Name: Assassino Artificial células apresentadoras de antígenos (KaAPC) para a eficiente In Vitro Depleção de células T humanas antígeno específico da (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a gerar células apresentadoras de antígeno artificiais assassinas (KaAPC) para depleção específica de células T autoreativas. Este método utiliza partículas de ferro-dextran e citometria de fluxo para imunoterapia celular direcionada.

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Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) e KFO 146 (MF), o Departamento de Defesa DOD concessão PC 040972 (MO) e do Instituto Nacional de Saúde concede SR1 CA108835 , SR1 Ai44129 (JPS)

1 Geração de HLA-A2-Ig Baseado KaAPC <ol><li> Preparar tampão de borato estéril. Adicione uma solução de ácido bórico em água de 0,1 M e ajustar o pH para 7,0. Filtro estéril (0,22 mm) de tampão e armazenar a 4 ° C. </li><li> Preparar o tampão de lavagem talão estéril. Utilize tampão fosfato salino (PBS) sem cálcio e magnésio. Adicionar soro AB humano a 3% de concentração final. Adicionar ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para uma concentração final de 2 mM. Adicionar azida de sódio (NaN3) a 0,01% para a concentração final. Filtro estéril (0,22 mm) de tampão e armazenar a 4 ° C. </li><li> Transferir 250 mL de contas de epóxi (cerca de 100 x 10 6 esferas) de estoque em um estéril, tampa de rosca frasco de vidro. </li><li> Adicionar 250 ul de tampão de borato. </li><li> Coloque frasco de vidro em um ímã e deixe contas aderir por 2 min; tampão aspirado e remover frasco de vidro do ímã. </li><li> Lavar as pérolas uma vez com 1 ml de tampão de borato. </li><li> Ressuspender as esferas em 550 ul de 0,018 ug/ Ml de HLA-A2-Ig e 3,64 ug / ml de anti-humano CD95 mAb (clone CH11) e misturar suavemente por agitação. (Por favor, consulte a seção de discussão para obter mais informações.) </li><li> Incubar frasco de vidro em uma extremidade rotador durante final, a 4 ° C durante 24 hr. </li><li> Girar as pérolas a 300 xg durante 2 min. </li><li> Coloque frasco de vidro em um ímã para 2 min e aspirar a "solução de carregamento KaAPC"; remover frasco de vidro do ímã, adicionar 1 ml de tampão de lavagem talão e ressuspender cuidadosamente por agitação. </li><li> Repita o passo 1.10 duas vezes. </li><li> Incubar frasco de vidro num rotor a 4 ° C durante 24 h, em 1 ml de tampão de lavagem de grânulo. Neste ponto, todos os locais de ligação de proteína residual será bloqueada pelo soro AB humano contido no tampão de lavagem talão. </li><li> Girar as pérolas a 300 xg durante 2 min. </li><li> Coloque frasco de vidro em um ímã para 2 min e tampão aspirado lavagem talão; remover frasco de vidro do ímã e solução substituir com 1 ml de PBS. </li></ol> 2 Controle de Qualidade, Peptide Carregando, Wcalcinação, Armazenamento e Estabilidade da KaAPC <ol><li> Transferir 1,5 x 10 5 KaAPC para um tubo de FACS e lava-se com 1 ml de tampão de lavagem de FACS. </li><li> Ressuspender as pérolas em 100 ul tampão de lavagem de FACS e adicionar 1 ml de anti-IgG1 de ratinho PE (para a detecção de a parte Fc do HLA-A2-Ig) e 1 uL de anti-IgM de ratinho FITC (clone R6-60.2, para detecção do mAb anti-CD95 humano). </li><li> Incubar durante 15 minutos a 4 ° C, lava-se com 1 ml de tampão de lavagem de FACS, e ressuspender em 250 ul de tampão de lavagem de FACS e ler coloração por citometria de fluxo. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500"> Figura 1 QC mancha de um lote KaAPC feito como indicado na secção de protocolo. Coloração foi realizada como descrito na secção de protocolo 2 de HLA-A2-Ig foi detectada utilizando um anti-murganho-PE mAb IgG1, ao passo que anti-humano CD95 (anti-Fas) foi detectada com um anticorpo anti-ratinho-FITC mAb IgM (ver protocolo sicção 2.2) (linha azul). Gráficos pretos, cheios representam pérolas vazias corados com anti-mouse-IgG1 PE mAb ou anti-mouse-IgM FITC mAb, respectivamente. Números no canto superior direito indicam a intensidade de fluorescência média (MFI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="4"><li> Para peptídeo transferência de carga 20 x 10 6 KaAPC em um novo frasco de vidro esterilizado, coloque em um ímã para 2 min, aspirar PBS e ressuspender em pérolas 500 mL PBS fresco com 5 mg peptídeo (Tenha em mente, apenas peptídeos HLA-A2 restritas vai ligar-se ao dímero!). </li><li> Loja carregado KaAPC a 4 ° C até à sua utilização, por pelo menos 3 dias, para permitir o carregamento de péptido suficiente para o dímero de HLA-A2-Ig. </li><li> Imediatamente antes da utilização, lavar o péptido carregado KaAPC como indicado em 1,14; repita este passo pelo menos 6x. NOTA: Este é um passo fundamental para garantir que o peptídeo livre tem to ser removido completamente para evitar falsos resultados positivos de extermínio; péptido livre residual foi mostrado para induzir apoptose em culturas de células T específicas para o antigénio 9. Para excluir um efeito peptídeo solúvel, executar amostras de controlo de sobrenadante de peptídeo carregado e lavado KaAPC (ver 3.8). </li><li> Contagem contas usando hemocitômetro e etiqueta com data, nome do peptídeo e concentração. NOTA: carregados KaAPC permanecer funcional, a 4 ° C durante pelo menos um mês. Após um mês, re-carregamento com o mesmo péptido permite KaAPC para ser utilizada até um ano. </li></ol> 3. KaAPC In Vitro Ensaio Killing <ol><li> Prepare a mídia de co-cultura. Preparar meio RPMI completo suplementado com factor de crescimento de células T de 3% (fabricado no laboratório 6) e 3% de doadores de plasma autólogo. Se doador de plasma autólogo não estiver disponível, usar soro AB humano inativado pelo calor. </li><li> Preparar tampão de ligação AnnexinV preparação. Dissolve-se 8,12 g de cloreto de sódio (NaCl) e 0,12 g calccloreto de io (CaCl 2) em 990 ml de ddH 2 O.Add 10 ml de tampão de HEPES 1M. </li><li> Gerar células T específicas de antigénios humanos. (Para um protocolo detalhado, consulte a publicação anterior 7 utilizando artificiais células apresentadoras de antígenos (AAPC)). Certifique-se de que a especificidade de peptídeo é, pelo menos,&gt; 75%, como determinado por coloração de tetrâmero. </li><li> Para cada amostra incubar por 2 x 10 5 células T específicas de antigénio / poço (em 96 poços redondos de fundo da placa), em 200 ul de meio de co-cultura a uma razão de 1: 1 com KaAPC durante 48 horas numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Amostras de colheita e transferir para um tubo de FACS; lava-se com 1 ml de tampão de ligação AnnexinV, girar a 300 xg durante 5 minutos, rejeitar o sobrenadante e ressuspender em 100 ul de tampão de ligação AnnexinV </li><li> As amostras de manchas com 1 ul AnnexinV FITC e 5 ul de 7-AAD para 10-15 min à temperatura ambiente, lava-se com 1 ml de tampão de ligação AnnexinV; girar a 300 xg por 5 min, elimine o sobrenadante umd ressuspender em 250 ul de tampão de ligação AnnexinV </li><li> Leia amostras imediatamente em citômetro de fluxo. </li><li> Prepare as seguintes amostras para determinar assassinato antígeno-específica por KaAPC: apenas células T; As células T anti-CD95 + solúvel; As células T + descarregado KaAPC; Células T + péptido não carregado KaAPC cognato; Células T + péptido cognato carregado KaAPC; Células T + sobrenadante de peptídeo cognato carregado KaAPC. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500"> . Figura 2 KaAPC matando ensaio Peptide carregado KaAPC ou esferas de controlo (HLA-A2-Ig apenas grânulos) foram cultivadas durante 48 horas a uma razão de 1: 1 com células T específicas CMVpp65 (~ 80%), recolhido e subsequentemente corados com AnnexinV e iodeto de propídio (PI) para determinar a apoptose por citometria de fluxo (ver secção protocolo de 3,3-3,7). "cognato" refere-se a esferas carregadas com CMVpp65 e "não-cognato" para seranúncios carregados com Mart-1 péptido. Os números indicam a porcentagem de células T viáveis ​​no quadrante inferior esquerdo de cada parcela. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="9"><li> Para executar as experiências cruzadas-, gerar células T específicas para o antigénio de duas especificidades diferentes. </li><li> Além disso avaliar a depleção-capacidades específicas de antigénio de KaAPC com uma análise simultânea da eliminação específica de antigénio de células T na população de células T heterogénea. (Para um protocolo detalhado consulte Schütz et al. 10). </li></ol>

