Detecção de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal Transição

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar mudanças no splicing alternativo durante a EMT. Isso é obtido utilizando um modelo EMT induzível no qual a expressão da proteína de fusão torce. Nas células epiteliais mamárias humanas, as células são submetidas a EMT após o tratamento com tamoxifeno como um segundo passo.

A expressão de isoformas de splice é analisada por RTPCR quantitativo usando conjuntos de primers específicos de isoformas, que revelam mudanças alternativas de splicing no nível de RNA. Em seguida, a abundância de proteína correspondente a cada isoforma é determinada por immuno blotting para confirmar a expressão de isoformas de splice no nível da proteína, são obtidos resultados que mostram mudanças no splicing alternativo em genes de interesse durante a EMT, com base em análises quantitativas de R-T-P-C-R e immuno blotting, Este método pode ajudar a responder questões-chave no campo do splicing alternativo de RN e EMT, como a forma como o splicing alternativo é regulado durante a EMT e como essa regulação afeta a EMT e os processos patológicos relacionados à EMT. As implicações desta técnica são para a terapia do câncer, pois a EMT desempenha um papel importante na promoção da invasão tumoral e metástase.

Embora este método possa fornecer informações sobre splicing alternativo durante EMT. O método para detecção de MRA específica da isoforma também pode ser aplicado em outros sistemas, como o estudo de splicing alternativo na diferenciação de neurônios e no programa de mortes celulares. O primeiro passo é colocar as células em placas que expressam a proteína de fusão ER de torção, semear as células em uma placa de cultura de tecidos de 10 centímetros em duplicata, em seguida, preparar e proteger a luz da solução de tamoxifeno para induzir a transição mesenquimal epitelial ou células de tratamento EMT com 20 nanomolares contendo tamoxifeno contendo meios para um grupo de controle não tratado com tamoxifeno, adicionar 0,01% de etanol a um conjunto adicional de células dois dias após a incubação.

Tire fotos sob um microscópio de luz com ampliação de 10x para registrar quaisquer alterações morfológicas. Em seguida, lave as células com PBS frio. Raspe as células de uma metade da placa em tampão de lise de RNA para isolamento de RNA e a outra metade em 100 microlitros de tampão ripa gelado para análise de proteínas, passe as células de ambos os grupos como mostrado anteriormente e trate continuamente com tamoxifeno ou veículo 20 nanomolares.

Repita essas etapas em dias alternados até o dia 14, quando as células ER de torção tratadas com tamoxifeno devem mostrar uma morfologia mesenquimal em forma de fuso. Considerando que os controles tratados com veículos devem manter a morfologia epitelial semelhante à do paralelepípedo. Aqui, um NNA de quatro exon prem é usado como exemplo para detecção de inclusão de exons.

Projete um primer direto dentro do éxon variável três e um primer reverso dentro do éxon quatro constitutivo próximo. Permitindo a amplificação específica da variável exon incluiu isoforma para amplificar especificamente os eventos de salto de exon. Projete primers abrangendo a junção do éxon constitutivo dois e do éxon quatro que, de outra forma, seriam destruídos quando a variável éxon três é incluída.

Projete o outro primer dentro do éxon constitutivo quatro para detectar os transcritos totais do gene e evitar produtos de PCR amplificados do DNA genômico ou primers de NA.Design prem dentro de dois éxons constitutivos quando estiver pronto. Segue os procedimentos padrão de extração de RNA para isolar o RNA das amostras de células coletadas anteriormente. Determinar a concentração e a qualidade do RNA por absorção de UV para sintetizar a primeira fita CD NA configurar reações de transcriptase reversa em um volume final de 20 microlitros.

Realize reações de RT a 42 graus Celsius por uma hora, seguidas de incubação a 70 graus Celsius por cinco minutos. Para inativar a enzima RT em tempo real. A PCR configurou 20 reações de microlitros que consistem em 10 microlitros de master mix verde cibernético, 0,1 a 1,0 microlitros de modelo CD NA e cinco picomoles, primers diretos e reversos.

