Name: In Vitro Reconstituição de Complexos de Light-colheita de plantas e algas verdes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Aprenda a reconstituir complexos de coleta de luz in vitro usando pigmentos extraídos de folhas de espinafre e proteína APA expressa em E. coli. Este método permite obter alto rendimento de complexos pigmento-proteína para estudos espectroscópicos.

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Este trabalho foi apoiado pelo Conselho Europeu de Pesquisa, por uma bolsa inicial / consolidadora do ERC para RC e pela Fundação Holandesa para Pesquisa sobre a Matéria (FOM) por meio de um programa FOM (10TM01).

1. Total Pigment Extração de espinafre folhas <ol><li> Homogeneizar um punhado de folhas de espinafre (~ 20 g) em 100 ml de tampão de frio Moagem (ver Tabela 1), utilizando um misturador de 20 seg. </li><li> Filtrar a solução através de duas camadas de tecido de nylon com um diâmetro de poro de 20 ^ m e centrifuga-se o filtrado a 1500 x g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o pellet contendo os cloroplastos com um artistas moles paint brush em 1 ml de tampão de lavagem frio (ver Tabela 1). Uma vez que o sedimento é ressuspendido, adicionar 50 ml de tampão de lavagem e centrifugar a solução a 10000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender cuidadosamente o sedimento (tilacóides) em 50 ml de tampão de lavagem (ver Tabela 1). </li><li> Centrifuga-se a solução a 10000 xg durante 10 min a 4 ° C e remove-se o sobrenadante completamente. Neste ponto, realizar os seguintes passos no escuro, para evitar a oxidação do pigmento. </li&gt; <li> Adicionar ~ 20 ml de acetona a 80% tamponada com Na 2 CO 3 (ver Tabela 1) para extrair os pigmentos. Deixar a solução em gelo durante 10 min, vortex ocasional. </li><li> Sedimentar os componentes celulares por centrifugação a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. NOTA: Se os pigmentos não são totalmente extraído, o sedimento terá uma cor verde e passo 1.6 deve ser repetido. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante para um funil de separação. Adicionar 0,4 volumes de éter dietílico, agitar vigorosamente e abrir a válvula para ventilar o gás. </li><li> Adicionar 0,8 volumes de 0,33 M de NaCl e misturar vigorosamente. Permitir ~ 10 min para separar as duas camadas. A fase de éter no topo contém os pigmentos extraídos. Remover a fase inferior transparente. NOTA: Se a separação não é clara, congelar e descongelar a solução para melhorar a separação de fases. </li><li> Remover o éter vertendo-a da parte superior do funil de separação para um recipiente de vidro adequado. Seco, adicionando uma colher de gransulfato de sódio anidro ular. Agitar a solução e permitir a ~ 5 min para o dessecante para absorver a água a partir do éter. NOTA: Repita este passo se o sulfato de sódio aparece completamente aglutinados; deve haver alguns cristais de livre flutuação quando o éter é suficientemente seco. Se uma camada de água de formas, remover esta com uma pipeta de Pasteur, antes de se adicionar sulfato de sódio anidro adicional. </li><li> Decantar o éter a um novo recipiente de vidro, deixando o sulfato de sódio sólido para trás. </li><li> Evapora-se o éter num speedvac rotativo ou sob uma corrente de N 2. </li><li> Dissolve-se os pigmentos completamente em 10 ml de acetona a 100%. </li><li> Dilui-se uma pequena quantidade (~ 3 mL) em 1 ml de 80% de acetona e medir o espectro de absorção e determinar a / b clorofila e o rácio de concentração Chl com o método descrito por Porra et al. (1989) 15. </li><li> Alíquotas e secar os pigmentos em um speedvac rotativo ou sob N 2 córrego até a acetona éevaporado completamente. Armazenar os pigmentos se a -80 ° C. </li></ol> 2. extração de carotenóides Espinafre <ol><li> Siga os passos 1.1 a 1.5. Neste ponto, realizar os seguintes passos no escuro, para evitar a oxidação do pigmento. </li><li> Ressuspender o sedimento em tilacoide ~ 50 ml de etanol a 96% tamponado com Na 2 CO 3 (ver Tabela 1) para extrair os pigmentos. Deixar a solução em gelo durante 5 min. </li><li> Sedimentar os componentes celulares por centrifugação a 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. NOTA: Se os pigmentos não são totalmente extraído, o sedimento terá uma cor verde e passo 2.2 deve ser repetido. </li><li> Recolhe-se o sobrenadante e adiciona-se 0,1 volume de 80% KOH (w / v), para iniciar a saponificação. </li><li> Deixar a solução a 4 ° CO / N, bem tapado e protegida da luz. </li><li> Recolher a solução para um funil de separação. Adicionar 1 volume de éter dietílico e agitar suavemente. </li><li> Adicionar 0,8 volumes de 0,33 M NaCl e misture delicadamente. Permitir ~ 10 min para separar as duas camadas. A fase de éter de laranja em cima contém carotenóides saponificados. Remover a fase inferior verde por drenagem através da torneira de passagem do funil. </li><li> Adicionar 3 volumes de água e agitar suavemente para remover o hidróxido de potássio. Permitir que as camadas se separem. NOTA: Se a fase superior aspecto turvo, adicionar uma pequena quantidade de cloreto de sódio (por exemplo, 3 g de NaCl em 200 ml de solução) e agitar suavemente para dissolver. </li><li> Remover a fase inferior por drenagem através da torneira de passagem do funil. </li><li> Siga os passos de 1,10-1,13. </li><li> Dilui-se uma pequena quantidade (~ 3 mL) em 1 ml de 80% de acetona e medir o espectro de absorção a 440 nm de 80% de acetona. Para determinar a concentração de, utilizar o coeficiente médio de extinção para os carotenóides (ε 440 = 255) 16 na seguinte fórmula: carro [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (caminho óptico) = 1 cm. </li><li> Alíquotas e secar o carotenoids em um speedvac ou sob N 2 fluxo até que todos dietílico foi evaporado. Armazenar os pigmentos se a -80 ° C. </li></ol> 3. pigmento total e carotenóides Extração de Chlamydomonas reinhardtii <ol><li> Crescer C. reinhardtii em meio TAP sólido 17 em uma placa de Petri por espalhar uma pequena quantidade de líquido de cultura sobre a superfície. Crescer sob fluxo iluminação contínua de 20 mmol fotos PSA m -2 s -1 até uma camada verde de células é visível. </li><li> Utilizando uma ansa de inoculação estéril, colher uma pequena quantidade de C. reinhardtii, a partir do meio TAP sólido e colocou as células em 500 ml de meio de TAP 17, num balão de 1 L. Crescer a cultura a 25 ° C com 170 rpm de agitação sob um fluxo contínuo de iluminação 20 umol fotos PSA m -2 s -1. </li><li> Após 5-6 dias, a cultura deve chegar ao fim da fase logarítmica (6 x 10 6 células / mlou 2-2,5 densidade óptica a 750 nm). Centrifuga-se a cultura a 4.000 x g durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Para a extração de pigmento total, siga os passos 1,6-1,15. </li><li> O rendimento do extracto total de pigmento a partir de 500 mL de cultura de crescimento de C. completo reinhardtii é de cerca de 5 ml de solução com uma concentração de 0,5 mg chl a + b / ml. </li><li> Para a extração de carotenóides, siga os passos 2,2-2,12. </li></ol> 4. purificação de corpos de inclusão <ol><li> O clone da sequência de codificação da proteína de interesse LHC num vector de expressão que resulta em um C-terminal His fundidos usando procedimentos padrão de biologia molecular. Transformar este construto em E. estirpe hospedeira de E. coli, tal como BL21 (DE3). </li><li> Preparar tampão de lise, tampão detergente, tampão Triton, TE (Tabela 1), 