<ol><li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li>
<li>Schütz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((artificial+antigen-presenting+cells%3A+the+synthetic+embodiment+of+a+%E2%80%9Cguided+missile%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a “guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li>
<li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+but+not+immature+Fas+ligand+%28CD95L%29-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), At 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12759415">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12759415</a> 5406-5413 (2003).</li>
<li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells+by+Fas+ligand+%28FasL%2FCD95L%29-expressing+Killer-dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li>
<li>Schütz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+%28CD95L%29-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li>
<li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li>
<li>Chiu, Y. -L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li>
<li>Schütz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killer+artificial+antigen-presenting+cells%3A+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li>
<li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li>
<li>Schütz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li>
<li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+letters%22%5BJournal%5D)">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li>
<li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+nanotechnology%2C+biology%2C+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li>
<li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+shape+dependence+of+CD8%2B+T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li>
</ol>

CS e MF não têm nada a revelar. Sob um acordo de licenciamento entre NexImmune e da Universidade Johns Hopkins, drs. Schneck e Oelke têm direito a ações de royalties recebidos pela Universidade em vendas de produtos AAPC descritos neste artigo. Eles também possuem ações NexImmune, que está sujeita a certas restrições no âmbito da política da Universidade. Dr. Schneck é um membro da companhia &quot;s Conselho de Administração e do Conselho Consultivo Científico. Os termos deste acordo estão a ser geridos pela Universidade Johns Hopkins, de acordo com o seu conflito de políticas de interesse.

