Name: Um novo método de Drug Administration para Multiple peixe zebra ( Danio rerio) Ea quantificação da Retirada (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda um novo método de administração simultânea de etanol em grupos de peixe-zebra Danio rerio para estudar comportamentos de ansiedade durante a abstinência. Esta técnica reduz a variabilidade na exposição ao fármaco.

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Os autores não têm nada a divulgar.

Todos os procedimentos e testes comportamentais foram aprovadas pelo Conselho de Ética em Pesquisa Animal da Universidade MacEwan sob o protocolo número 06-11-12, que está em conformidade com o Conselho Canadense para as diretrizes do Animal Care para o cuidado e uso de animais de experimentação. 1. Prepare Tanques Dosagem, soluções e esquema de administração <ol><li> Preparar um esquema de administração de tal modo que os animais são doseados no mesmo ambiente e durante o mesmo tempo do dia a fim de evitar quaisquer confunde de tempo ou de polarização a estímulos visuais. </li><li> Obter o maior número, 1,5 L, tanques de desova de polipropileno claras idênticos como necessárias para o número de tamanhos de grupo. Utilização grupos de 8 peixes por tanque, o que permite por 2 grupos de peixe a ser testado por dia mais tarde no procedimento (ver etapa 3). Use um tanque de retenção e um tanque de dosagem por grupo (2x número total de grupos). <ol><li> Coloque 400 mm em todas as inserções de desova tanques de retenção. Fmal os tanques com água habitat ou água de osmose reversa na temperatura correta (de peixe-zebra, 25-28 ° C), que é consistente com o peixe temperatura são normalmente alojados em. NOTA: Não pode haver interações químicas indesejadas entre algumas drogas e os componentes químicos da água habitat tamponada. Nesta situação, usar água de osmose reversa tamponada com sais de aquário mínimo ou nenhum para a administração da droga, bem como para os grupos de controle. </li><li> Certifique-se de que os tanques estão em um ambiente neutro para evitar peixes condicionado a estímulos visuais externos durante a administração. </li></ol></li><li> Preparar a solução de fármaco. Misturar a quantidade apropriada de água com a droga habitat nos tanques de desova. Preparar a solução de etanol a 0,2% por combinação de 3 ml de um etanol de alto grau (95% de etanol não desnaturado) com 1,497 ml de água. Preparar a solução de etanol a 1,4% por combinação de 21 mL de etanol com 1479 ml de água. </li></ol> 2. A compensação Peixes e Ethanol Procedimento Administração <ol><li> Peixe cuidadosamente líquida de seus tanques de habitats e transferência para o tanque de retenção apropriado contendo a inserção de desova. Idealmente, abrigar o peixe na inserção de desova para eliminar compensação por completo. </li><li> Com todos os peixes em seus respectivos tanques de retenção, levante com cuidado a desova inserir fora do tanque de retenção e colocá-lo no tanque de solução droga apropriada (Figura 1A). <ol><li> Anote o tempo de dosagem, conforme necessário. Use 30 min em solução de etanol para o processo descrito aqui. </li><li> Se possível, tenha assistentes ajudar com a transferência de todos os grupos experimentais para a solução da droga ao mesmo tempo para garantir o tempo de dosagem precisa. Em alternativa, transferir um grupo de cada vez e manter o controle de dosagem vezes (Figura 1A) &#39;grupos individuais. </li></ol></li><li> No final do período de dosagem necessária, remover o peixe a partir da solução de etanol com cuidado levantando a inserção de desovapara fora da solução do fármaco e colocando suavemente de volta para o tanque de retenção. </li><li> Gentilmente net o peixe nos tanques de conservação e colocá-los de