1 M isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) e 18 de meio LB com os antibióticos apropriados. </li><li> Escolha um single E. colónia coli contendo o clone de expressão a partir de uma placa recentemente riscada em ~ 5 ml de meio LB com os antibióticos apropriados utilizando procedimentos padrão 6. Crescer a 37 ° C com 220 rpm de agitação durante pelo menos 16 horas. </li><li> Adicionar 2,5 ml de S / N de cultura num balão de Erlenmeyer de 1 L com 250 ml de LB suplementado com o antibiótico apropriado. </li><li> Crescer as células durante 2-3 horas (ou até que a OD 600 é ~ 0,6) a 37 ° C a 220 rpm. </li><li> Adicionar IPTG para uma concentração final de 1 mM. Continuar a crescer as células a 37 ° C com 220 rpm de 3-4 horas. </li><li> Centrifuga-se a cultura durante 10 min a 5000 xg, a 4 ° C em um tubo de centrífuga previamente pesado. Descartar o sobrenadante cuidadosamente e determinar o peso do sedimento de pesagem novo e subtraindo o peso do tubo de centrifugação. </li><li> Ressuspender o E. coli sedimento de células em 0,8 ml / g de tampão de lise por vórtice vigoroso. NOTA: Como alternativa, o sedimento de células podem ser congeladas a -80C para uso posterior. Se começando com um sedimento congelado, deixar descongelar completamente antes de adicionar o tampão de lise. </li><li> Adicionar 2 mg de lisozima por grama de células, e incuba-se em gelo molhado com vórtice ocasional durante 30 min. </li><li> Adiciona-se 20 ug / ml de DNAse, 10 mM de MgCl2, NaCl a 1 mM, 20 ug / ml de RNAse. Vortex e colocar em gelo durante 30 min. </li><li> Adicionar 2 ml de tampão frio de detergente por grama de células. Misturar bem e manter a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Transferência para tubos de centrífuga de 2 ml (dividida em dois tubos, se necessário). Centrifugar durante 10 minutos a 12.000 xg, a 4 ° C para sedimentar os corpos de inclusão. </li><li> Adicionar 1 ml de tampão frio Triton e voltar a suspender as pelotas por sons (3 pulsos x 5 seg poder x 50%, com intervalos de 20 segundos). NOTA: Tenha o tubo em um copo pequeno cercado por água gelada para manter a frio durante a sonorização. No caso de múltiplos tubos, combinar os corpos de inclusão novamente suspensas num tubo após a ressuspensão. </li><li> Centrifugar durante 10 minutos a 12.000xg, a 4 ° C para sedimentar os corpos de inclusão. </li><li> Repita o passo 4.13 e 4.14 duas vezes. </li><li> Ressuspender os corpos de inclusão em 1 ml de TE frio com sonificação para uma lavagem final para remover o tampão de Triton. Centrifugar durante 10 minutos a 12.000 xg, a 4 ° C para sedimentar os corpos de inclusão. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de frio TE por sonificação. </li><li> Avaliar a concentração de proteínas por meio de métodos padrão tais como o ensaio de Bradford 19. Armazenar alíquotas dos corpos de inclusão a -20 ° C. </li></ol> 5. Reconstituição Este protocolo resulta tipicamente 1-2 ml de proteína reconstituída com uma DO de 4, quando a absorvância é medida na região do Qy (600-750 nm). Quantidade pode ser ajustado como desejado, embora cuidados devem ser tomados para manter as proporções adequadas durante o procedimento. <ol><li> Prepare as seguintes soluções, conforme descrito na Tabela 1: 2x Reconstituição buffer, 20% OG, 2 M de KCl, TE. Execute o seguinte sPET na penumbra. </li><li> Ressuspender 800 ug de Corpos de Inclusão LHC em um total de 400 ul de TE, em um tubo de microcentrifugação de 2 ml. Adicionar 400 mL da 2x Tampão de Reconstituição e vortex brevemente. </li><li> Adicionar 0,6 mL de β-mercaptoetanol (estoque de 14,8 M) para ter uma concentração final de 10 mM. Aquece-se a proteína por 1 min a 98 ° C. Vortex e brevemente lugar à