Name: A atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: A telomerase não-radioativo Repetir Amplification Protocol (TRAP) Assay (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Aprenda a medir a atividade da telomerase em tecido cerebral normal usando o ensaio TRAP não radioativo. Este método eficiente permite comparar regiões cerebrais e detectar diferenças entre sexos em camundongos.

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Este trabalho foi parcialmente apoiado pela tecnologia B.G. Negev e pela contribuição de Linda Powers.

As experiências com animais foram aprovados pelo comitê de ética em experimentação animal no Universidade Ben-Gurion (IL-39-08-2010). 1. rato Cérebro extração de proteínas <ol><li> Preparar 3 tubos de 15 ml cada, contendo 5 ml de solução e colocar tubos de Ringer no gelo. </li><li> Sacrifique o mouse usando anestesia isoflurano (ATENÇÃO - usar capuz química) por 10-20 segundos, seguido por deslocamento cervical e decapitação imediata. </li><li> Remover o cérebro do crânio e enxaguar durante alguns segundos com uma solução gelada de Ringer para evitar danos no tecido cerebral. </li><li> Usando uma lâmina cirúrgica, separar o cerebelo (CR) e tronco cerebral (BS), a partir do córtex frontal. Em seguida, separar o cerebelo a partir do tronco cerebral e cortar o lobo frontal (FL) a partir do córtex frontal; remover o bolbo olfactivo do lobo frontal. Coloque as três regiões do cérebro nas designadas tubos de 15 ml. </li><li> Homogeneizar o tecido em cada tubo. Adicionar fresh solução gelo frio de Ringer assim cada tubo contenha o mesmo volume e centrifuga-se durante 7 min a 800 x g. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 100 mL de tampão de lise de CHAPS a cada tubo. Misture bem, fazendo passar a solução várias vezes (~ 10) através de uma seringa de 1 ml com uma agulha G 21, e incubar em gelo durante 30 min. </li><li> Transferir o conteúdo de cada tubo para um novo tubo de micro-centrífuga e centrifuga-se durante 30 min a 13.000 x g. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de micro-centrífuga e determinar a concentração de proteína utilizando um método previamente estabelecido. Guardar os extractos de proteína em alíquotas de 10 ul a -80 ° C. </li></ol> 2. TRAP Ensaio Preparação de Instrumentos, Soluções de reacção, e cálculos de diluição de proteína <ol><li> Prepare o número apropriado de tubos etiquetados de micro-centrifugação de diluições de extracto de proteína e tampão de reacção da telomerase. Execute todas pipetagem no protocolo usando pontas com filtro para evitar a contaminação. </li&gt; <li> Descongele as seguintes soluções no gelo: TRAP mistura de reação 10x, TS primer, dNTP, extratos UPW e proteínas (ver tabela de materiais de reagentes e reagentes concentrações). </li><li> Dilui-se a solução de extracto de proteína para uma concentração final de 1 ug / mL utilizando água ultra-pura (PFS). </li></ol> 3. telomerase Reaction <ol><li> Prepare mistura de reação telomerase, adicionando o seguinte para um tubo de micro-centrífuga: mix 2 l TRAP (10x), 1 ml TS primário (0,1 g), uma dNTPs ul (10 mm) e 15 mL UPW. Por várias amostras, multiplique volumes acima referidos pelo número de amostras, mais 1. </li><li> Adicionar 19 ul da mistura de reacção para cada tubo de reacção e adicionar 1 ul do extracto de proteína diluída (1 ug de proteínas) a cada tubo para um volume final de 20 ul. </li><li> Colocar os tubos de ensaio num banho de água pré-aquecida a 30 ° C durante 45 min. </li></ol> 4. PCR Reação <ol><li> Quinze min antes do final da reação telomerase, descongelar as seguintes soluções: primers ACX, Titanium Taq buffer, UPW. </li><li> Prepare mistura da PCR, adicionando o seguinte para um tubo de micro-centrífuga: 2.5 l Titanium Taq Buffer (10x) 1 ml ACX primário (0,1 g), 2 l UPW (1 ml quando IC é usado) e 0,5 mL Titanium Taq Polimerase (50x). Por várias amostras, multiplique volumes acima referidos pelo número de amostras mais 2. </li><li> Adicionar 6 ul de mistura de PCR, cada tubo de PCR e adicionar todo o volume da reacção da telomerase (20 ul) a cada tubo para um volume final de 26 ul. </li><li> Inserir os tubos de PCR para um termociclador PCR e executar o seguinte programa: - 90 ° C - 2 min. - 94 ° C -. 30 seg * - 60 ° C - 30. Seg * - 72 ° C - 45. Sec * - 72 ° C - 2 min. O armazenamento de produtos de PCR a -20 ° C. * = 34 ciclos </li></ol> 5. Agarose Mini-gel Preparação, Amostras Correr, e Gel Coloração <ol><li> Adicionar 25 ml de tampão de electroforese refrigerados (TBE) e uma barra de agitação para um copo que é 2-4 vezes o volume de solução tampão e, lentamente, por aspersão, em 1,125 g da alta resolução (HR) de agarose em pó, enquanto a solução é rapidamente agitada . Remova a barra de agitação, cobrir o copo com um filme plástico e furar em um pequeno buraco para ventilação. Aqueça a taça no microondas em potência &quot;Low&quot; por 3 min e depois mudar para poder &quot;High&quot; e aquecer a solução em pulsos curtos, com cuidado para não causar derramamento. Note-se que quando a espuma criada pelo aquecimento torna-se grandes bolhas e desaparece após alguns segundos, a agarose é preparado. </li><li> Lançar o gel a um aparelho de mini-gel horizontal, depois de o gel solidifica à temperatura ambiente para permitir que o gel relaxar durante 20 min a 4 ° C antes da utilização. </li><li> Coloque cada pista com 25 mL de amostra de TRAP (20 l TRAP produtos de PCR e 5 de corante gel-loading ul 6x) e executado em 110 V durante 3 horas numa câmara fria a 4 ° C. </li><li> Prepare 3x mancha de ácido nucleico solução de trabalho adicionando 15 ul 10.000x mancha de ácido nucleico-, solução de estoque a 50 ml de água duplamente destilada (ADD), com 0,1 M de NaCl (0,29 g). Corar o gel durante 20 minutos com agitação suave. </li><li> Use fonte UV com 302 nm de comprimento de onda para ver as bandas de DNA escada TRAP. </li></ol>