volta para seu habitat até a próxima vez a administração programada, ou coloque a desova inserir de volta para o tanque de retenção para eliminar compensação. </li><li> Como mencionado anteriormente, se possível, dentro dos parâmetros do equipamento de animais habitação, casa dos animais do mesmo tanque de desova e inserção que é utilizada como o tanque de retenção. Isto irá eliminar compensação completamente durante o processo de administração. </li></ol> 3. Teste Comportamental <ol><li> Obter uma luz / escuro arena de 9,5 centímetros de largura por 55 cm de comprimento e 9,5 cm de profundidade com um piso impermeável branco (Figura 1B). Cole papel não-reflexiva impermeável branco e preto para as paredes internas da arena usando velcro, com metade da arena coberta de branco e metade coberto de preto. Encher a arena a uma profundidade de 5 cm de altura com água a uma temperatura de habitat de 25-28 ° C. Manutain esta temperatura durante todo o teste. </li><li> Minimalize estímulos visuais externos através da construção de um cerco de três lados branco para a arena para situar-se em. Certifique-se de área de testes tem difundir iluminação superior que não causa reflexos na superfície da água, mas é suficientemente brilhante para o software de rastreamento de movimento, ou pós quantificação manual do -hoc a partir de imagens de vídeo. </li><li> Coloque a arena no recinto e definir os parâmetros de gravação e análise de movimento do software de rastreamento de comportamento. Defina a duração de teste para 5-15 min, dependendo da questão de pesquisa. NOTA: Aqui, usamos 5 min. </li><li> Transportar o grupo de peixes a ser testado para a área de pesquisa no tanque de habitat e colocá-los do lado de fora do gabinete arena. Aclimatar o peixe por 10 min. </li><li> Gentilmente net um peixe do grupo e local apropriado no centro da luz / Arena escuro, tendo a certeza de soltar o peixe quando é posicionada paralela ao longo eixo da arena para avoID de influenciar os resultados do peixe para a luz ou zona escura. </li><li> Comece comportamento gravação imediatamente depois que o animal é liberado. Preste atenção para os problemas de software com acompanhamento de peixe ou de peixe que salta ou congelamento. Girar a arena 180 ° depois de metade dos sujeitos foram testados para prevenir quaisquer confunde devido a preconceitos resultantes da qual a extremidade da arena está orientado para a extremidade aberta do invólucro. </li><li> Após o julgamento terminou, gentilmente net e retire o peixe da arena para um tanque ou tanque de habitat. </li></ol> 4. Análise <ol><li> Examine o tempo gasto na luz contra as zonas escuras. Para cada grupo e cada peixe, obter o tempo relativo gasto nas zonas claras e escuras e analisar usando um teste t uma amostra (ou teste de Wilcoxon para dados não paramétricos; diferença de (metade do tempo de julgamento total) 150 sec) para determinar se os grupos preferem significativamente uma área sobre a outra. </li><li> Para comparar preferências, calcular a prefeíndice de rence, subtraindo o tempo gasto na zona de luz a partir do tempo gasto na zona escura e comparar as diferenças entre grupos. t- testes pode ser utilizado para comparar dois grupos. Compare vários grupos com um one-way análise de variância, utilizando o teste post hoc HSD de Tukey onde (ou teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn teste post hoc para dados não paramétricos) necessário. </li><li> Compare a velocidade, número de transições de zona, sinuosos, e imobilidade entre os grupos. Use one-way análise de variância, utilizando o teste post hoc HSD de Tukey onde (ou teste de Kruskal-Wallis com comparações múltiplas de Dunn teste post hoc para dados não paramétricos) necessário. </li></ol>

