Utilização de microscópicos de silício Cantilevers para avaliar a função celular contrátil In Vitro

O objetivo do presente experimento é medir a atividade contrátil de fibras musculares cultivadas em resposta à estimulação em ambiente controlado in vitro. Isso é conseguido através do revestimento de células musculares dissociadas em cantilevers de silício em microescala e induzindo a fusão dessas células mononucleadas para formar fibras denominadas tubos myo. Esses chips cantilever que suportam células musculares diferenciadas são então transferidos para um microscópio de eletrofisiologia modificado para suportar um laser e fotodetector usado para medir a deflexão do cantilever em resposta à contração muscular após a colocação do chip na plataforma.

O laser é posicionado de forma que se concentre na ponta do cantilever e o fotodetector também é alinhado para captar o feixe desviado São obtidos resultados que mostram o grau de deflexão do cantilever, que é causado pela contração muscular em resposta ao tratamento elétrico ou químico, fornecendo uma medição direta do perfil de contração das células semeadas em tempo real. Em última análise, o deslocamento do cantilever pode ser processado para fornecer uma leitura da força. Este sistema é multiplexado para fornecer um potencial banco de testes de alto rendimento para avaliação de alterações na função contrátil em resposta a protocolos de tratamento medicamentoso, doença, estado ou exercício.

A principal vantagem dessa técnica em comparação com os métodos existentes, como a eletrofisiologia do patch clamp, é que esse método de análise funcional não é invasivo e facilmente adaptável para estudos de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento de medicamentos, como a identificação de concentrações apropriadas de resposta à dose antes da avaliação clínica. As implicações desta técnica se estendem à terapia de múltiplas doenças musculares porque fornece meios para investigar o desempenho funcional de células de diferentes fenótipos patológicos Em tempo real, porém, esse método pode fornecer informações sobre patologias do músculo esquelético esquelético.

Também pode ser usado para outros sistemas de tecidos, como músculo cardíaco e liso, chips cantilever esterilizados e previamente preparados e lamínulas de 13 F em solução de etanol a 70% e deixar secar ao ar em uma capa de fluxo. Em seguida, coloque cavacos cantilever individuais em cima de lamínulas de 13 F. Dentro de uma placa padrão de 12 poços, reveste os cantilevers com o biopolímero ou modificação de superfície otimizada para o tipo de célula que está sendo usado De acordo com os protocolos padrão de cultura de células, o revestimento da superfície leva 30 minutos usando nosso método de preparação, mas pode ser alterado dependendo do protocolo de cultura específico do investigador.

Reese tem sido as células em seu meio de crescimento específico para a concentração desejada, em seguida, cem microlitros da suspensão celular na superfície do chip cantilever, garantindo que a bolha do meio cubra totalmente as janelas cantilever. Transfira a placa que contém os chips para uma incubadora e deixe as células aderirem por pelo menos uma hora após esse período de plaqueamento. Use uma pinça estéril para transferir o cavaco para um poço limpo sem uma lamínula de 13 F e adicione um mililitro de meio de crescimento a cada um.

Bem, devolva a placa à incubadora, mantenha as células de acordo com seu protocolo padrão para manutenção in vitro. Em lamínulas, coloque uma placa de cultura aquecida no palco de um microscópio de eletrofisiologia vertical. Adicione três mililitros do meio de alimentação celular atual ao microscópio aquecido.

Eletrodos de aço inoxidável montados em platina no interior da placa de cultura aquecida a uma distância de separação de 15 milímetros. Conecte-os a um gerador de pulsos capaz de produzir estimulação de campo, pulsos de intensidade, frequência e forma de onda variadas para permitir que o sistema produza estimulação de campo das células quando apropriado. Aparafuse um laser de néon de hélio montado em estágios de translação XY na parte inferior da mesa do microscópio.

Em seguida, ajuste o laser de modo que o feixe de laser seja direcionado através da base da placa de cultura aquecida em um ângulo de 30 graus em relação ao plano do cantilever. Em seguida, um módulo detector de fotos de quadrante montado em estágios de translação XY na parte inferior do estágio do microscópio. Ajuste sua posição para que o feixe de laser refletido caia no centro dos quatro quadrantes.

Escreva um programa de software para controlar os atuadores lineares que varrem os cantilevers com referência ao fluxograma fornecido no protocolo de texto. Ligue o hardware de análise de cantilever e o software associado. Insira o aquecido stage ther mrta no meio e espere que ele marque 37 graus Celsius.