temperatura ambiente durante 3 min. </li><li> Ressuspender 500 mg do total de pigmentos de clorofila secas mais 80 mg pigmentos carotenóides em 30 mL 100% EtOH por vórtex vigorosamente durante 1 minuto ou coloque em um banho de ultra-sons para 1-2 min. </li><li> Girar a mistura de pigmento ~ 30 seg a 15800 xg, a 4 ° C e confirmar que não há nenhum sedimento. Se houver um sedimento, repetir vórtex e / ou sonificação. Importante: Após a ressuspensão e centrifugação, adicionar imediatamente pigmento para a proteína, ou pode agregar e terá de ser novamente suspensas novamente. </li><li> Lentamente adicione a mistura de pigmentos para a proteína, enquanto arrefecida vórtex. Continue a vortex 5-10 sCE e coloque o tubo no gelo molhado. Tenha cuidado para não vortex com muita força, como a proteína pode transbordar o topo do tubo. </li><li> Adicionar 94 ul de 20% de octilo β-D-glucopiranósido (OG) (concentração final 2%), vortex brevemente e manter em gelo 10 min. </li><li> Adicionar 90 mL de KCl 2 M (concentração final de 150-200 mM), vortex brevemente e manter em gelo 20 min. NOTA: preparação da coluna (Secção 6) pode ser iniciado nesta altura. </li><li> Rotação durante 10 minutos a 15.800 xg, a 4 ° C. Retirar o sobrenadante sem perturbar o pelete (precipitado LDS) para um tubo de 10 ml. Manter frio e protegida da luz. </li></ol> 6. níquel Coluna Purificação <ol><li> Preparar as seguintes soluções, tal como descrito na Tabela 1: tampão de OG, tampão de lavagem de OG, tampão de eluição. </li><li> Conectar uma coluna de Ni-Sepharose (1 ml), ou equivalente a uma bomba peristáltica, assegurando que nenhum ar fica dentro da coluna durante este passo e os seguintes passos. </li><li> Defina a velocidade de tele bombear a 1 ml / min e lavar a coluna com 5-10 ml de água para remover a solução de armazenamento. </li><li> Equilibrar a coluna com 3-4 ml de tampão de OG. </li><li> Adicionar 3-4 ml de tampão de OG para a amostra de proteína e carga para a coluna. NOTA: se a proteína foi sentado no gelo por mais de 10 minutos após a remoção da LDS, girar novamente a 15.800 xg a 4 ° C durante 1 min para remover qualquer precipitação LDS adicional. </li><li> Lavar a coluna com 5 ml de tampão de OG. </li><li> Lavar a coluna com 2 ml de tampão de lavagem com OG. </li><li> Eluir a proteína ligada com tampão de eluição de 3 ml. Recolhe-se o eluato verde que contém a proteína reconstituída. NOTA: Este é geralmente de cerca de 1 ml no total. </li></ol> 7 Sacarose Centrifugação Gradiente <ol><li> Preparar as seguintes soluções, tal como descrito na Tabela 1: solução de sacarose, 0,06% β-MS, HEPES 0,01 M, pH 7,6. </li><li> Preencha tubos de ultracentrífuga com a solução de sacarose e congelamento a -20 ° CO / N or -80 ° C durante pelo menos 1 hr. </li><li> Remover o tubo do congelador e deixar descongelar imperturbado a 4 ° C. NOTA: O processo de congelação / descongelação cria um gradiente de 0,1 a 1 M de sacarose. Um tubo de 15 ml, tipicamente cerca de degelo em 3 h. </li><li> Cuidadosamente remover a partir do topo do mesmo volume que a fracção verde eluída a partir da coluna de Sepharose de níquel no passo 6.8. Em seguida, coloque a amostra reconstituída em cima lentamente para evitar a perturbação do gradiente. </li><li> Tubos de equilíbrio e rotação em 200.000 xg a 4 ° C em uma ultracentrífuga usando um SW-41 ou SW-60 rotor basculante para 18 horas, a abrandar aceleração e parada, sem freios. </li><li> Retire cuidadosamente o gradiente do suporte do tubo com uma pinça. Usando uma seringa com uma agulha longa que tem uma abertura romba para recolher a fracção do topo. NOTA: Como alternativa, recolher fracções da parte inferior do tubo de perfuração com uma agulha e recolher gotas. </li></ol>