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<li>Hamilton, T. J., Paz-Yepes, J., Morrison, R. A., Palenik, B., Tresguerres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+bloom-like+concentrations+of+two+marine+Synechococcus+cyanobacteria+%28strains+CC9311+and+CC9902%29+differentially+alters+fish+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exposure to bloom-like concentrations of two marine Synechococcus cyanobacteria (strains CC9311 and CC9902) differentially alters fish behaviour.</a> Conservation Physiology. 2 (1), (2014).</li>
</ol>

Os autores reconhecem Joshua Gallup para o uso de seu equipamento de fotografia utilizada para a Figura 1. Este trabalho foi apoiado por um Conselho de Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia (NSERC) Canadá Descoberta de subvenção (para TJH).

Estudos anteriores envolvendo a administração da droga no peixe-zebra simplesmente invocada compensação peixes para transportá-los a partir de seu tanque de casa para a solução de drogas 12,16. Rede nem sempre é consistente e frequentemente leva mais tempo do que o esperado, devido à resposta de fuga do peixe-zebra, que tem variabilidade individual significativa. Métodos de transferência tradicionais, embora úteis, pode ser melhorado através da diminuição da quantidade de tempo total dos peixes passar do lado...

O peixe-zebra (Danio rerio) é uma pequena espécie de teleósteos originárias da Índia que é um organismo modelo útil para um comportamental e médica 2,3 pesquisa. Peixe-zebra também são vulgarmente usado nos testes de várias substâncias farmacológicas, a fim de caracterizar o seu impacto sobre o comportamento. Vários dosagens e horários de administração de medicamentos têm sido utilizados para investigar o comportamento do peixe-zebra, após a administração de compostos tais como estimulantes 4, 5 e ansiolíticos etanol 6-8. Nosso laboratório tem investigado os efeitos de diferentes horários de administração de etanol sobre a ansiedade de peixe-zebra e locomoção no claro / escuro de ensaio bem validado 9, 20, também comumente referido como o ensaio scototaxic. Um novo método de administração de etanol foi desenvolvido para aumentar a eficiência de repetitivo, a administração diária ao longo de um longo período de tempo (21 dias) 6 </sacima&gt;. Métodos utilizados anteriormente eram práticos, no entanto, buscou-se desenvolver um método que reduz de compensação, com seus custos de tempo associados, e permitiu simultânea administração do fármaco de interesse para um grande número de peixes, precisamente cronometrado. Na pesquisa utilizando tradicional etanol, peixe-zebra são compensados ​​e transferido de um tanque para outro contendo a mistura apropriada de etanol e água 10-12. Enquanto este método é amplamente aceite, a compensação de peixe-zebra pode aumentar a variabilidade no tempo necessário para introduzir e remover o peixe a partir da solução da droga. Portanto, a exposição exacto para o composto de interesse pode variar durante o curso de uma experiência que envolve a administração repetida. Um método que reduz as fontes de decorrentes da variabilidade nos tempos de transporte de erro é, portanto, desejável. Com o nosso método, somos capazes de mover todos os peixes ao mesmo tempo, resultando em um tempo de dosagem idêntica em cada peixe. Após a exposição ao etanol (descrito aqui), peixe-zebra pode ser testado em qualquer númer de ensaios comportamentais, incluindo aqueles que avaliam a ansiedade. Dosagem grupos de peixes usando o novo método tem usos práticos além da capacidade de reproduzir com exatidão e padronizar a dosagem entre sujeitos e entre grupos de peixes. O advento de um novo software que permite o rastreamento de peixes múltiplos de uma só vez pode ver os pesquisadores utilizam nossos métodos para garantir a replicabilidade e precisão em seus experimentos. Considerando-se a utilização generalizada de peixe-zebra como um organismo modelo para neurociência comportamental, este método vai aumentar a eficiência e viabilidade em futuros estudos farmacológicos. No presente paradigma, um esquema de dosagem repetida foi empregado que aproximadamente espelha horários de consumo humano. Os peixes foram distribuídos aleatoriamente para um dos três grupos: controle, diária moderada, ou semanal-compulsivos. O esquema de administração foi de 21 dias de duração, escolheu porque excedeu significativamente os tempos de exposição em estudos anteriores 7. Peixes controle recebeu a zero alcohol, peixe diariamente moderada receberam 0,2% de álcool, uma vez por dia e, semanalmente, binge peixe recebeu 1,4% de álcool, uma vez por semana. A tarefa de luz / escuro foi usado para avaliar a ansiedade após 2 dias de abstinência. Este é um teste relativamente simples de administrar, que utiliza uma arena rectangular em que as paredes de um lado, são de cor branca e no outro lado são escuros 9. Peixe-zebra adulto robustamente preferem o lado negro da arena em condições de controle 6,9,13. O aumento da ansiedade é operacionalmente definido como significativamente mais tempo gasto na zona escura, e diminuiu a ansiedade pode ser assumida quando o peixe passa relativamente mais tempo gasto na zona de luz. Com o software de rastreamento de movimento, outras variáveis ​​informativos também podem ser quantificados, incluindo velocidade média, a imobilidade, serpenteando, e zona de transição 14. O método de dosagem desenvolvido no nosso laboratório pode aplicar-se a qualquer pesquisa em que os compostos solúveis em água são administrados a um ou mais zebrafish. Muitos outros agentes farmacológicos que podem beneficiar desta metodologia estão sendo testadas em peixes-zebra. Comumente os compostos testados incluem a nicotina, clordiazepóxido, buspirona, e escopolamina, que são dissolvidos de um modo semelhante ao etanol; misturando a quantidade apropriada do produto químico em água. Portanto, o escopo geral deste procedimento é muito mais ampla e não limitada ao etanol. Além disso, após a dosagem com medicamentos para vários dias, a tarefa de luz / escuro é apenas um dos muitos testes comportamentais que podem ser empregadas. Após a administração de drogas ou durante a abstinência, outros ensaios populares que podem ser utilizados incluem o teste de mergulho novo tanque de 15 e testes de comportamento social, tais como empolamento 16. O procedimento a seguir irá delinear um método eficiente de repetidamente transferir grupos de peixes ou peixes individuais em soluções que contêm um composto farmacológico de interesse. Além disso, o processo de teste de ansiedade com o teste de luz / escuroem grupos de peixe que se encontram em retirada depois de ser exposto a longas listas da administração do álcool irá ser descrito.