<ol><li>Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+telomerase+in+cell+senescence+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis.</a> Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).</li>
<li>Cong, Y., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+human+telomerase+beyond+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actions of human telomerase beyond telomeres.</a> Cell Res. 18, 725-732 (2008).</li>
<li>Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTichon%2C+A+%22Curr.Mol.+Med%22">Curr.Mol. Med</a>. 13, 1010-1022 (2013).</li>
<li>Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+TERT+associates+to+RNA+granules+in+fully+mature+neurons%3A+Role+in+the+translational+control+of+the+cell+cycle+inhibitor+p15INK4B%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B.</a> PloS one. 8, e66602(2013).</li>
<li>De Jesus, B. B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+telomerase+activation+in+extending+health+span+and+logevity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential of telomerase activation in extending health span and logevity.</a> Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).</li>
<li>Blackburn, E., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase%3A+An+RNP+enzyme+synthesizes+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).</li>
<li>Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+telomerase+activity+and+TERT+expression+during+brain+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice.</a> J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).</li>
<li>Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+activity+in+the+subventricular+zone+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice.</a> Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).</li>
<li>Eitan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Telomerase-increasing+compound+in+mouse+brain+delays+the+onset+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis.</a> EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).</li>
<li>Kim, N. W., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantification+and+characterization+of+telomerase+activity+by+the+telomeric+repat+amplification+protocol+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP).</a> Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Análise de actividade da telomerase no cérebro do rato através do ensaio TRAP é constituído por quatro etapas principais: 1) extracção de proteínas a partir de regiões específicas do tecido cerebral 2) TS alongamento do iniciador pela telomerase - reacção da telomerase 3) amplificação dos produtos de reacção da telomerase por RCP 4 ) separação dos produtos de PCR em gel de agarose, utilizando alta resolução. Este ensaio TRAP modificado aborda duas grandes dificuldades que se erguem a partir ...