Os autores declaram não haver conflito de interesses

As proteínas da membrana não são tão fáceis de estudar. O isolamento de proteínas de membrana nativa é complicado pela necessidade de solubilizar a bicamada lipídica com detergentes, o que pode danificar a proteína e remover cofactores essenciais. Estas proteínas também pode estar presente em níveis baixos em membranas biológicas, ou ser misturado com as proteínas intimamente relacionadas, como no caso dos complexos de colheita de luz, que faz com que a purificação dos complexos individuais difíceis. Expressão de proteínas heterólogas em E. coli e na reconstituição in vitro oferece a possibilidade de evitar estes problemas. in vitro reconstituição e purificação de proteínas dobradas resultados em complexos que possuem características muito semelhantes às dos complexos nativos 20,21,23 e, portanto, pode ser usado para estudar os complexos que não podem ser purificados até à homogeneidade 24 - 27. Este método utiliza o espinafre, a qual é facilmente attainable durante todo o ano, como uma fonte para o pigmento e carotenóides totais preparativos. Para algumas reconstituições de proteínas nativas em algas, a utilização de pigmentos purificados a partir de algas é preferido devido a diferentes composições de pigmento. O a / b razão Chl e relação / carro Chl permanece a mesma, independentemente da fonte de pigmento. É importante perceber que a eficiência da reconstituição é geralmente cerca de 35% 28. Assim, é necessário remover os pigmentos não-ligados e a apoproteína desdobrado a partir da solução depois da reconstituição. Um protocolo de purificação de dois passos é apresentado neste protocolo (ver também os resultados). No entanto, deve notar-se que o passo do gradiente de sacarose não permite a separação completa de apo e holo-proteína. Para a maioria das análises isto não é um problema, a apoproteína, como não contêm pigmentos e, portanto, não interferem com as medições funcionais. No entanto, no caso de ser necessário remover completamente a apoproteína do fração contendo o complexo reconstituído (por exemplo, para calcular o pigmento a estequiometria de proteína), uma coluna de permuta aniónica podem ser utilizados (ver Passarini et al. 2009 29 para detalhes). A capacidade para redobrar proteínas recombinantes de colheita de luz, com pigmentos isoladas in vitro, oferece a oportunidade de &quot;manipular&quot; os complexos modificando a reconstituição &quot;ambiente&quot; de vários modos, alterando assim as características do complexo resultante. Por exemplo, alterando a composição do pigmento durante a reconstituição pode resultar em um complexo com a composição de pigmento alterada. Esta característica pode ser utilizada para estudar a influência vários pigmentos têm sobre a estrutura e a estabilidade do complexo. Normalmente, a preparação do pigmento obtido de espinafre tem um a / b clorofila proporção de 3: 1 e uma proporção / chl carro de 2,9: 1. Este rácio tipicamente produz uma proteína reconstituída com as mesmas propriedades que o nAtive um. No entanto, o ajuste de um a / b clorofila proporção pela adição de uma purificado Chl ou b podem influenciar a ligação de diferentes pigmentos, devido à variação de selectividade dos locais de ligação de 30-33. Isto é possível porque a maior parte dos locais de ligação de pigmentos não são completamente selectivas para clorofila a ou clorofila b, mas pode acomodar ambos, embora com diferente afinidade 10,30,34. De um modo semelhante, os locais de ligação de carotenóides, também foram exibidas para ser capaz de acomodar mais do que uma espécie de xantofila 8,35 - 38. Diferentes reconstituições de CP26, outro complexo pigmento-proteína de plantas superiores, usando várias composições de pigmento estão apresentados na Tabela 2 39. Estas reconstituições foram usadas para avaliar a afinidade dos sítios de ligação específicos de pigmentos 39. É interessante notar que a fim de obter um complexo com o mesmo pigmento composição como uma nativa, a clorofila a relação a / b da mistura de pigmentos deve ser de 3: 1. Este parece ser o caso para todos os complexos do LHC de plantas superiores 20,40. A combinação de biologia molecular, com a técnica de reconstituição permite que as propriedades de um complexo de ligação a clorofila a ser estudado em mais detalhe. A importância dos diferentes domínios de proteínas na estabilidade e dobramento dos complexos, ou o seu envolvimento nas interações proteína-proteína, foram determinados por truncar a apoproteína ou realizar mutagênese aleatória 8,41 - 44. Resíduos de aminoácidos standard importantes para a coordenação das diferentes pigmentos pode ser alterado através de mutagénese dirigida ao local, de modo a analisar as propriedades de pigmentos individuais ou avaliar a sua contribuição para a função e estabilidade do complexo de 10,28,29,45 - 52. Figura 6 mostra reconstituído Lhcb4 (CP29) comuma mutação da histidina na posição 216 53. Uma comparação da composição de pigmento de tipo selvagem e mutantes de complexos indica que a mutação induz a perda de uma molécula de clorofila a, indicando que o sítio alvo acomoda um um Chl no complexo WT. As diferenças do espectro de absorção de WT e mutantes, mediante a normalização para o teor de pigmentos, também mostra as propriedades de absorção do pigmento perdido. Neste caso, a diferença pode ser visto no pico principal a 680 nm, o que indica que a clorofila a coordenada por His216 absorve a este comprimento de onda (para mais detalhes sobre este mutante e as propriedades espectroscópicas ver Mozzo et al. 2,008 53). Análise de mutação também pode ser utilizado para determinar o efeito do ambiente nas propriedades espectroscópicas dos pigmentos 54. Em conclusão, as proteínas de colheita de luz pode facilmente ser reconstituída in vitro, resultando em pigmento-protein complexos com propriedades muito semelhantes aos complexos nativos. Deste modo, as dificuldades de isolamento de proteínas nativas são eliminados, ao mesmo tempo, proporcionando a preparação de proteínas com elevado rendimento e grau de pureza para mais estudos. A importância de uma proporção 3: a / b clorofila 1 na produção de um complexo autêntico é enfatizado, e exemplos de tipo selvagem reconstituído e CLS mutantes são fornecidos para ilustrar as aplicações da técnica.

