Assassino Artificial células apresentadoras de antígenos (KaAPC) para a eficiente In Vitro Depleção de células T humanas antígeno específico da

O objetivo geral deste experimento é gerar uma célula apresentadora de antígeno artificial assassino baseada em HLA IG não celular, ou K-A-A-P-C para o esgotamento de populações de células T autorreativas ou indesejadas. Isso é conseguido primeiro ligando covalentemente moléculas HLA IG e anticorpos monoclonais Antifa em partículas de dextrano de ferro do tamanho de células para a geração do K-A-A-P-C funcional Na segunda etapa, os K-A-A-P-C são caracterizados por citometria de fluxo para garantir sua funcionalidade adequada. Em seguida, o K-A-A-P-C é carregado com diferentes peptídeos de interesse para atingir a população de células T específica do antígeno indesejado.

Em última análise, a análise cítrica de fluxo pode ser realizada para medir a morte mediada por anti-gordura específica do antígeno das células T pelo cognato carregado. K-A-A-P-C. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando encontramos problemas ao trabalhar no desenvolvimento de uma célula apresentadora de antígeno assassino baseada em células enquanto, ao mesmo tempo, estávamos trabalhando no desenvolvimento de uma plataforma baseada em batidas. Tecnologia para modulação de células imunes Para gerar K-A-A-P-C primeiro, adicione 250 microlitros de esferas de epóxi de um estoque e 250 microlitros de tampão de borato recém-preparado em um frasco de vidro estéril com tampa de rosca.

Coloque o frasco sobre um íman para deixar as esferas aderirem após dois minutos, aspire o tampão e retire o frasco do íman. Lave as contas uma vez com outro mililitro de tampão de furo oito e, em seguida, ressuspenda-as em 550 microlitros de HLA A dois IG e CD 95 MAB anti-humano. Agite o frasco suavemente para misturar as esferas com os anticorpos e, em seguida, incube as esferas em um rotador de ponta a ponta a quatro graus Celsius por 24 horas.

No dia seguinte, gire as contas por dois minutos a 300 Gs e temperatura ambiente e coloque o frasco de volta no ímã. Após dois minutos, aspire o tampão de carregamento. Remova o frasco do ímã e lave as contas em um mililitro de tampão de lavagem com agitação cuidadosa.

Após a terceira lavagem, gire o frasco em um mililitro de tampão de lavagem de esferas frescas para bloquear quaisquer locais residuais de ligação de proteínas. No dia seguinte, gire as contas novamente e coloque o frasco de volta no ímã. Após dois minutos, aspire o tampão de lavagem.

Remova o frasco do ímã e adicione um mililitro de PBS ao KAPC. Para verificar a qualidade das contas, transfira 1,5 vezes 10 para o quinto do K-A-A-P-C para um tubo de fax e lave-as com um mililitro de tampão de lavagem de fax Resus. Suspenda o pellet de esferas em 100 microlitros do tampão de lavagem e adicione um microlitro de anti-mouse IgG, um PE para detectar o HLA A, dois IG e um microlitro de anti-mouse IG MFI TC para detectar o anti-humano CD 95 MAB.

Em seguida, após uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius, lave as contas em um mililitro de tampão de lavagem de fax Resus. Suspenda-os em 250 microlitros de tampão de lavagem e leia as amostras em um citômetro de fluxo para carregamento de peptídeos. Transfira duas vezes 10 para o sétimo do K-A-A-P-C para um novo frasco de vidro estéril.

Em seguida, depois de colocar as esferas no ímã por dois minutos, aspire o PBS e ressuspenda as esferas em 500 microlitros de PBS fresco contendo cinco microgramas de peptídeo. Rotule o frasco com a data e o nome do peptídeo carregado, K-A-A-P-C. Em seguida, armazene o K-A-A-P-C carregado a quatro graus Celsius por pelo menos três dias para permitir carga suficiente de peptídeos no dímero HLA A dois IG para realizar o ensaio de morte in vitro A-K-A-A-P-C.

Lave o peptídeo carregado K-A-A-P-C conforme demonstrado pelo menos seis vezes para remover todos os peptídeos livres. Em seguida, transfira K-A-A-P-C e duas vezes 10 para as células T específicas do quinto antígeno para um poço por amostra de uma placa de fundo redondo de 96 poços em 200 microlitros de meio de co-cultura na proporção de um para um após 48 horas de cultura em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Transfira as amostras para os tubos de fax correspondentes apropriados e lave-as em um mililitro de um tampão de ligação nexin five.

Em seguida, ressuspenda os pellets em 100 microlitros de um tampão de ligação nexina cinco e, em seguida, incube as amostras em um microlitro de uma nexina cinco FITC e cinco microlitros de sete a d à temperatura ambiente. Após 10 a 15 minutos, lave as amostras com um mililitro de um tampão de ligação nexin five e ressuspenda os pellets em 250 microlitros de um tampão de ligação nin five. Em seguida, leia imediatamente as amostras em um citômetro de fluxo.

K-A-A-P-C exibe HLA A, dois IG e Antifa MAB ao mesmo tempo, que em comparação com abordagens baseadas em células, não é alterado por eficácias de codificação ou transdução e pode ser facilmente modulado durante a produção. K-A-A-P-C são capazes de esgotar células T específicas do antígeno in vitro quando carregadas com peptídeo cognato, enquanto não carregadas cognatas. K-A-A-P-C não esgota as células T, portanto, K-A-A-P-C induziu a apoptose de células T de uma maneira específica do antígeno.

Posteriormente, quando K-A-A-P-C são usados para a depleção seletiva de células T específicas do antígeno de uma mistura de diferentes especificidades de células T, vazamentos mínimos de citotoxicidade para as células T vizinhas. Assim, o K-A-A-P-C representa uma ferramenta requintada para antígeno in vitro, depleção antígeno-específica de células T antígeno-específicas ativadas humanas com uma potencial aplicabilidade clínica para o tratamento de doenças autoimunes e rejeições de aloenxerto após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia celular explorarem novas abordagens para o tratamento de doenças autoimunes mediadas por células T e rejeições de transplantes.