O passo mais importante no protocolo é garantir a proporção adequada de sinal 1 (peptídeo MHC) e sinal de 2 (anti-Fas mAb). Realizamos experimentos de titulação intensivos para definir a relação perfeita para o sinal 1 e 2; , tornou-se evidente que variações mínimas, devido às diferenças no dímero de HLA-A2 ou concentrações de Ig anti-Fas de mAb pode interferir com a funcionalidade do KaAPC. Assim, a concentração de ambos os sinais deve ser sempre verificada e a qualidade de ambas as proteínas devem ser frequentemente testado mesmo que foi pedido de uma fonte comercial. Além disso, as concentrações deverão ser sempre determinada pelo mesmo ensaio como ensaios de detecção de diferentes pode resultar em diferentes concentrações. Funcionalidade do HLA-A2-Ig também pode ser prejudicada devido a refolding incompleto e / ou carregamento peptídeo ineficiente. Além disso moléculas dímero pode agregar em diferentes graus, o que pode ter impacto sobre a atividade funcional da proteína. Portanto, a actuai quantidade de dímero necessário para a geração de um KaAPC funcional específico e pode variar. Além disso, verificou-se que o intervalo ideal para a indução da morte de sinal de anti-Fas sobre mAb KaAPC é extremamente apertado. Nas nossas mãos quantidades maiores 3,64 ug / ml de levar a morte não específica de células T positivas para Fas, enquanto quantidades inferiores a 3,64 ug / ml resultou numa reduzida actividade de morte, dependendo da dose. Embora estas condições parecem muito apertado, a atenção a estes detalhes irá resultar na geração de um KaAPC funcional e específico. Embora a corrente de fenótipo KaAPC é funcional para a depleção de células T específicas de antigénio activadas, as experiências iniciais de segmentação de células específicas para o antigénio T naive em repouso ou não demonstrou nenhuma indução significativa de apoptose específica de antigénio, como estas populações reduziram a expressão de Fas. Portanto, pode-se prever a adição de um sinal co-estimulador para a KaAPC para induzir o aumento da regulação do Fas em células T em repouso para se transformá-losem uma meta para o KaAPC. Embora isto seja possível, todos os três sinais terá de ser cuidadosamente ajustada para garantir um fenótipo KaAPC funcional. Ajustar a plataforma de talão a uma matriz biocompatível ou biodegradáveis ​​irá melhorar KaAPC na aplicabilidade vivo. Recentemente, Shen et al. Relatam a utilização bem sucedida em vivo dos KaAPC 5 utilizando esferas de látex iM conjugado com anti-Fas (clone JO2) e anti-His / H2-K b -TRP2 11. Temos sido capazes de mostrar que o conceito geral de células apresentadoras de antígenos artificiais (AAPC) podem ser transferidos com sucesso de mM dimensionado para partículas de tamanho 12 nm e que a funcionalidade é influenciada pela geometria da partícula 13. Assim, fazendo variar o tamanho e / ou forma de um futuro KaAPC desenhos pode ser capaz de afectar a funcionalidade in vivo e a biodistribuição, a qual pode ser a chave para o sucesso do tratamento de doenças auto-imunes específicas de órgãos. <p class='"jove_content"&gt;' kaapc superar os principais problemas da estrat deple de c com base em um f usar the shelf tempo e custo abordagem eficiente que independente condi doador pr n s alvos auto ou sinaliza par assassinato sens a fun efetoras citol dos ctl. exigir identifica do ant doen causa contamos o seu tipo hla espec embora actualmente numerosos antig hla-a2 restrito adequados para diabetes esclerose gvhd m foram identificados>2, o desenvolvimento de HLA de classe I suplementar dímero moléculas, bem como a identificação de novos antigénios em curso relevantes autoimunes irá aumentar e alargar a aplicabilidade de outro KaAPC. Além disso pode-se pensar em usar KaAPC dirigida a diferentes epítopos para atingir múltiplos antígenos simultaneamente. Em resumo, KaAPC representam uma tecnologia de plataforma flexível para umaespecíficos do tigen depleção de células T. Sua natureza "lego-like" possibilita a inclusão de novos sinais, como sinais co-estimulatórios ou inibitórios adicionais, como PD1 ou TRAIL em várias matrizes, o que poderia ampliar e melhorar a sua posterior in vitro e in vivo aplicabilidade. Nós apresentamos aqui o protocolo de passo-a-passo para gerar KaAPC, a abordagem baseada em primeiro talão para a eliminação de células T específicas de antigénios a partir de misturas de células T com especificidades diferentes. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500"> Figura 3. KaAPC eliminar CTL de uma forma específica para o antigénio marcado com PKH26 activado Fas + CTL efectoras da memória e PKH67-rotulado CTL específica CMVpp65-a partir do mesmo dador foram misturados com uma mistura 1:. Proporção e co-cultivadas com 1 CMVpp65 KaAPC durante 48 h. As culturas de controlo foram tratados com KaAPC descarregado, ou 1 ug / mlsolúvel de anti-Fas-mAb (clone CH11). Perda mínima de células viáveis ​​foi determinado em culturas não tratadas CTL mistos (mistura T). FACS dados originais para cada população CTL da mistura T são mostrados. Análise de apoptose foi realizada como anteriormente publicado por gating separado em ambas as populações de células T 10. Os números representados nos quadrantes superior esquerdo representa% de células totais. A figura ilustra é derivado de uma experiência representativa de três experiências independentes. Esta pesquisa foi originalmente publicado em Sangue. . Schutz, C. et al assassino células apresentadoras de antigénios artificiais: uma nova estratégia para eliminar as células T específicas de sangue.. 