O aparato fotossintético das plantas e algas incluem proteínas integrais de membrana que se ligam clorofila a (chl a), b (chl b) e carotenóides (carro). Estes complexos proteína-pigmento são ativos na captação de energia luz e transferir essa energia de excitação para os centros de reação, onde é usado para promover a separação de carga 2. Eles também estão envolvidos em mecanismos de feedback reguladoras que protegem o aparato fotossintético contra danos luz alta 3,4. Os complexos de colheita de luz (CLS) são constituídos por uma grande família de proteínas relacionadas de plantas e algas 5. A purificação homogênea de cada membro da família tem sido complicada pelas propriedades químicas e físicas muito semelhantes dos complexos. Além disso, os procedimentos de purificação, muitas vezes resultam em perda de pigmentos ou de outros co-factores potenciais, tais como lípidos. In vitro represen reconstituiçãots um poderoso método para ultrapassar estes problemas. O LHC associada com fotossistema II (LHC-II) foi reconstituído primeiro in vitro por Plumley e Schmidt em 1987 1. Os investigadores proteína extraída delipidado e pigmentos separadamente a partir de cloroplastos de plantas e, em seguida, combinada a proteína desnaturada com calor pigmentos na presença de lítio dodecilsulfato (LDS), seguido por três ciclos de congelamento e descongelamento 1. Eles demonstraram que as propriedades espectrais dos complexos reconstituídos LHC foram muito semelhantes para os complexos purificados a partir de plantas. A facilidade de reconstituição de complexos proteína-pigmento LHC, provavelmente devido a alguma característica de auto-montagem inerente, juntamente com a dificuldade de isolar complexos purificados a partir de organismos, levou à rápida adoção do método por outros pesquisadores. A reconstituição de proteínas fotossintéticas expresso em Escherichia coli (E. coli) foi obtida por Paulsen e colegas em 1990 6. Em E.coli, as proteínas da membrana sobreexpressos são normalmente contidos em corpos de inclusão, que as respectivas instalações de purificação. A reconstituição é conseguido através de desnaturação térmica dos corpos de inclusão contendo a proteína recombinante na presença de LDS, seguido pela adição de pigmentos, que inicia o enrolamento de proteínas. Dobragem do complexo LHCII é um processo de dois passos: primeiro, a clorofila é ligado em menos de 1 min; segundo, a clorofila b é obrigado e estabilizado ao longo de vários minutos 7. Além de proporcionar uma visão da dinâmica de dobragem, na reconstituição in vitro combinada com mutagénese dirigida para o local permitiu a identificação de aminoácidos específicos importantes para a estabilidade (por exemplo, 8,9) ou a coordenação de pigmento (por exemplo, 10). Manipulação de redobramento condições de ajustar os parâmetros tais como a composição pigmento ou detergentes também identificaram elementos critical para a dobragem adequada, tais como a exigência de Xantofilas para o complexo LHCII (por exemplo, 1,11). Além disso, a investigação das propriedades de pigmentos individuais ligados aos complexos foi possível utilizando complexos reconstituídos in vivo (por exemplo, 10). O método descrito aqui começa com o isolamento de pigmentos (clorofilas e carotenóides) a partir de espinafres e a alga verde Chlamydomonas reinhardtii. A expressão e purificação de uma proteína a partir de E. LHC coli na forma de corpos de inclusão é então descrito, seguindo-se a reconstituição de LHC e subsequente purificação por coluna de afinidade com Ni. No último passo, os complexos reconstituídos são ainda purificado por centrifugação em gradiente de sacarose para remover pigmentos livres e apoproteína desdobrado. Este protocolo representa um procedimento otimizado incorporando várias modificações que foram introduzidas por diferentes laboratórios maistempo 1,6,10,12 -14.

<table><tbody><tr><td>HisTrap HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Tecido de nylon&nbsp;</td><td></td><td></td><td>20 &mu; m poros</td></tr><tr><td>Pincel de pintura de artistas suaves&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Beta-DM</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0525</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAase</td><td>ThermoScientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octyl &beta;- D-glucopiranosídeo</td><td>Sigma</td><td>O8001</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga XL</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TAP média</td><td></td><td></td><td>ver referência 17</td></tr><tr><td>LB média</td><td></td><td></td><td>ver referência 19</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstituição de complexos de light-colheita de plantas e algas verdes

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

Nas plantas e algas verdes, a luz é capturado pelos complexos absorvedores da luz (CLS), uma família de proteínas de membrana integrais que coordenam clorofilas e carotenóides. In vivo, estas proteínas são dobradas com pigmentos para formar complexos que são inseridas na membrana de tilacoide do cloroplasto. A alta similaridade nas propriedades químicas e físicas dos membros da família, junto com o fato de que eles podem facilmente perder pigmentos durante o isolamento, faz sua purificação em estado nativo desafiador. Uma abordagem alternativa para a obtenção de preparações homogéneas de CLS foi desenvolvido por Plumley e Schmidt em 1987 1, que demonstraram que era possível reconstituir estes complexos in vitro, a partir de pigmentos de apoproteínas purificadas e desdobradas, resultando em complexos com propriedades muito semelhantes às do nativa complexos. Isto abriu o caminho para a utilização de proteínas recombinantes expressas bacterianas in vitro </em&gt; reconstituição. O método de reconstituição é poderosa por várias razões: (1) preparações de complexos puros individuais podem ser obtidos, (2) a composição de pigmento pode ser controlado para avaliar a sua contribuição para a estrutura e função, (3) as proteínas recombinantes podem ser mutados para estudar o funcional papel dos resíduos individuais (por exemplo, locais de ligação de pigmento) ou domínio da proteína (por exemplo, a interacção proteína-proteína, dobragem). Este método foi optimizado em vários laboratórios e aplicada à maior parte dos complexos de luz-colheita. O protocolo descrito aqui detalha o método de reconstituição de complexos de luz-colheita in vitro atualmente utilizados em nosso laboratório, e exemplos que descrevem aplicações do método são fornecidos.

