Plataforma Ar levantou Flat-pavimentado: Um Novo Método para Combinando Comportamento com Microscopia ou Eletrofisiologia em Awake Roedores movendo-se livremente

Olá, sou Hel Lin, estudante de pós-graduação no Near Science Center, da Universidade de Helsinque. Hoje, meus colegas e eu mostraremos como realizar gravações ópticas e eletrofisiológicas em animais de cabeça acordada, mas em movimento livre e comportados. Nosso método cria um ambiente tangível e familiar para o mouse navegar e explorar.

Durante imagens microscópicas ou registros eletrofisiológicos de célula única, que requerem fixação firme da cabeça do animal, implantamos uma janela craniana crônica e habituamos o camundongo a uma gaiola de casa móvel transportada por via aérea, que desliza sob os pés do animal. Durante a locomoção em uma superfície plana, a gaiola da casa móvel pode ser posicionada sob um microscópio vertical padrão para imagens de dois fótons ou colocada em uma eletrofisiologia configurada para gravações de patch clamp em um cérebro de camundongo acordado. Todos os procedimentos experimentais aqui apresentados foram aprovados pelo comitê de ética local.

Implantamos janelas cranianas de acordo com os protocolos publicados com pequenas modificações após o implante da janela craniana. O animal pode se recuperar por pelo menos duas ou três semanas durante esse período de recuperação, a janela normalmente recupera sua transparência. Animais com quaisquer sinais de inflamação pós-operatória residual são excluídos dos experimentos.

Treine os animais selecionados para um estudo para habituá-los à fixação da cabeça. Na gaiola da casa móvel, manuseie o mouse com calma por cinco a 10 minutos, evitando movimentos bruscos e ruídos, depois devolva-o à gaiola da casa. Repita o procedimento duas ou três vezes em intervalos desiguais.

A gaiola da casa móvel permite a fixação da cabeça sem anestesiar o animal antes da fixação da cabeça. Use um pano para enrolar o mouse duas ou três vezes em intervalos desiguais. Certifique-se de que o animal permaneça calmo enquanto estiver embrulhado.

Caso contrário, repita o procedimento até que o mouse esteja totalmente habituado a ele. Comece o treinamento duas vezes ao dia dos ratos na gaiola da casa móvel no dia seguinte após a conclusão do manuseio. Pesar os animais antes de cada sessão de treino.

Os animais que apresentem perda de peso superior a 10% devem ser excluídos do estudo. Ajuste a posição do braço de fixação da cabeça para corresponder ao tamanho do animal treinado. Conecte a entrada de ar do dispositivo de gaiola de casa móvel à saída de ar pressurizada padrão do laboratório.

Certifique-se de que a pressão do ar seja suficiente para a flutuação livre da gaiola doméstica transportada por ar. Comece o treinamento de animais habituados na gaiola da casa móvel. Imobilize o mouse envolvendo-o no pano.

Insira o suporte de metal preso à cabeça do animal no braço de fixação da cabeça e fixe-o firmemente apertando os parafusos. Ligue o fluxo de ar para fazer a gaiola doméstica transportada levitar. Remova o pano e deixe o mouse explorar a gaiola doméstica.

Durante a primeira sessão de treinamento, os camundongos podem apresentar comportamento de congelamento e tremor e ereção da cauda. Para habituar o animal ao ruído, forneça uma exposição constante aos sons ambientes usando, por exemplo, uma tradução de rádio ou música e fala gravadas durante todas as sessões de treinamento, bem como durante os experimentos. Para evitar o estresse crônico, use iluminação de luz brilhante durante a primeira hora da sessão de treinamento.

Após a primeira hora, faça o treinamento no escuro e use uma câmera infravermelha próxima para monitorar o comportamento do animal. Quando a sessão de treinamento estiver concluída, solte o animal do braço de fixação da cabeça perdendo os parafusos. Retorne o animal de volta à gaiola de origem por pelo menos duas horas antes da próxima sessão de treinamento.

Manter o mouse em uma gaiola com dois ou mais outros ratos diminuirá o nível de estresse. Opcionalmente, você pode colocar a gaiola transportada junto com o animal em sua gaiola doméstica. Isso enriquecerá o ambiente e poderá reforçar a habitação do animal na gaiola da casa móvel.

Durante a última sessão de treinamento, os ratos estão habituados à fixação da cabeça e devem exibir um comportamento sem estresse navegando calmamente ao redor da gaiola doméstica transportada por ar. Na ausência de luz visível, a trajetória da locomoção do rato pode ser rastreada monitorando os movimentos da gaiola com uma câmera infravermelha próxima ou com um mouse óptico de computador. Durante sessões de treinamento prolongadas que duram mais de uma ou duas horas, considere fornecer água potável ao mouse, manualmente ou usando um porta-pipeta preso à estrutura da gaiola da casa móvel.

O diagrama a seguir resume a linha do tempo de um estudo experimental típico. O estudo começa com a implantação da janela craniana duas semanas antes do manuseio do camundongo e continua com oito sessões de treinamento duas vezes ao dia. O estudo típico inclui várias sessões de imagem ou sessões de gravação de patch clamp que são espaçadas em um intervalo de algumas horas a vários dias ou semanas.

Experimentos ópticos e eletrofisiológicos podem ser feitos em paralelo com estímulos e leituras cognitivas ou comportamentais. A microscopia de dois fótons é uma tecnologia óptica não linear exclusiva que permite a visualização em tempo real de estruturas celulares e até subcelulares em camadas corticais profundas do cérebro de um roedor. Para realizar um experimento de imagem microscópica de dois fótons, coloque um animal treinado na gaiola da casa móvel, ajuste as rolhas para proteger a óptica do microscópio contra danos acidentais.

