eventos de salto de exon. Projete primers abrangendo a junção do éxon constitutivo dois e do éxon quatro que, de outra forma, seriam destruídos quando a variável éxon três é incluída.Projete o outro primer dentro do éxon constitutivo quatro para detectar os transcritos totais do gene e evitar produtos de PCR amplificados do DNA genômico ou primers de NA.Design prem dentro de dois éxons constitutivos quando estiver pronto. Segue os procedimentos padrão de extração de RNA para isolar o RNA das amostras de células coletadas anteriormente. Determinar a concentração e a qualidade do RNA por absorção de UV para sintetizar a primeira fita CD NA configurar reações de transcriptase reversa em um volume final de 20 microlitros.Realize reações de RT a 42 graus Celsius por uma hora, seguidas de incubação a 70 graus Celsius por cinco minutos. Para inativar a enzima RT em tempo real. A PCR configurou 20 reações de microlitros que consistem em 10 microlitros de master mix verde cibernético, 0,1 a 1,0 microlitros de modelo CD NA e cinco picomoles, primers diretos e reversos.Execute PCR em tempo real com 40 ciclos em triplicado. Verificar as curvas de dissociação e certificar-se de que é observado um único pico para cada conjunto de iniciais. Obtenha os valores do ciclo de quantificação calculando os valores da segunda derivada das curvas de amplificação.Calcule a quantidade relativa de mRNAs alvo em amostras induzidas em comparação com a amostra não induzida usando o método delta delta CQ mostrado por esta fórmula. Deixar as células colhidas para análise de proteínas no gelo durante cerca de 10 minutos antes de centrifugar e recolher o sobrenadante. Depois de determinar a concentração de proteína, dilua as amostras em carga de SDS, tampão e carregue 20 a 40 microgramas de proteínas em géis de página de 10% SDS.Execute géis de página SDS a 20 miliamperes por 1,5 horas. Após esse período, transfira proteínas para membranas de PVDF em um sistema de transferência úmida a quatro graus Celsius por três horas a 85 volts. Ajustar o tempo de transferência de acordo com o peso molecular das proteínas-alvo.Em seguida, bloqueie a membrana em leite desnatado a 5% por 30 minutos a uma hora. À temperatura ambiente, incube a membrana com um anticorpo primário a quatro graus Celsius durante a noite. O anticorpo primário reconhece o epítopo na região constitutiva do revestimento do éxon e detecta isoformas de slic simultaneamente com base em seus diferentes tamanhos de proteína.Ao mesmo tempo, monitore a EMT por immuno blotting. Para marcadores EMT. Use eec, ahern, gama-catenina e oclusina como marcadores epiteliais e fibronectina n caderina e menton como marcadores mesenquimais.No dia seguinte, lave a membrana três vezes com TBST em intervalos de cinco minutos. Em seguida, incubar a membrana com um anticorpo secundário conjugado com HRP em uma diluição de um a 10.000 por uma hora à temperatura ambiente. Após este tempo, lavar a membrana três vezes com TBST em intervalos de cinco minutos.Finalmente, visualize as proteínas com um sistema de detecção de quimioluminescência e exponha a membrana a um filme de autorradiografia. A EMT induzida por torção foi caracterizada por uma transição de um fenótipo epitelial semelhante a paralelepípedos para um fenótipo fibroblástico alongado, exibindo a ausência de marcadores epiteliais, e caderina, gama catenina e ocludina, e a regulação positiva de marcadores mesenquimais, fibronectina n caderina e vimentina. Além disso, a EMT foi avaliada pela perda da localização da caderina EC nas junções celulares representadas.Aqui estão os designs de primer para a detecção de isoformas de emenda CD 44. Os locais dos primers são indicados pelas diferentes setas coloridas. Os resultados das análises Q-R-T-P-C-R indicam uma diminuição significativa no mRNA de CD 44 V e aumento no mRNA de CD 44 s após 14 dias de tratamento com TAM.Por outro lado, o transcrito total de CD 44 permaneceu inalterado durante a EMT, consistente com os resultados de Q-R-T-P-C-R, o nível de proteína de CD 44 V diminuiu notavelmente, enquanto a expressão da proteína CD 44 s foi bastante regulada positivamente durante a realização deste procedimento. É importante lembrar que a indução bem-sucedida do otorrinolaringologista é muito importante. Assim, a TNE deve ser cuidadosamente confirmada com vários métodos, como detecção de alterações na morfologia celular, expressão de marcadores otorrinolaringológicos e localização de RIN na superfície celular.Seguindo este procedimento, outros métodos, como o relatório de gerenciamento de emenda, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como, como esses elementos de atuação e os fatores de transação afetam a regulamentação alternativa de emenda após seu desenvolvimento? Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do RNA, biologia do desenvolvimento e biologia do câncer explorarem a regulação alternativa do splicing nos processos EMT durante o desenvolvimento normal e a metástase do câncer.