Execute PCR em tempo real com 40 ciclos em triplicado. Verificar as curvas de dissociação e certificar-se de que é observado um único pico para cada conjunto de iniciais. Obtenha os valores do ciclo de quantificação calculando os valores da segunda derivada das curvas de amplificação.

Calcule a quantidade relativa de mRNAs alvo em amostras induzidas em comparação com a amostra não induzida usando o método delta delta CQ mostrado por esta fórmula. Deixar as células colhidas para análise de proteínas no gelo durante cerca de 10 minutos antes de centrifugar e recolher o sobrenadante. Depois de determinar a concentração de proteína, dilua as amostras em carga de SDS, tampão e carregue 20 a 40 microgramas de proteínas em géis de página de 10% SDS.

Execute géis de página SDS a 20 miliamperes por 1,5 horas. Após esse período, transfira proteínas para membranas de PVDF em um sistema de transferência úmida a quatro graus Celsius por três horas a 85 volts. Ajustar o tempo de transferência de acordo com o peso molecular das proteínas-alvo.

Em seguida, bloqueie a membrana em leite desnatado a 5% por 30 minutos a uma hora. À temperatura ambiente, incube a membrana com um anticorpo primário a quatro graus Celsius durante a noite. O anticorpo primário reconhece o epítopo na região constitutiva do revestimento do éxon e detecta isoformas de slic simultaneamente com base em seus diferentes tamanhos de proteína.

Ao mesmo tempo, monitore a EMT por immuno blotting. Para marcadores EMT. Use eec, ahern, gama-catenina e oclusina como marcadores epiteliais e fibronectina n caderina e menton como marcadores mesenquimais.

No dia seguinte, lave a membrana três vezes com TBST em intervalos de cinco minutos. Em seguida, incubar a membrana com um anticorpo secundário conjugado com HRP em uma diluição de um a 10.000 por uma hora à temperatura ambiente. Após este tempo, lavar a membrana três vezes com TBST em intervalos de cinco minutos.

Finalmente, visualize as proteínas com um sistema de detecção de quimioluminescência e exponha a membrana a um filme de autorradiografia. A EMT induzida por torção foi caracterizada por uma transição de um fenótipo epitelial semelhante a paralelepípedos para um fenótipo fibroblástico alongado, exibindo a ausência de marcadores epiteliais, e caderina, gama catenina e ocludina, e a regulação positiva de marcadores mesenquimais, fibronectina n caderina e vimentina. Além disso, a EMT foi avaliada pela perda da localização da caderina EC nas junções celulares representadas.

Aqui estão os designs de primer para a detecção de isoformas de emenda CD 44. Os locais dos primers são indicados pelas diferentes setas coloridas. Os resultados das análises Q-R-T-P-C-R indicam uma diminuição significativa no mRNA de CD 44 V e aumento no mRNA de CD 44 s após 14 dias de tratamento com TAM.

Por outro lado, o transcrito total de CD 44 permaneceu inalterado durante a EMT, consistente com os resultados de Q-R-T-P-C-R, o nível de proteína de CD 44 V diminuiu notavelmente, enquanto a expressão da proteína CD 44 s foi bastante regulada positivamente durante a realização deste procedimento. É importante lembrar que a indução bem-sucedida do otorrinolaringologista é muito importante. Assim, a TNE deve ser cuidadosamente confirmada com vários métodos, como detecção de alterações na morfologia celular, expressão de marcadores otorrinolaringológicos e localização de RIN na superfície celular.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como o relatório de gerenciamento de emenda, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como, como esses elementos de atuação e os fatores de transação afetam a regulamentação alternativa de emenda após seu desenvolvimento? Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do RNA, biologia do desenvolvimento e biologia do câncer explorarem a regulação alternativa do splicing nos processos EMT durante o desenvolvimento normal e a metástase do câncer.