Em seguida, insira o chip cantilever no stage com os cantilevers orientados para o lado direito do stage. Ligue a fonte de luz do microscópio. Foque o microscópio para trazer as bordas dos cantilevers à vista e use o software de controle do fotodetector a laser para posicionar o feixe de laser na ponta do cantilever, supondo que os cantilevers estejam orientados à direita do cantilever do palco.

Um é aquele posicionado no canto superior esquerdo da matriz e os números descem até 16. No canto inferior esquerdo. O cantilever 17 está na posição superior direita e vai até 32.

No canto inferior direito, pressione play no software de gravação. Posicione o fotodetector de forma que o sinal seja zero nos quadros x e y, ajustando os motores de passo que controlam o fotodetector. Em seguida, defina a posição do cantilever no software de controle do detector de fotos a laser.

Em seguida, mova o laser para a ponta do cantilever 16. Repita o posicionamento do fotodetector e defina a posição do cantilever 16 no software de controle do fotodetector a laser. Agora mova o laser para a ponta do cantilever 32.

Repita o posicionamento do fotodetector e defina a posição do cantilever 32 no software de controle do fotodetector a laser. Por fim, mova o laser para a ponta do cantilever 17. Repita o posicionamento do fotodetector e defina a posição do cantilever 17 no software de controle do fotodetector a laser.

Desligue a fonte de luz do microscópio e, em seguida, a luz do teto no laboratório. Pressione gravar no software de gravação. Defina o hardware do gerador de pulsos para pulsos de 40 milissegundos e cinco volts, uma frequência de um hertz.

Em seguida, ligue a máquina Usando o software de controle do detector de fotos a laser, configure o hardware para escanear a matriz de 32 cantilever. Parando por cinco segundos em cada um. Quando a varredura dos 32 cantilevers estiver concluída, desligue o estimulador.

Em seguida, pare o software de gravação e abra o arquivo de dados. Examine o traço registrado de cada balanço. Para evidência de atividade contrátil.

Uma contração é definida como um pico. Se a deflexão for pelo menos 0,1 volts acima da linha de base, anote cada cantilever com respostas positivas. Remova quaisquer cantilevers que não respondem do protocolo de varredura no software de controle do detector de fotos a laser.

Os cantilevers ativos podem então ser reescaneados sem estimulação para obter uma leitura da atividade contrátil espontânea da célula. Em seguida, adicione um composto terapêutico ao meio para observar seu efeito na produção funcional das células cultivadas. Após a adição de varreduras compostas, com ou sem estimulação elétrica de campo amplo, realize avaliações de fadiga estimulando eletricamente as células por longos períodos, seguidas de níveis de contratilidade para medir quanto tempo leva para que a força de pico caia abaixo de um limite específico.

Em experimentos em que os neurônios motores são mantidos em co-cultura com a medida muscular, a formação da junção neuromuscular por meio do tratamento de coculturas de co-cantilever de tubo neuro neuro motor com um estimulante neuronal ou inibidor sináptico e a varredura de aumentos e diminuições na atividade espontânea, prossiga para analisar os dados de deflexão do cantilever, conforme detalhado no protocolo de texto. A cultura bem-sucedida de células contráteis em cantilevers é um procedimento relativamente simples usando técnicas padrão de cultura de células. O software eletrofisiológico padrão pode ser usado para analisar os dados brutos, facilitando o cálculo de propriedades funcionais relevantes, como tempo de força de pico a força de pico e tempo de meio relaxamento.

Protocolos de estimulação estendidos fornecem os meios para avaliar as taxas de fadiga em células cultivadas, ampliando assim o nível de dados fisiológicos obtidos desse sistema. O sistema de cultura cantilever pode ser modificado para incluir neurônios motores no sistema de cultura com mio tubos do músculo esquelético, de modo a permitir a avaliação da formação de sinapses neuromusculares in vitro. Em tais culturas, as taxas de atividade contrátil espontânea são comparadas às taxas de contração em resposta ao tratamento com um estimulante específico para neurônios, como o glutamato.

Quaisquer aumentos observados induzidos pelo glutamato nas taxas de contração sugerem a ativação de neurônios cultivados levando à liberação de acetilcolina e subsequente ativação do tubo mio O tratamento com inibidores sinápticos, como o bloqueador do receptor de acetilcolina, dtu rine que levam à cessação da atividade induzida pelo glutamato fornece mais evidências da presença de sinapses neuromusculares funcionais nessas culturas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar cantilevers de silício em microescala para avaliar as propriedades funcionais do músculo esquelético cultivado.