2008; 111, 3546-52. Direitos de autor da Sociedade Americana de Hematologia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Ao longo das duas últimas décadas muito progresso foi feito na compreensão dos mecanismos patogénicos de doenças auto-imunes. No entanto, os tratamentos mais comuns ainda dependem de corticosteróides, bem como drogas imunossupressoras, como análogos de purina, agentes alquilantes e inibidores da calcineurina 1. O uso de tais drogas tem melhorado muito o prognóstico dos pacientes, no entanto, o tratamento não fornece uma cura do mau funcionamento imunológico subjacente. Além disso, os pacientes tornam-se vulneráveis ​​a infecções e ao desenvolvimento de câncer. Por isso, o objectivo final no tratamento de doenças auto-imunes mediadas por células T e a rejeição do enxerto é alvejar especificamente apenas as células T causadoras de doenças, enquanto, ao mesmo tempo, deixando o restante do sistema imunitário intacto e competente para lutar contra distúrbios imunológicos. Utilizando células apresentadoras de antígenos (APC), como um tratamento para suprimir respostas de células T do sangue periférico foi descrito pela primeira vez já emdécada de 1970 por vários grupos. Desde então, diversos métodos à base de células têm sido desenvolvidos (revisto em Schutz et ai. 2). Estratégias utilizando-expressando FasL assassino-APC como células imunorregulatórios mostrou resultados promissores, indicando potencial terapêutico para o tratamento de auto-imunidade, rejeição do enxerto e infecções crônicas. No entanto, existem limitações significativas com as estratégias que utilizam FasL Killer-APC que, em última análise limita a sua aplicabilidade clínica; (I) a geração ou isolamento de APC é de tempo, trabalho e custos intensivos (ii) pacientes que sofrem de citopenia devido a imunossupressão fornecer quantidades e qualidade de células limitadas (iii) revestimento ou a transdução de sinais com a APC indução de apoptose, tais como os resultados de FasL altamente fenótipos e (iv) Killer-APC são sensíveis a citotóxica funções efectoras de células T, reduzindo, consequentemente, o seu potencial terapêutico. Portanto, é difícil garantir um reprodutível fenótipa Killer-APC definidatipo que pode ser utilizado para a modulação específica de antigénio de respostas de células T in vivo. Com base no nosso trabalho anterior com FasL expressando Killer-APC e 3-5 células apresentadoras de antigénios artificiais (AAPC) 6,7 nós desenvolvida uma abordagem baseada no talão (KaAPC) para a inibição específica de antigénio ou eliminação de células T auto-reactivas, em vitro. KaAPC consistem de um dímero de HLA-A2-Ig (sinal 1) e um mAb anti-Fas (apoptose sinal indutor) covalentemente imobilizada sobre uma superfície de um 4.5 mm de paramagnética esférula de látex. Eles depleção das células T específicas de antigénio de uma maneira mediada pelo Fas / FasL, a partir de culturas de células T de múltiplos especificidades de uma maneira específica do antigénio e independente da morte celular induzida por activação (AICD) via. Dose apoptose dependente de células T-alvo é induzida rapidamente já depois de 30 min 8. KaAPC podem ser facilmente gerados, de forma controlada garantindo uma definida fora do phenot prateleiraYpê e superar a maioria das deficiências das estratégias de depleção de células baseado. Consequentemente, KaAPC exibir um grande potencial para o tratamento de doenças auto-imunes mediadas por células T e a rejeição do enxerto, o avanço do campo de estratégias de tratamento específicos de células T.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro AB humano</td><td>Atlanta biológicos</td><td>S40110</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma / Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio</td><td>Sigma / Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>M-450 contas epóxi</td><td>Invitrogen / Dynal</td><td>14011</td><td></td></tr><tr><td>MPC-1 ímã</td><td>Invitrogen / Dynal</td><td>12001D</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidro com tampa de rosca</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338AA</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD95 (clone CH11)</td><td>Milliore</td><td>05-201</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A2-Ig dímero</td><td>BD/Pharmingen</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-tube 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse IgG1 PE</td><td>BD/ Pharmingen</td><td>559320</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse IgM FITC</td><td>BD/Pharmingen</td><td>553408</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Merck</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>cellgro/Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>gibco/life technologies</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>96-well Round placa inferior</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>AnnexinV FITC</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA577-1001-1000</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD/Pharmingen</td><td>51-68981E</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr></tbody></table>