detection-alternative-splicing-during-epithelial-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método simples é descrito para a indução de células epiteliais para mesenquimal (EMT) em uma variedade de tipos de células. Métodos de análise de células em EMT estados por imunocitoquímica estão incluídos.

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Aqui nós descrevemos um protocolo teve como objetivo investigar o impacto do splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de modelos parentais e resistentes in vitro através de RNA-seq e estabeleceu um método baseado qRT-PCR para validar genes candidatos.

Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cancro

Este relatório descreve um método de bioengenharia para conceber e construir novos factores de splicing artificial (ASFS) que modulam especificamente a splicing de genes alvo em células de mamífero. Este método pode ser expandido para manipular vários fatores artificiais para manipular outros aspectos do metabolismo do ARN.

Engenharia de fatores artificiais para manipular Especificamente splicing alternativo em células humanas

Apresentamos aqui um método de cultura de células para a indução de transições mesenquimais-epiteliais (MET) em células de sarcoma com base na expressão ectópica combinado de microARN-200 e os membros da família grainyhead-like 2 (GRHL2). Este método é adequado para a melhor compreensão do impacto biológico de plasticidade fenotípica sobre a agressividade e tratamentos do cancro.

A indução de transições mesenquimais-epiteliais em células de sarcoma

É descrito um em situ protocolo de hibridação (ISH) que usa oligonucleotides antisentidos curtos para detectar padrões de splicing alternativo pre-mRNA nas seções de cérebro de rato.

Análise quantitativa de alternativo Pre-mRNA emendar nas seções de cérebro de rato usando o RNA In Situ da hibridação do ensaio

Descrevemos um fluxo de trabalho sistemático para investigar a sinalização TGF-β e o EMT induzido pelo TGF β, estudando a proteína e a expressão genética envolvidas nessa via de sinalização. Os métodos incluem mancha ocidental, ensaio de repórter de luciferase, qPCR e coloração de imunofluorescência.

Estudando a sinalização TGF-β e a transição epitelial-mesenquimal induzida pelo TGF-β em câncer de mama e células normais

Este protocolo apresenta uma ferramenta rápida e útil para avaliar o papel de uma proteína com função não caracterizada na regulação alternativa de emenda após o tratamento quimioterápico.

Usando a ferramenta E1A Minigene para estudar alterações de emenda mRNA

Descrevemos métodos para investigar o EndMT induzido pelo TGF-β2 em células endoteliais observando alterações de morfologia celular e examinando as alterações de marcadores relacionadas ao EndMT usando a coloração da imunofluorescência. A edição de genes CRISPR/Cas9 foi descrita e usada para esgotar o caracol de codificação genética para investigar seu papel no EndMT induzido pelo TGF-β2.

Endotelial mediado por TGF-β para transição mesenquimal (EndMT) e a avaliação funcional dos efeitos endMT usando edição de genes CRISPR/Cas9

O splicing alternativo (AS) e a poliadenilação alternativa (APA) expandem a diversidade de isoformas de transcritos e seus produtos. Aqui, descrevemos protocolos de bioinformática para analisar ensaios de RNA-seq em massa e sequenciamento final de 3' para detectar e visualizar AS e APA variando entre condições experimentais.

Identificação de Splicing Alternativo e Poliadenilação em Dados de RNA-seq

O teste de transição claro / escuro é um dos testes mais utilizados para medir a ansiedade-como o comportamento em camundongos. Aqui, apresentamos um filme que mostra os procedimentos detalhados de como realizar o teste.

Claro / escuro Teste de transição para Ratos

Aprenda a detectar splicing alternativo durante a transição epitélio-mesenquimal usando células epiteliais mamárias humanas e modelo induzível por tamoxifeno. Este método auxilia pesquisadores a estudar alterações de isoformas em nível de RNA e proteína.

Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

Explorar mais vídeos