In Vitro Reconstituição de Complexos de Light-colheita de plantas e algas verdes

O objetivo geral do experimento a seguir é reconstituir in vitro complexos de proteínas de pigmento coletores de luz de plantas ou algas. Isso é conseguido extraindo os pigmentos de folhas de espinafre ou culturas de algas e expressando em excesso o prote APA em e coli. Como segunda etapa, o prote APA é misturado com os pigmentos para obter um complexo reconstituído.

Em seguida, o complexo de proteína de pigmento reconstituído é purificado a partir do excesso de pigmentos e são obtidos os resultados de proteína desdobrados que mostram características espectroscópicas semelhantes do complexo de proteína de pigmento reconstituído e do nativo com base em espectros de absorção, espectros fluorescentes e deísmo circular. A principal vantagem deste procedimento é que ele nos permite obter uma quantidade relativamente alta de complexos de proteínas de pigmento, e também manipular os complexos usando misturas de proteínas e pigmentos do tipo mutante com diferentes composições demonstrando o procedimento será Alberto na, um estudante de pós-graduação no laboratório Para iniciar o procedimento de extração de pigmento total das folhas de espinafre. Use um liquidificador para homogeneizar um punhado de espinafre, deixa aproximadamente 20 gramas em 100 mililitros de buffer de moagem a frio por 20 segundos.

Filtrar a solução através de duas camadas de tecido de nylon com um diâmetro fraco de 20 micrómetros e centrifugar o filtrado a 1 500 Gs durante 10 minutos. A quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e adicione um mililitro de tampão de lavagem a frio.

Ressuspenda o pellet contendo os cloroplastos com um pincel macio de artista. Assim que o pellet for ressuspenso, adicione 50 mililitros de lavagem, tampão e centrifugue, uma solução a 10.000 Gs por 10 minutos. A quatro graus Celsius, remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente o pellet em 50 mililitros de centrífuga tampão de lavagem, uma solução a 10.000 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante completamente a partir deste ponto.

Este procedimento deve ser realizado no escuro. Para evitar a oxidação do pigmento, adicione aproximadamente 20 mililitros de acetona a 80% tamponada com carbonato de sódio para extrair os pigmentos, deixe a solução no gelo por 10 minutos. O vórtice ocasionalmente modela os componentes celulares por centrifugação a 12.000 Gs por 15 minutos a quatro graus Celsius.

A extração total do pigmento deve resultar em uma pelota branca. Colete o snat em um funil separador. Adicione 0,4 volumes de éter datil.

Agite vigorosamente e certifique-se de abrir as válvulas para ventilar o gás. Adicione 0,8 volumes de cloreto de sódio molar ponto 33 e misture vigorosamente. Aguarde aproximadamente 10 minutos para que as camadas se separem.

A fase etérea no topo contém os pigmentos extraídos. Remova e descarte a fase inferior clara. Retirar o éter deitando-o do topo da ampola de separação para um recipiente de vidro adequado.

Seque o éter adicionando uma colher de sulfato de sódio anidro granular. Agite a solução e aguarde cerca de cinco minutos para que o exsicante absorva a água do éter. Quando o éter estiver suficientemente seco.

Deve haver alguns cristais flutuantes e nenhuma aglomeração do sulfato de sódio. Transvase o éter para um novo recipiente de vidro, deixando o sulfato de sódio sólido para trás alíquota dos pigmentos e seque-os em um aspirador rotativo até que a acetona esteja completamente evaporada. Armazene os pigmentos secos a 80 graus Celsius negativos.

A extração de queratinóide do espinafre não é mostrada neste vídeo, mas os pigmentos secos também são armazenados a 80 graus Celsius negativos. O complexo coletor de luz ou LHC para reconstituição foi expresso e purificado de e coli na forma de corpos de inclusão. Para o sucesso da reconstituição, a proporção entre as proteínas pigmentares e a quantidade de uso do tampão é crucial.

Este procedimento deve ser realizado com pouca luz. Ressuspender 800 microgramas de corpos de inclusão do LHC em um total de 400 microlitros de te. Em um tubo de fuga de dois mililitros, adicione 400 microlitros de dois x reconstituição, tampão e vórtice.