assassino artificial células apresentadoras de antígenos (kaapc) para a eficiente in vitro depleção de células t humanas antígeno específico da

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

O tratamento atual das doenças autoimunes mediadas por células T se baseia principalmente sobre as estratégias de imunossupressão global, o que, no longo prazo, é acompanhado de efeitos colaterais adversos, tais como redução da capacidade para o controle de infecções ou neoplasias. Portanto, novas abordagens precisam ser desenvolvidas que visam apenas as células da doença mediação e deixar o sistema imunológico restante intacto. Ao longo da última década, uma variedade de estratégias de imunoterapia com base em células de modular as respostas imunitárias mediadas por células T tem sido desenvolvido. A maioria destes métodos baseiam-se em células apresentadoras de antigénio de indução de tolerância (APC). No entanto, além de ser tecnicamente difícil e incómodo, tais abordagens baseadas em células são altamente sensíveis a respostas de células T citotóxicas, o que limita a sua capacidade terapêutica. Aqui é apresentado um protocolo para a geração de células apresentadoras de antigénios artificiais assassinas não celular (KaAPC), que permite a depleção das células T patológicas, deixando o remaining sistema imunológico intacto e funcional. KaAPC é uma solução alternativa para imunoterapia celular, que tem potencial para o tratamento de doenças auto-imunes e rejeição de aloenxertos por regulação das respostas de células T indesejáveis ​​num local específico do antigénio.