Este protocolo detalha a reconstituição de complexos coletores de luz in vitro. Essas proteínas integrais da membrana coordenam clorofilas e carotenóides e são responsáveis pela coleta de luz em plantas superiores e algas verdes.

In Vitro Reconstituição de Complexos de Light-colheita de plantas e algas verdes

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

O objetivo geral do experimento a seguir é reconstituir in vitro complexos de proteínas de pigmento coletores de luz de plantas ou algas. Isso é conseguido extraindo os pigmentos de folhas de espinafre ou culturas de algas e expressando em excesso o prote APA em e coli. Como segunda etapa, o prote APA é misturado com os pigmentos para obter um complexo reconstituído.Em seguida, o complexo de proteína de pigmento reconstituído é purificado a partir do excesso de pigmentos e são obtidos os resultados de proteína desdobrados que mostram características espectroscópicas semelhantes do complexo de proteína de pigmento reconstituído e do nativo com base em espectros de absorção, espectros fluorescentes e deísmo circular. A principal vantagem deste procedimento é que ele nos permite obter uma quantidade relativamente alta de complexos de proteínas de pigmento, e também manipular os complexos usando misturas de proteínas e pigmentos do tipo mutante com diferentes composições demonstrando o procedimento será Alberto na, um estudante de pós-graduação no laboratório Para iniciar o procedimento de extração de pigmento total das folhas de espinafre. Use um liquidificador para homogeneizar um punhado de espinafre, deixa aproximadamente 20 gramas em 100 mililitros de buffer de moagem a frio por 20 segundos.Filtrar a solução através de duas camadas de tecido de nylon com um diâmetro fraco de 20 micrómetros e centrifugar o filtrado a 1 500 Gs durante 10 minutos. A quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e adicione um mililitro de tampão de lavagem a frio.Ressuspenda o pellet contendo os cloroplastos com um pincel macio de artista. Assim que o pellet for ressuspenso, adicione 50 mililitros de lavagem, tampão e centrifugue, uma solução a 10.000 Gs por 10 minutos. A quatro graus Celsius, remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet em 50 mililitros de centrífuga tampão de lavagem, uma solução a 10.000 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante completamente a partir deste ponto.Este procedimento deve ser realizado no escuro. Para evitar a oxidação do pigmento, adicione aproximadamente 20 mililitros de acetona a 80% tamponada com carbonato de sódio para extrair os pigmentos, deixe a solução no gelo por 10 minutos. O vórtice ocasionalmente modela os componentes celulares por centrifugação a 12.000 Gs por 15 minutos a quatro graus Celsius.A extração total do pigmento deve resultar em uma pelota branca. Colete o snat em um funil separador. Adicione 0,4 volumes de éter datil.Agite vigorosamente e certifique-se de abrir as válvulas para ventilar o gás. Adicione 0,8 volumes de cloreto de sódio molar ponto 33 e misture vigorosamente. Aguarde aproximadamente 10 minutos para que as camadas se separem.A fase etérea no topo contém os pigmentos extraídos. Remova e descarte a fase inferior clara. Retirar o éter deitando-o do topo da ampola de separação para um recipiente de vidro adequado.Seque o éter adicionando uma colher de sulfato de sódio anidro granular. Agite a solução e aguarde cerca de cinco minutos para que o exsicante absorva a água do éter. Quando o éter estiver suficientemente seco.Deve haver alguns cristais flutuantes e nenhuma aglomeração do sulfato de sódio. Transvase o éter para um novo recipiente de vidro, deixando o sulfato de sódio sólido para trás alíquota dos pigmentos e seque-os em um aspirador rotativo até que a acetona esteja completamente evaporada. Armazene os pigmentos secos a 80 graus Celsius negativos.A extração de queratinóide do espinafre não é mostrada neste vídeo, mas os pigmentos secos também são armazenados a 80 graus Celsius negativos. O complexo coletor de luz ou LHC para reconstituição foi expresso e purificado de e coli na forma de corpos de inclusão. Para o sucesso da reconstituição, a proporção entre as proteínas pigmentares e a quantidade de uso do tampão é crucial.Este procedimento deve ser realizado com pouca luz. Ressuspender 800 microgramas de corpos de inclusão do LHC em um total de 400 microlitros de te. Em um tubo de fuga de dois mililitros, adicione 