A telomerase é uma ribonucleoproteína composto por transcriptase inversa da telomerase (TERT), a subunidade catalítica de telomerase e um componente de RNA (TERC). O papel canônica da telomerase é preservar o comprimento adequado dos telômeros pela adição de sequências repetitivas (TTAGGG) para as extremidades teloméricas, portanto, promover a integridade genômica e proliferação celular 1. Papéis adicionais foram atribuídos a TERT em células, ou seja, que confere resistência à apoptose induzida por vários agentes prejudiciais 2, protege as células estaminais mesenquimais humanas a partir de estresse oxidativo 3, e desempenha um papel pró-sobrevivência em neurónios completamente diferenciados pela sua associação com o ARN positivo TIA1 grânulos 4. TERT é expresso e activo, principalmente em células somáticas de se dividir e, na maioria dos tipos de cancro, enquanto que os níveis de expressão e de actividade da enzima estão fortemente regulada em células que não se dividem 5,6. Estudos têm demonstrado que, na rcérebro Odent, a atividade da telomerase torna-se indetectável por dia pós-natal 10, enquanto TERT mRNA é mantida em níveis mais baixos para a idade adulta 7. Outros estudos demonstraram a actividade da telomerase na zona sub-ventricular adulto, o bolbo olfactivo, o hipocampo e no cerebelo e córtex adulto 8. Recentemente, demonstrou que novos compostos que aumentam a expressão e a actividade de telomerase no cérebro e espinal cabos exerceu efeitos neuroprotectores em N-metil-D-aspartato (NMDA) - ratinhos injectados, atrasou o aparecimento e progressão da doença de esclerose lateral amiotrófica em SOD1 transgénico ratinhos e aumentou a sobrevivência de neurónios motores na espinal medula de ratinhos estas 9. Para compreender totalmente a função pró-sobrevivência de telomerase em neurónios e no cérebro, o que é essencial para desenvolver um ensaio simples e relativamente sensível rápido para a detecção da actividade da telomerase em várias regiões do cérebro. O telomérica rprotocolo de amplificação epita (TRAP) é um ensaio de sensibilidade conhecida a combinação de actividade de telomerase e canónico a reacção em cadeia da polimerase (PCR). Neste ensaio, a telomerase adiciona TTAGGG repete a um substrato de telomerase (TS iniciador) oligonucleótido, seguido de amplificação de PCR, que gera 6 pares de bases (pb) escada de DNA usando o TS inversa iniciador -. ACX 32 P dCTP marcado, são utilizados para detectar a pequena quantidade de produtos de PCR. A escada de ADN foi resolvido por electroforese em gel de sequenciação de poliacrilamida (PAGE). Tanto a intensidade das bandas de DNA e o comprimento da escada de ADN reflectem a quantidade de moléculas de enzimas activas e sua processabilidade, respectivamente, 10. Este ensaio tradicional detém algumas das maiores dificuldades: O perigo de exposição a substâncias radioactivas, grandes e difíceis de lidar com o seqüenciamento eo consumo de tempo do gel de corrida e exposição do filme do produto radioativo (durante a noite, em ambos os casos). </p&gt; Este protocolo apresenta um ensaio de agarose não radioactivo melhorada mini-gel à base. O DNA 6 bp ladder é resolvido usando 4,5% de alta resolução em gel de agarose ea detecção é realizada com mancha de ácidos nucleicos altamente sensível. A combinação de alta resolução utilizando mini-gel de agarose e coloração de ácido nucleico sensível oferece fácil de manusear ensaio, elimina o risco de exposição à radioactividade e encurtar significativamente a duração total do ensaio de 3 dias a várias horas.