As características deste protocolo definido incluem a geração de um fenótipo KaAPC que apresenta HLA-A2-Ig (sinal 1) e anti-Fas mAb (sinal de apoptose), ao mesmo tempo, o que em comparação com métodos baseados em células não é alterada pelo revestimento ou eficácias de transdução, e pode ser facilmente modulada durante a produção (Figura 1). Além disso, KaAPC, não são sensíveis às funções efectoras das células T citotóxicas e a sua funcionalidade não é dependente da qualidade das células apresentadoras de antigénios autólogos pré e pós manipulação in vitro. KaAPC são capazes de reduzir o número de células T específicas para o antigénio in vitro, quando carregado com o péptido cognato, enquanto a não-cognato carregado KaAPC não esgotam as células T (Figura 2). Portanto, KaAPC induzir a apoptose das células T de uma maneira especifica para o antigénio. Subsequentemente, utilizou-se KaAPC para depleção selectiva de células T específicas de antigénio a partir de uma mistura de diferentes células T specificities, demonstrando que apenas citotoxicidade mínimo estava vazando em células vizinhas T (Figura 3). Assim, KaAPC representam uma ferramenta excelente para a depleção in vitro específico de antigénio de células T específicas para o antigénio humano activadas com potencial aplicabilidade clínica para o tratamento de doenças auto-imunes e rejeição de aloenxerto.

Orientações são apresentados para a produção de antigénio de células apresentadoras artificial assassino, KaAPC, uma ferramenta eficaz para a depleção in vitro de células T específicas de antigénios humanos e de uma solução alternativa para imunoterapia celular para o tratamento de doenças mediadas por células T auto-imunes num antígeno forma específica, sem comprometer o sistema imunitário remanescente.

Assassino Artificial células apresentadoras de antígenos (KaAPC) para a eficiente In Vitro Depleção de células T humanas antígeno específico da