<table><tbody><tr><td>Sistema de bancada com três prateleiras</td><td><a href="http://aquatichabitats.com/research-systems/z-hab-system/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aquatic Habitats</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de desova de 1,5 L com difusor de 400 &amp;mu;m</td><td><a href="http://aquatichabitats.com/consumables/tanks-lids-and-baffles/info/nursery-tank-and-baffles/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aquatic Habitats</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Etanol de grão puro</td><td><a href="http://www.luxco.com/brands/vodka-neutral-spirits-neutral-spirits-everclear" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Luxco, INC</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Software de rastreamento de movimento Ethovision XT</td><td><a href="http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Noldus Information Technology</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td><a href="http://eshop.eppendorf.ca/categories/1" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Eppendorf Canada</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arena Clara/Escuro</td><td>Personalizado</td><td></td><td>Construir conforme a descrição do procedimento. 9,5 cm de largura, 9,5 cm de profundidade, 55 cm de comprimento.</td></tr></tbody></table>

um novo método de drug administration para multiple peixe zebra ( danio rerio) ea quantificação da retirada

A Novel Method of Drug Administration to Multiple Zebrafish (Danio rerio) and the Quantification of Withdrawal

O teste de ansiedade em peixe-zebra é frequentemente estudado em combinação com a aplicação de substâncias farmacológicas. Nesses estudos, os peixes são rotineiramente capturados e transportados entre aquários domésticos e tanques de dosagem. A fim de aumentar a facilidade de administração do composto, foi desenvolvido um novo método de transferência de peixes entre tanques para administração de medicamentos. Inserções projetadas para desova foram usadas para transferir grupos de peixes para a solução do medicamento, permitindo a dosagem precisa de todos os peixes do grupo. Isso aumenta a precisão e a eficiência da dosagem, o que se torna muito importante em longos esquemas de administração repetida de medicamentos. Implementamos esse procedimento para uso em um estudo que examinou o comportamento do peixe-zebra no teste claro/escuro após a administração de etanol com diferentes esquemas de 21 dias. Nos peixes expostos a quantidades moderadas diárias de álcool, houve uma diferença significativa na preferência de localização após 2 dias de abstinência quando comparado ao grupo controle. No entanto, não foi observada uma diferença significativa na preferência de localização em um grupo exposto à administração semanal de compulsão. 
Este protocolo pode ser generalizado para uso com todos os tipos de compostos solúveis em água e pode ser usado em qualquer situação em que o comportamento dos peixes durante ou após longos esquemas de administração de medicamentos esteja sendo examinado. O teste claro/escuro também é um método valioso de avaliar as mudanças induzidas pela abstinência na ansiedade.

Para manter a precisão e controlo em estudos farmacológicos com peixe-zebra é importante para o tempo de duração da administração de etanol de forma consistente e com precisão, tal como descrito acima. O nosso procedimento pode aumentar o rendimento e a facilidade do procedimento de dosagem. A administração de etanol no horário ou uma compulsão semanal ou diária moderada resultou em níveis de ansiedade alterados, medidos com o teste de claro / escuro, em comparação aos controles. Quando testados dois dias após a última ...

Um novo método para reduzir a variabilidade ao expor peixes a drogas é explicado. Verificou-se que os peixes expostos a vários padrões de exposição ao etanol apresentaram níveis alterados de ansiedade durante a abstinência em um ensaio escototáxico claro/escuro.

Um novo método de Drug Administration para Multiple peixe zebra ( Danio rerio) Ea quantificação da Retirada

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely ...

O objetivo geral deste procedimento é dosar grupos de peixes com precisão e eficiência com etanol para avaliar os efeitos de doses repetidas no comportamento de abstinência. Isso é feito primeiro dosando o peixe-zebra, usando um novo método que foi desenvolvido para permitir a exposição simultânea a medicamentos de grupos inteiros de peixes por períodos precisos de tempo. O segundo passo é continuar dosando o peixe em um cronograma que permita testar os efeitos específicos da retirada do etanol.Em seguida, durante a retirada, os peixes são testados individualmente em uma tarefa clara e escura usando um software de rastreamento de movimento para registrar o movimento. A etapa final é analisar os dados para investigar os efeitos da retirada de etanol no comportamento do peixe-zebra. Em última análise, a dosagem repetida de etanol usando o procedimento descrito resulta em um efeito transitório, mas acentuado, no comportamento do peixe-zebra após dois dias de retirada.A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a administração simultânea de medicamentos a grandes grupos de peixes e é ideal para estudos que envolvem exposição repetida a medicamentos, medicamentos ou toxinas por

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O vídeo descreve o ensaio de preferência claro-escuro para estudar o comportamento relacionado à ansiedade em peixe-zebra após a exposição ao etanol.