400 microlitros de dois x reconstituição, tampão e vórtice.Adicione brevemente 0,6 microlitros de um estoque de etanol CAPTA beta mar de 14,8 molares. Para obter uma concentração final de 10 milimolares, aqueça a proteína a 98 graus Celsius por um minuto. Vortex brevemente e coloque em temperatura ambiente por três minutos.Ressuspenda 500 microgramas de pigmentos de clorofila secos totais, mais 80 microgramas de pigmentos queratinóides em 30 microlitros de etanol a 100% por vórtice vigoroso. Por um minuto. Gire a mistura de pigmentos a 15.800 Gs a quatro graus Celsius por cerca de 30 segundos e confirme que não há pellet imediatamente após a centrifugação, adicione a mistura de pigmentos lentamente à proteína resfriada durante o vórtice.Tenha cuidado para não fazer vórtices muito vigorosos, pois a proteína pode transbordar da parte superior do tubo. Continue a vórtice por cinco a 10 segundos e, em seguida, coloque o tubo no gelo úmido. Adicione 94 microlitros de 20% octal, glicocida beta D ou og para obter uma concentração final de 2% Vortex brevemente e mantenha no gelo por 10 minutos, adicione 90 microlitros de cloreto de potássio de dois molares para obter uma concentração final de 150 a 200 micro molares.Vortex brevemente e mantenha no gelo por 20 minutos. Gire a 15.800 GS a quatro graus Celsius por 10 minutos. Transferir o SUP para um tubo de 10 mililitros sem perturbar o sedimento.Mantenha o natin frio e protegido da luz. Comece este procedimento preparando uma coluna SROs de níquel de um mililitro, conforme descrito no texto do protocolo. Adicione três a quatro mililitros de tampão OG à amostra de proteína e carregue a amostra na coluna.Enxágue a coluna com cinco mililitros de tampão OG, seguido por dois mililitros de tampão de enxágue OG. Eluir a proteína ligada com três mililitros de tampão elu. Colete o ellu verde que contém a proteína reconstituída.O gradiente de sacarose é preparado conforme descrito no texto do protocolo cuidadosamente removido do topo do gradiente, o mesmo volume da fração verde aludida na coluna SROs de níquel. Carregue lentamente a amostra reconstituída por cima, tomando cuidado para não perturbar o gradiente. Coloque o tubo e uma balança em um rotor de caçamba oscilante S SW 41 ou SW 60 e gire em uma ultracentrífuga a 200.000 Gs a quatro graus Celsius por 18 horas com aceleração lenta e parando sem pausas.Quando a ultracentrífuga estiver concluída, use uma pinça para retirar cuidadosamente o gradiente do suporte do tubo. A faixa verde é uma fração a ser coletada. O espectro de absorção de CP 24.Uma proteína de ligação à clorofila AB reconstituída in vitro é comparada com o espectro do complexo nativo. Os espectros idênticos indicam uma composição e organização de pigmentos virtualmente idênticas. A qualidade do complexo reconstituído também pode ser avaliada por espectroscopia de fluorescência.Como os pigmentos emitem fluorescência após excitação em diferentes comprimentos de onda, clorofila A a 440 nanômetros, clorofila B a 475 nanômetros e zils a 500 nanômetros. Os espectros de emissões de fluorescência de um complexo de tipo selvagem CP 24 reconstituído e normalizado ao máximo mostram transferência de energia eficiente da clorofila B e preenchimentos XANTHE para clorofila A. A presença de clorofila B não coordenada com a proteína pode ser reconhecida por um ombro adicional em torno de 650 nanômetros. A presença de clorofila A livre, em vez disso, leva a emissões adicionais em torno de 675 nanômetros.Os espectros de emissão fluorescente a 475 nanômetros dos complexos CP 24 reconstituídos e nativos mostram um único pico a 681 nanômetros, indicando que o complexo reconstituído está dobrado corretamente. O CP 24 reconstituído e o complexo nativo também mostram espectros de carisma circular muito semelhantes. Resíduos de aminoácidos individuais importantes para a coordenação de diferentes pigmentos podem ser alterados para analisar as propriedades de pigmentos individuais ou avaliar sua contribuição para a função e estabilidade do complexo.Aqui são mostrados os espectros de absorção de um tipo selvagem e CP 29 mutado. A linha verde mostra as diferenças entre os dois gráficos Quando tate, esta técnica incluindo o gradiente SUSE, a ultracentrifugação pode ser feita em 24 horas se for realizada corretamente.

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Biology

Biologia

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