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

O objetivo geral deste experimento é gerar uma célula apresentadora de antígeno artificial assassino baseada em HLA IG não celular, ou K-A-A-P-C para o esgotamento de populações de células T autorreativas ou indesejadas. Isso é conseguido primeiro ligando covalentemente moléculas HLA IG e anticorpos monoclonais Antifa em partículas de dextrano de ferro do tamanho de células para a geração do K-A-A-P-C funcional Na segunda etapa, os K-A-A-P-C são caracterizados por citometria de fluxo para garantir sua funcionalidade adequada. Em seguida, o K-A-A-P-C é carregado com diferentes peptídeos de interesse para atingir a população de células T específica do antígeno indesejado.Em última análise, a análise cítrica de fluxo pode ser realizada para medir a morte mediada por anti-gordura específica do antígeno das células T pelo cognato carregado. K-A-A-P-C. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando encontramos problemas ao trabalhar no desenvolvimento de uma célula apresentadora de antígeno assassino baseada em células enquanto, ao mesmo tempo, estávamos trabalhando no desenvolvimento de uma plataforma baseada em batidas. Tecnologia para modulação de células imunes Para gerar K-A-A-P-C primeiro, adicione 250 microlitros de esferas de epóxi de um estoque e 250 microlitros de tampão de borato recém-preparado em um frasco de vidro estéril com tampa de rosca.Coloque o frasco sobre um íman para deixar as esferas aderirem após dois minutos, aspire o tampão e retire o frasco do íman. Lave as contas uma vez com outro mililitro de tampão de furo oito e, em seguida, ressuspenda-as em 550 microlitros de HLA A dois IG e CD 95 MAB anti-humano. Agite o frasco suavemente para misturar as esferas com os anticorpos e, em seguida, incube as esferas em um rotador de ponta a ponta a quatro graus Celsius por 24 horas.No dia seguinte, gire as contas por dois minutos a 300 Gs e temperatura ambiente e coloque o frasco de volta no ímã. Após dois minutos, aspire o tampão de carregamento. Remova o frasco do ímã e lave as contas em um mililitro de tampão de lavagem com agitação cuidadosa.Após a terceira lavagem, gire o frasco em um mililitro de tampão de lavagem de esferas frescas para bloquear quaisquer locais residuais de ligação de proteínas. No dia seguinte, gire as contas novamente e coloque o frasco de volta no ímã. Após dois minutos, aspire o tampão de lavagem.Remova o frasco do ímã e adicione um mililitro de PBS ao KAPC. Para verificar a qualidade das contas, transfira 1,5 vezes 10 para o quinto do K-A-A-P-C para um tubo de fax e lave-as com um mililitro de tampão de lavagem de fax Resus. Suspenda o pellet de esferas em 100 microlitros do tampão de lavagem e adicione um microlitro de anti-mouse IgG, um PE para detectar o HLA A, dois IG e um microlitro de anti-mouse IG MFI TC para detectar o anti-humano CD 95 MAB.Em seguida, após uma incubação de 15 minutos a quatro graus Celsius, lave as contas em um mililitro de tampão de lavagem de fax Resus. Suspenda-os em 250 microlitros de tampão de lavagem e leia as amostras em um citômetro de fluxo para carregamento de peptídeos. Transfira duas vezes 10 para o sétimo do K-A-A-P-C para um novo frasco de vidro estéril.Em seguida, depois de colocar as esferas no ímã por dois minutos, aspire o PBS e ressuspenda as esferas em 500 microlitros de PBS fresco contendo cinco microgramas de peptídeo. Rotule o frasco com a data e o nome do peptídeo carregado, K-A-A-P-C. Em seguida, armazene o K-A-A-P-C carregado a quatro graus Celsius por pelo menos três dias para permitir carga suficiente de peptídeos no dímero HLA A dois IG para realizar o ensaio de morte in vitro A-K-A-A-P-C.Lave o peptídeo carregado K-A-A-P-C conforme demonstrado pelo menos seis vezes para remover todos os peptídeos livres. Em seguida, transfira K-A-A-P-C e duas vezes 10 para as células T específicas do quinto antígeno para um poço por amostra de uma placa de fundo redondo de 96 poços em 200 microlitros de meio de co-cultura na proporção de um para um após 48 horas de cultura em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Transfira as amostras para os tubos de fax correspondentes apropriados e lave-as em um mililitro de um tampão de ligação nexin five.Em seguida, ressuspenda os pellets em 100 microlitros de um tampão de ligação nexina cinco e, em seguida, incube as amostras em um microlitro de uma nexina cinco FITC e cinco microlitros de sete a d à temperatura ambiente. Após 10 a 15 minutos, lave as amostras com um mililitro de um tampão de ligação nexin five e ressuspenda os pellets em 250 microlitros de um tampão de ligação nin five. Em seguida, leia imediatamente as amostras em um citômetro de fluxo.K-A-A-P-C exibe HLA A, dois IG e Antifa MAB ao mesmo tempo, que em comparação com abordagens baseadas em células, não é alterado por eficácias de codificação ou transdução e pode ser facilmente modulado durante a produção. K-A-A-P-C são capazes de esgotar células T específicas do antígeno in vitro quando carregadas com peptídeo cognato, enquanto não carregadas cognatas. K-A-A-P-C não esgota as células T, portanto, K-A-A-P-C induziu a apoptose de células T de uma maneira específica do antígeno.Posteriormente, quando K-A-A-P-C são usados para a depleção seletiva de células T específicas do antígeno de uma mistura de diferentes especificidades de células T, vazamentos mínimos de citotoxicidade para as células T vizinhas. Assim, o K-A-A-P-C representa uma ferramenta requintada para antígeno in vitro, depleção antígeno-específica de células T antígeno-específicas ativadas humanas com uma potencial aplicabilidade clínica para o tratamento de doenças autoimunes e rejeições de aloenxerto após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da imunologia celular explorarem novas abordagens para o tratamento de doenças autoimunes mediadas por células T e rejeições de transplantes.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este artigo descreve uma técnica simples para induzir aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico. A técnica pode ser aplicada clinicamente para gerar células não-alorreativas doador. Infusão dessas células poderia melhorar a reconstituição imunológica e reduzir a toxicidade após o transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas.