<table><tbody><tr><td>TRAP Mix (10x)</td><td></td><td></td><td>Feito manualmente, misture o seguinte em UPW: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8,2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 0,5% TWEEN (adquirido da Sigma). As alíquotas são congeladas a -20 ° C.</td></tr><tr>Solução <td></td><td></td><td>de Ringer</td><td>Feita manualmente, misture o seguinte em DDW: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4&middot; H2O, 2 mM de MgSO4, 26 mM de NaHCO3, 1,802 g/L de D-(+)-glicose anidra.</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Minrad INC.</td><td>NDC 60307-110-10</td><td>Manuseie com cuidado em um capuz químico</td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM)</td> <td>Sigma</td><td>D7295</td><td></td></tr><tr><td>TS primer (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')</td> <td>Oligos de DNA Sigma</td><td></td><td>encomendados em formato DRY e UPW adicionados de acordo com a concentração necessária</td></tr><tr><td>Primer ACX (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3')</td> <td>Oligos de DNA Sigma</td><td></td><td>encomendados em formato DRY e UPW adicionados de acordo com o requisito concentração</td></tr><tr><td>Titanium Taq Polymerase/Buffer</td><td>Clontech</td><td>S1792/S1793</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de alta resolução</td><td>Sigma</td><td>A4718</td><td>Qualquer agarose de alta resolução de alta qualidade pode ser sutible</td></tr><tr><td>Aparelho de Mini-gel</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4466</td><td></td></tr><tr><td>Mancha de ácido nucleico (GEL-RED)</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>IC primer (5'-ATCGCTTCTCTCGGCCTTTT-3')</td><td>Oligos de DNA Sigma</td><td></td><td>solicitados no formato DRY e UPW adicionados de acordo com a concentração necessária</td></tr><tr><td>Tampão de lise CHAPS</td><td>Tecnologia de sinalização celular</td><td>9852S</td><td>Adicione PMSF (inibidor de protease) a uma concentração final de 1 mM</td></tr><tr><td>de água ultrapura (UPW)</td><td>Biological Industries</td><td>01-866-1B</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos CD-1</td><td>HARLAN Laboratories INC.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: a telomerase não-radioativo repetir amplification protocol (trap) assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

A telomerase, uma ribonucleoprotein, é responsável por manter o comprimento dos telômeros e, portanto, promover a integridade genômica, proliferação e longevidade. Além disso, a telomerase protege a mitocôndria do estresse oxidativo e confere resistência à apoptose, sugerindo sua possível importância para a sobrevivência dos não-mitótico, células altamente ativos, tais como os neurônios. Nós já demonstraram a capacidade dos novos ativadores de telomerase para aumentar a atividade da telomerase e expressão nas diferentes regiões do cérebro do rato e para proteger as células neurônios motores do stress oxidativo. Estes resultados vêm reforçar a noção de que a telomerase está envolvida na protecção dos neurónios de várias lesões. Para sublinhar o papel da telomerase no cérebro, nós aqui comparar a atividade da telomerase em masculino e feminino cérebro do rato e sua dependência da idade. Ensaio TRAP é um método padrão para a detecção de actividade da telomerase em várias linhas celulares ou tecidos. Aqui demonstramos a Analysis da actividade da telomerase em três regiões do cérebro do rato por não-desnaturante CHAPS extracção de proteína utilizando um tampão de lise seguido por uma modificação do ensaio TRAP padrão. Neste ensaio, em 2 passos, a telomerase endógeno alonga um substrato da telomerase específico (TS iniciador) adicionando TTAGGG 6 repetições bp (reacção da telomerase). Os produtos de reacção da telomerase são amplificados por meio de reacção de PCR a criação de uma escada de DNA de incrementos de 6 bp. A análise do segmento de ADN é feita por electroforese em gel de agarose de alta resolução de 4,5%, seguido por coloração com mancha de ácido nucleico altamente sensível. Em comparação com o ensaio TRAP tradicionais que utilizam 32 marcado com P radioactivo de dCTP do para a detecção do ADN e de electroforese em gel de poliacrilamida para resolver a escada de DNA, este protocolo oferece um tempo de não-tóxico poupança ensaio TRAP para a avaliação da actividade de telomerase no cérebro do rato, o que demonstra a capacidade de detectar diferenças na telomerasatividade e nos diversos região do mouse cérebro feminino e masculino.

Extratos de proteínas de células inteiras foram preparados a partir do lobo frontal (FL), tronco cerebral (BS) e cerebelo (CR), obtido a partir de 3 CD-1 do sexo feminino e 3 CD-1 camundongos machos com as idades de 1 e 3 meses de idade para a ensaio TRAP modificado e 3 ratinhos CD-1 do sexo masculino com a idade de 2 meses de idade para o ensaio TRAP radioactivos. A actividade da telomerase foi detectada em 1 mg de extracto de proteínas usando o ensaio TRAP modificado e extrair 2 ug de proteínas para o ensaio TRAP radi...

A telomerase é expressa no cérebro neonatal e também em regiões distintas do cérebro adulto. Apresentamos um ensaio TRAP não tóxico que economiza tempo para a análise da atividade da telomerase em várias regiões do cérebro de camundongos e detecção de diferenças na atividade da telomerase entre cérebros de camundongos machos e fêmeas.

A atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: A telomerase não-radioativo Repetir Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a atividade da telomerase no tecido cerebral normal. Isso é feito preparando primeiro extratos de proteínas de células inteiras de vários tecidos cerebrais como fonte de uma enzima telomerase ativa. O segundo passo é adicionar quantidades equivalentes de extratos de proteínas a uma mistura específica de reação da telomerase contendo o substrato e os nucleotídeos necessários para a atividade da telomerase.Em seguida, os produtos da reação da telomerase são amplificados por PCR e analisados por eletroforese em gel aros de alta resolução. A etapa final é visualizar os produtos da reação da telomerase amplificada colorindo o gel aros com um agente de coloração de DNA altamente sensível, em última análise, resulta deste ensaio de protocolo de amplificação repetido do raio thoma mostra um incremento de seis pares de bases, escadas de DNA equivalentes à atividade do raio thoma em vários tecidos cerebrais. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como um ensaio de armadilha radioativa ou kits de ensaio de armadilha comercial, é que esse protocolo oferece uma alternativa relativamente eficiente em termos de tempo e custo.Embora esse método possa fornecer informações sobre a atividade desse tecido cerebral, ele também pode ser aplicado a qualquer outro tecido vivo ou cultura de células. Antes de iniciar este procedimento, prepare três tubos de 15 mililitros, cada um contendo cinco mililitros de solução de ringer. Coloque os tubos no gelo depois de remover o cérebro de um camundongo sacrificado.Enxágue o cérebro por alguns segundos com uma solução de ringer gelada para evitar danos ao tecido cerebral. Usando uma lâmina cirúrgica, separe o cerebelo e o tronco cerebral do córtex frontal. Em seguida, separe o cerebelo do tronco cerebral.Remova o bulbo olfatório do lobo frontal e corte o lobo frontal do córtex frontal. Coloque as três regiões do cérebro nos tubos designados de 15 mililitros, homogeneize o tecido em cada tubo. Em seguida, adicione uma solução fresca de campainha gelada para que cada tubo contenha o mesmo volume e centrifugue por sete minutos a 800 vezes G, remova o sobrenadante e adicione 100 microlitros de fatias de chap.Tampão para cada tubo. Misture bem passando a solução cerca de 10 vezes por uma seringa de um mililitro com um macarrão de calibre 21 incube no gelo por 30 minutos. Após 30 minutos, transfira o conteúdo de cada tubo para um novo tubo de microcentrífuga e centrifugue por 30 minutos.Às 13.000 vezes, G, transfira o supinato para um novo tubo de microcentrífuga. Depois de determinar a concentração de proteína usando um método previamente estabelecido, armazene os extratos de proteína em alíquotas de 10 microlitros a 80 graus Celsius negativos. Comece esta parte do protocolo preparando o número apropriado de tubos de microcentrífuga marcados para as diluições do extrato de proteína e o tampão de reação da telomerase para as seguintes soluções em gelo.10 x mistura de reação de armadilha DS primer dn tps, água ultrapura e extratos de proteína diluem a solução do extrato de proteína até uma concentração final de um micrograma por microlitro. Usando água ultrapura, execute toda a pipetagem usando pontas de filtro para evitar contaminação ou reação dos telômeros. Cada amostra requer uma mistura de reação de telômeros que consiste em dois microlitros de mistura de armadilha, um microlitro de primer TS, um microlitro de DN NTPs e 15 microlitros de água ultrapura para várias amostras.Multiplique esses volumes pelo número de amostras mais uma, adicione 19 microlitros da mistura de reação MASE a cada tubo de reação, seguido de um microlitro do extrato de proteína diluído. Para um volume final de 20 microlitros, coloque os tubos de reação em banho-maria pré-aquecido a 30 graus Celsius por 45 minutos. 