Adicione brevemente 0,6 microlitros de um estoque de etanol CAPTA beta mar de 14,8 molares. Para obter uma concentração final de 10 milimolares, aqueça a proteína a 98 graus Celsius por um minuto. Vortex brevemente e coloque em temperatura ambiente por três minutos.

Ressuspenda 500 microgramas de pigmentos de clorofila secos totais, mais 80 microgramas de pigmentos queratinóides em 30 microlitros de etanol a 100% por vórtice vigoroso. Por um minuto. Gire a mistura de pigmentos a 15.800 Gs a quatro graus Celsius por cerca de 30 segundos e confirme que não há pellet imediatamente após a centrifugação, adicione a mistura de pigmentos lentamente à proteína resfriada durante o vórtice.

Tenha cuidado para não fazer vórtices muito vigorosos, pois a proteína pode transbordar da parte superior do tubo. Continue a vórtice por cinco a 10 segundos e, em seguida, coloque o tubo no gelo úmido. Adicione 94 microlitros de 20% octal, glicocida beta D ou og para obter uma concentração final de 2% Vortex brevemente e mantenha no gelo por 10 minutos, adicione 90 microlitros de cloreto de potássio de dois molares para obter uma concentração final de 150 a 200 micro molares.

Vortex brevemente e mantenha no gelo por 20 minutos. Gire a 15.800 GS a quatro graus Celsius por 10 minutos. Transferir o SUP para um tubo de 10 mililitros sem perturbar o sedimento.

Mantenha o natin frio e protegido da luz. Comece este procedimento preparando uma coluna SROs de níquel de um mililitro, conforme descrito no texto do protocolo. Adicione três a quatro mililitros de tampão OG à amostra de proteína e carregue a amostra na coluna.

Enxágue a coluna com cinco mililitros de tampão OG, seguido por dois mililitros de tampão de enxágue OG. Eluir a proteína ligada com três mililitros de tampão elu. Colete o ellu verde que contém a proteína reconstituída.

O gradiente de sacarose é preparado conforme descrito no texto do protocolo cuidadosamente removido do topo do gradiente, o mesmo volume da fração verde aludida na coluna SROs de níquel. Carregue lentamente a amostra reconstituída por cima, tomando cuidado para não perturbar o gradiente. Coloque o tubo e uma balança em um rotor de caçamba oscilante S SW 41 ou SW 60 e gire em uma ultracentrífuga a 200.000 Gs a quatro graus Celsius por 18 horas com aceleração lenta e parando sem pausas.

Quando a ultracentrífuga estiver concluída, use uma pinça para retirar cuidadosamente o gradiente do suporte do tubo. A faixa verde é uma fração a ser coletada. O espectro de absorção de CP 24.

Uma proteína de ligação à clorofila AB reconstituída in vitro é comparada com o espectro do complexo nativo. Os espectros idênticos indicam uma composição e organização de pigmentos virtualmente idênticas. A qualidade do complexo reconstituído também pode ser avaliada por espectroscopia de fluorescência.

Como os pigmentos emitem fluorescência após excitação em diferentes comprimentos de onda, clorofila A a 440 nanômetros, clorofila B a 475 nanômetros e zils a 500 nanômetros. Os espectros de emissões de fluorescência de um complexo de tipo selvagem CP 24 reconstituído e normalizado ao máximo mostram transferência de energia eficiente da clorofila B e preenchimentos XANTHE para clorofila A. A presença de clorofila B não coordenada com a proteína pode ser reconhecida por um ombro adicional em torno de 650 nanômetros. A presença de clorofila A livre, em vez disso, leva a emissões adicionais em torno de 675 nanômetros.

Os espectros de emissão fluorescente a 475 nanômetros dos complexos CP 24 reconstituídos e nativos mostram um único pico a 681 nanômetros, indicando que o complexo reconstituído está dobrado corretamente. O CP 24 reconstituído e o complexo nativo também mostram espectros de carisma circular muito semelhantes. Resíduos de aminoácidos individuais importantes para a coordenação de diferentes pigmentos podem ser alterados para analisar as propriedades de pigmentos individuais ou avaliar sua contribuição para a função e estabilidade do complexo.

Aqui são mostrados os espectros de absorção de um tipo selvagem e CP 29 mutado. A linha verde mostra as diferenças entre os dois gráficos Quando tate, esta técnica incluindo o gradiente SUSE, a ultracentrifugação pode ser feita em 24 horas se for realizada corretamente.