Indução de aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico por Estimulação com aloantígenos Co-estimulatórias bloqueio de sinal

Um método novo CD independente para indução e expansão de células T antígeno-específicos é descrito. HLA A2-Ig baseada Células Antigen Presenting artificial (AAPC) são carregados com HLA-A2 peptídeos restrito a expandir de forma eficiente CTL de especificidade do antígeno diversas. Esta tecnologia tem um grande potencial para CTL baseada imunoterapia adotiva.

HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

Aqui nós descrevemos um método para ativar e expandir células humanas NKT de granel populações de células T com células artificiais apresentando antígeno (AAPC). O uso de CD1d baseado AAPC fornece um método padronizado para a geração de números elevados de células NKT funcionais.

Antígeno Artificial célula apresentadora de ativação mediada (AAPC) e expansão de células T Natural Killer

Este vídeo descreve um protocolo para isolar células T CD8+ específicas de antígenos raros usando células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs) baseadas em nanopartículas magnéticas funcionalizadas com MHC-Igs carregados de peptídeos antigênicos e anticorpos anti-CD28. A interação dos aAPCs com células T CD8+ que expressam especificamente os receptores de células T direcionados a peptídeos antigênicos, seguida de sua expansão in vitro, resulta no enriquecimento e expansão dessa...

Enriquecimento baseado em nanopartículas e expansão de células T CD8+ específicas para antígenos

Este vídeo demonstra uma técnica para a geração ex vivo de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específico do antígeno tumoral. Vetores retrovirais portadores de RNA transgênico são misturados com células do baço em um meio suplementado com interleucina-2 para promover a sobrevivência e proliferação de células T. A mistura é então transferida para uma placa revestida com fragmentos de fibronectina humana recombinante e centrifugada para facilitar a fusão do vírus com a célula,...

Uma técnica ex vivo para gerar células T receptoras de antígeno quimérico específicas para tumores

As células T que expressam um receptor CD19 específico de antigénio quimérico (CAR) são infundidos como tratamento experimental de células B malignas nos nossos primeiro-em-humanos, os ensaios de terapia génica. Descrevemos a modificação genética das células T utilizando...

Aplicação Clínica de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Artificial e Antigen Presenting Cells para modificar geneticamente células T de Sangue do Cordão Umbilical e periférica

Aqui, apresentamos um protocolo para reproducibly e rapidamente gerar biologicamente inspirados, biodegradável articifical apresentadoras de células (aAPC) com tamanho ajustável, forma e apresentação de proteína de superfície de célula T expansão ex vivo ou in vivo .

Fabricação de anisotrópica poliméricas Artificial células apresentadoras para ativação de células T CD8 +

As células T antígeno-específicos são difíceis de caracterizar ou utilizar em terapias devido sua extremamente baixa frequência. Neste documento, nós fornecemos um protocolo para desenvolver uma partícula magnética que pode ligar para as células T antígeno-específicas para enriquecer estas células e então para expandi-los vários cem para caracterização e terapia.

Enriquecer e expandir células raras T antígeno-específicos com nanopartículas magnéticas

Este artigo descreve um método novo para gerar emigrantes Thymic de pilha-derivado induzido antígeno-específico do tumor (iTE) por um sistema Thymic tridimensional da cultura (3D). iTE é um subconjunto homogêneo de células T intimamente relacionadas com células T ingênuas com a capacidade de proliferação, formação de memória e supressão tumoral.

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

Este artigo descreve um protocolo para a geração de pilhas CD8 T antígeno-específicas, e sua expansão in vitro, com o objetivo de render números elevados de pilhas de T funcionais para o uso in vitro e in vivo.

Geração de alta eficiência de células T Cytotoxic do rato preliminar antígeno-específico para o teste funcional em um modelo auto-imune do diabetes

Este artigo descreve um método para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por antígeno funcional do tumor derivadas de CD8αβ+ únicas células T positivas usando o sistema de cocultura OP9/DLL1.

Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

Aprenda a gerar células apresentadoras de antígeno artificiais assassinas (KaAPC) para depleção específica de células T autoreativas. Este método utiliza partículas de ferro-dextran e citometria de fluxo para imunoterapia celular direcionada.

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