Teste de preferência claro-escuro: um método para estudar o comportamento relacionado à ansiedade em peixe-zebra

O peixe-zebra é um importante organismo modelo para o estudo da homeostase energética.  Ao utilizar um indicador redox sensível ao NADH2, alamar Blue, desenvolvemos um ensaio que mede a taxa metabólica de larvas de peixe-zebra em um formato de placa de 96 poços e pode ser aplicado à descoberta de medicamentos ou genes.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energia Despesas Assay

O objetivo do presente protocolo é medir o tempo de trânsito de fluorescente etiquetado alimento através do intestino de zebrafish larval de forma alto throughput.

Elevado-throughput medição de tempo de trânsito do intestino usando Zebrafish Larval

Este manuscrito descreve um método simples para medir o stress comportamentalmente no zebrafish adulto. A abordagem tira proveito da tendência inata que zebrafish preferem a metade inferior de um tanque quando em um estado estressante. Nós igualmente descrevemos métodos para acoplando o ensaio com farmacologia.

Abordagens comportamentais para estudar estresse inato em zebrafish

Embriões de zebrafish são utilizados para avaliar a toxicidade de compostos químicos. Desenvolvem-se externamente e são sensíveis aos produtos químicos, permitindo a deteção de mudanças fenotípicas sutis. O experimento requer apenas uma pequena quantidade de composto, que é diretamente adicionado à placa contendo embriões, tornando o sistema de teste eficiente e rentável.

Avaliação rápida da toxicidade de compostos químicos usando embriões de zebrafish

Modelos de xenoenxerto de zebrafish permitem a triagem de medicamentos de alto risco e imagens fluorescentes de células cancerígenas humanas em um microambiente in vivo. Desenvolvemos um fluxo de trabalho para a triagem de medicamentos automatizados em larga escala em amostras de leucemia derivada do paciente em zebrafish usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência automatizada.

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Aqui, apresentamos uma bateria de teste comportamental abrangente, incluindo o novo tanque, Shoaling e testes de preferência social, para determinar efetivamente os potenciais efeitos neurotóxicos de produtos químicos (por exemplo, metanfetamina e glifosato) em peixes-zebra adultos usando um único tanque. Este método é relevante para neurotoxicidade e pesquisa ambiental.

Avaliação da Neurotoxicidade em Danio rerio Adulto utilizando uma Bateria de Testes Comportamentais em um Único Tanque

Um novo método de injeção intraperitoneal (IP) em peixe-zebra adulto é descrito. Ao manusear compostos tóxicos como a doxorrubicina, esse procedimento é mais eficaz do que os dois métodos de IP relatados anteriormente. A técnica foi projetada para ser facilmente adotada por pesquisadores com experiência limitada no modelo de peixe-zebra.

Uma técnica de injeção intraperitoneal em peixe-zebra adulto que minimiza os danos corporais e a mortalidade associada

Este protocolo descreve um procedimento de triagem de drogas em larvas de peixe-zebra 3-7 dias após a fertilização, seguido de avaliação morfológica.

Triagem de pequenas moléculas e testes de toxicidade em larvas de peixe-zebra em estágio inicial

Este estudo apresenta um método de alimentação à base de gelatina que permite a administração oral precisa, não invasiva e baseada em massa corporal em peixes-zebra adultos. O protocolo demonstra aceitação confiável do feed e, como prova de princípio, entrega bem-sucedida do MK-801, o que resultou nos efeitos comportamentais esperados.

Uma abordagem simples e precisa baseada em ração para a administração oral de medicamentos em peixes

Aprenda um novo método de administração simultânea de etanol em grupos de peixe-zebra Danio rerio para estudar comportamentos de ansiedade durante a abstinência. Esta técnica reduz a variabilidade na exposição ao fármaco.

Um novo método de Drug Administration para Multiple peixe zebra ( Danio rerio) Ea quantificação da Retirada

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