15 minutos antes do final da reação de Thres, prepare-se para a amplificação dos produtos da reação de Thres usando as seguintes soluções, um primer CX, tampão de aderência de titânio e água ultrapura.Cada amostra requer uma mistura de reação de PCR composta por 2,5 microlitros de tampão de tecnologia de titânio, um microlitro de um primer CX, dois microlitros de água ultrapura e 0,5 microlitros de polimerase de tecnologia de titânio para várias amostras. Multiplique esses volumes pelo número de amostras mais duas. Adicione seis microlitros da mistura de reação de PCR a cada tubo de PCR e adicione todo o volume com a reação mase a cada tubo.Para um volume final de 26 microlitros, insira os tubos de PCR em um termociclador de PCR e execute o seguinte programa, 90 graus Celsius por dois minutos, seguido por 34 ciclos de 94 graus Celsius por 30 segundos. 60 graus Celsius por 30 segundos e 72 graus Celsius por 45 segundos. E dois minutos finais a 72 graus Celsius.Quando a reação de PCR estiver concluída, armazene os produtos de PCR a menos 20 graus Celsius. Para preparar as rosas de ovo para fundir o mini gel primeiro, adicione 25 mililitros de tampão de eletroforese TBE resfriado e uma barra de agitação a um béquer que tenha duas a quatro vezes o volume da solução tampão e comece a mexer. Em seguida, polvilhe lentamente 1.125 gramas do pó de aros de alta resolução.Enquanto a solução está mexendo rapidamente, remova a barra estrela. Cubra o copo com filme plástico e faça um pequeno orifício para ventilação. Ao atingir os agros, é fundamental atingir o ponto de ebulição para dissolver completamente os agros.Certifique-se de dar total atenção ao béquer no micro-ondas para garantir que a espuma gerada não transborde. Aqueça o copo no micro-ondas em potência baixa por três minutos depois mude para a potência alta e aqueça a solução em pulsos curtos, com cuidado para evitar derramamento. Lançar o gel num mini aparelho de gel horizontal e deixá-lo solidificar à temperatura ambiente Depois de o gel ter solidificado o gel durante 20 minutos a quatro graus Celsius.Antes de usar para eletroforese, carregue cada pista com 25 microlitros de amostra de armadilha e opere a 110 volts por três horas em uma câmara fria de quatro graus Celsius enquanto o gel estiver funcionando. Prepare uma solução de trabalho de coloração de ácido nucleico de três x adicionando 15 microlitros de 10.000 x solução estoque de coloração de ácido nucleico a 50 mililitros de água bidestilada com cloreto de sódio 0,1 molar. Quando a eletroforese das amostras estiver concluída, corar o gel por 20 minutos em temperatura ambiente com agitação suave.Por fim, use um iluminador UV trans com comprimento de onda de 302 nanômetros. Para visualizar a escada da armadilha, a atividade dos telômeros das bandas de DNA foi detectada em regiões do cérebro do camundongo pelos ensaios de armadilha tradicional e modificado. Melhor visualização e resolução dos produtos de DNA dos telômeros foram observadas com o ensaio modificado, conforme visto pelo comprimento e intensidade da escada de DNA.Uma redução gradual nos produtos de DNA dos telômeros foi observada quando concentrações decrescentes de extratos proteicos foram usados no ensaio trap modificado sugerindo sua sensibilidade para a detecção da atividade dos telômeros em concentrações mais baixas de proteínas, a detecção da atividade da telomerase pelo ensaio modificado em três regiões cerebrais de camundongos fêmeas e machos com um mês de idade não mostrou diferenças significativas. No entanto, em camundongos de três meses de idade, maior atividade da telomerase é mostrada no lobo frontal e no tronco encefálico em comparação com o cerebelo, conforme revelado pela intensidade das bandas de DNA e pelo comprimento da escada dos produtos de DNA. Durante a transição do camundongo para a idade adulta, a atividade do raio thoma aumenta no lobo frontal e diminui no tronco cerebral e no cerebelo.A atividade dos telômeros também parece ser maior no lobo frontal nas fêmeas. Em contraste com a maior atividade dos telômeros no tronco encefálico e cerebelo nos homens Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em seis a sete horas se for realizada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar facilmente a atividade do toma no tecido de sua escolha.

telomerase-activity-various-regions-mouse-brain-non-radioactive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit de análise podem ser usados ​​para analisar e quantificar 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine dentro de um locus spe específicos. O kit distingue 5 de 5 mC-HMC pela adição de glicose para o grupo hidroxila de 5-HMC através de uma reação enzimática utilizando β-glicosiltransferase (T4-BGT). Quando 5-HMC ocorre no contexto de CCGG, esta modificação converte um site MspI clivável para um site não-clivável.

Alta Sensibilidade de Detecção de 5 hydroxymethylcytosine-in Balb / C Tecido Cerebral

Um método preciso, curto, sofisticado e barato é descrito que avalia o comprimento dos telômeros em múltiplos tecidos e espécies usando qRT-PCR. Além disso, vamos descrever um teste simples para avaliar a atividade da telomerase como um teste backbone complementar para o comprimento dos telômeros.

Comprimento dos telômeros e da telomerase atividade; Um Yin e Yang da senescência celular

Nós descrevemos os procedimentos de rotulagem e genotipagem de ratos recém-nascidos e gerando culturas neuronais primárias a partir deles. A genotipagem é rápido, eficiente e fiável e permite a extracção de ácido nucleico automatizado. Isto é especialmente útil para os ratos neonatally letais e suas culturas que exigem a conclusão prévia de genotipagem.

Rápido genotipagem dos animais Seguido por Estabelecer culturas primárias de neurônios do cérebro

Telômero e telomerase desempenham papéis essenciais no envelhecimento e na tumorigênese. O objetivo deste protocolo é mostrar como gerar dois alelos knock-in de telomerase induzíveis por murinos e como utilizá-los nos estudos de degeneração/regeneração tecidual e câncer.

Utilizando Murino Inducible telomerase alelos nos Estudos de degeneração / regeneração tecidual e Câncer

A hibridização in situ (ISH) de RNA permite a visualização de RNAs em células e tecidos. Aqui, mostramos como a combinação de RNAscope ISH com imuno-histoquímica ou corantes histológicos pode ser usada com sucesso para detectar mRNAs localizados em axônios em seções de cérebros de camundongos e humanos.

Detecção de Axonally localizada mRNAs em seções do cérebro Usando de alta resolução<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

Transcriptase reversa de telomerase humana (TERT) sintetiza DNA oligospermia, não só mas também double-stranded do RNA através da atividade da RNA polimerase RNA-dependente. Aqui, descrevemos um ensaio recém-criada para detectar atividade de RNA polimerase RNA-dependente de TERT endógena.

Detecção semi-quantitativa de atividade RNA-dependente do RNA polimerase humana Telomerase Transcriptase reversa proteína

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar clones de células de câncer que contém uma marca de sequência MS2 em um único subtelomere. Esta abordagem, baseando-se no sistema MS2-GFP, permite a visualização de transcrições endógenas de oligospermia repetição contendo RNA (TERRA) expressado de um único dos telômeros em células vivas.

Geração de Clones de células câncer Visualizar oligospermia Repeat-contendo RNA TERRA expressado de um único dos telômeros em células vivas

Aqui, nós descrevemos um protocolo para gerar um modelo murino fêmea viável com inactivation não-aleatório do cromossoma de x, isto é, o cromossoma de x maternally-herdado é inativo em 100% das pilhas. Nós igualmente descrevemos um protocolo para testar a viabilidade, a tolerabilidade, e a segurança da reactivação farmacológica do cromossoma de X inativo in vivo.

Um modelo de camundongo não aleatório para reativação farmacológica de Mecp2 no cromossomo X inativo

Nós convertemos com sucesso o ensaio padrão do protocolo da amplificação da repetição do telomere (armadilha) a ser empregado em reações Chain digitais do polymerase da gota. Este novo ensaio, chamado ddTRAP, é mais sensível e quantitativo, permitindo uma melhor detecção e análise estatística da atividade de telomerase dentro de várias células humanas.

ARMADILHA digital da gota (ddTRAP): adaptação do protocolo da amplificação da repetição de telomere à reacção em cadeia da polimerase de droplet Digitas

A capacidade de marcar permanentemente células-tronco e sua prole com um fluoróforo usando uma linhagem transgênica indutível que traça a linhagem do mouse permite a análise espacial e temporal de ativação, proliferação, migração e/ou diferenciação in vivo. O rastreamento de linhagem pode revelar novas informações sobre o comprometimento da linhagem, a resposta à intervenção e a multipotência.

Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

Aprenda a medir a atividade da telomerase em tecido cerebral normal usando o ensaio TRAP não radioativo. Este método eficiente permite comparar regiões cerebrais e detectar diferenças entre sexos em camundongos.

A atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: A telomerase não-radioativo Repetir Amplification Protocol (TRAP) Assay (Vídeo) | JoVE Journal

A atividade da telomerase nas diversas regiões de cérebro de camundongo: A telomerase não-radioativo Repetir Amplification Protocol (TRAP) Assay

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