Limpe a lamínula da janela craniana para remover partículas de poeira. Coloque um fluido de imersão na lamínula. Recomendamos o uso de solução de víscera porque a água evapora rapidamente.

A plataforma pode ser colocada em cima de uma mesa óptica motorizada típica usando o modo de campo amplo do microscópio de fluorescência e um filtro de emissão de passagem longa. Avalie a vasculatura cerebral e selecione uma região de interesse. Para a imagem da vasculatura cortical injetar na veia da cauda de um animal fixo e imobilizado na cabeça, um texto conjugado vermelho de 70 quilos Dalton, Texas Tran.

Esta sequência de imagens mostra uma gravação de lapso de tempo de locais e artérias no córtex de um camundongo que se comporta enquanto navega ao redor da gaiola da casa móvel. Ao traçar o perfil das linhas traçadas no lúmen do vaso, pode-se medir as mudanças no diâmetro do vaso e a motilidade de segmentos individuais do vaso. A taxa de fluxo sanguíneo nas artérias e veias pode ser medida por varredura de linha ao longo das linhas traçadas paralelamente à parede do vaso. Multa.

Detalhes da morfologia dos neurônios podem ser visualizados em camundongos transgênicos que expressam YFP na subpopulação de neurônios sob o promotor de Taiwan. Esses dois Zacks comparam a estabilidade de imagem entre animais anestesiados e acordados. O painel do lado direito mostra dendritos do animal anestesiado com a mistura de cetamina xilazina.

Enquanto o painel do lado esquerdo mostra uma imagem de dendritos em um animal acordado andando em torno de uma gaiola de casa móvel. A morfologia individual da coluna vertebral em animais acordados pode ser analisada com a mesma confiabilidade e precisão que nos camundongos anestesiados. O deslocamento do cérebro durante a corrida dos animais normalmente não excede um a um micrômetro e meio.

Esses movimentos ocorrem nas direções horizontais e muito raramente resultam em um deslocamento do plano de imagem, tornando desnecessária a correção de artefatos de movimento. Na maioria dos casos, a capacidade de monitorar cronicamente a atividade neuronal no cérebro vivo acordado é essencial para entender a organização e a função do sistema nervoso. Usando o tie one G Camp três camundongos transgênicos, visualizamos a atividade neuronal espontânea nos camundongos acordados que se comportam na gaiola da casa móvel.

Esta sequência de imagens de lapso de tempo mostra exemplos representativos de picos de cálcio em corpos celulares neuronais, nites e axônios. A imagem óptica baseada em sinais intrínsecos permite mapear a distribuição espacial de domínios funcionais para realizar um experimento de imagem óptica intrínseca. Coloque o animal treinado na gaiola doméstica posicionada sob a objetiva da câmera.

Limpe a lamínula da poeira. Coloque uma gota de glicerol e cubra-a com uma lamínula redonda de cinco milímetros. Ajuste a posição de uma câmera de alta velocidade.

Coloque um manipulador com um tubo de sopro de ar oposto à vibração contralateral. Use luzes verdes para criar imagens do mapa da embarcação. Concentre-se mais profundamente no córtex, aproximadamente 400 micrômetros abaixo dos vasos corticais.

Coloque um filtro passa-banda na frente da câmera e ilumine o córtex com uma luz vermelha. Deixe o mouse adotar a plataforma por pelo menos 30 minutos. Registre a atividade de linha de base durante um episódio de seis minutos.

Estimule a vibração a cada 10 segundos com sopros de ar pelo período total de seis minutos. Esta imagem ilustra a atividade neural se propagando ao longo do córtex somatossensorial em resposta à estimulação vibratória na frequência de 0,05 hertz. Para realizar registros eletrofisiológicos de célula única, coloque o animal treinado implantado com uma janela craniana invertida na gaiola da casa móvel.

Lenta e cuidadosamente, remova a lamínula do suporte de metal. Atualize o tampão cortical e limpe a janela craniana de detritos com um tampão hemostático. Coloque o eletrodo de aterramento no tampão cortical.

Encha a pipeta de grampo de remendo com solução intracelular. Aplique uma pressão positiva na pipeta de registro usando um micromanipulador motorizado, aprofunde a pipeta no córtex e obtenha um contato de giga selo com a célula de interesse. Após a gravação, remova a pipeta, atualize o tampão cortical e feche a janela craniana com cola em uma lamínula no suporte de metal.

O uso de uma gaiola doméstica transportada por via aérea permite combinar imagens e eletrofisiologia com paradigmas comportamentais clássicos, como aprendizado, reabilitação ou comportamento relacionado à ansiedade. O olfato é uma importante entrada sensorial para camundongos e pode ser usado para estimulação em testes de memória e para avaliação da reação à novidade. Para realizar um teste de habituação disolfativa, coloque o animal treinado na gaiola da casa móvel e deixe-o adotar.

Por 30 minutos, prenda um pedaço de algodão limpo embebido em água da torneira na parede interna da gaiola da casa móvel usando uma fita adesiva de dois lados. Após cinco minutos, substitua o algodão limpo na parede da gaiola doméstica por um novo embebido em um líquido contendo o cheiro de baunilha. Repita as exposições de cinco minutos ao cheiro de baunilha três vezes com intervalos de cinco minutos entre as sessões.

Para medir o nível de interesse pelo cheiro. Conte o tempo acumulado que o animal passa de frente para a zona-alvo e o tempo total de movimento da gaiola da casa móvel. Durante a última quinta sessão, apresentar um cheiro socialmente significativo.

Molhe o novo aplicador de algodão com algumas gotas de urina de camundongos do sexo oposto. Para avaliar a reação à novidade, divida a gaiola da casa móvel em quatro zonas. Prenda duas peças de algodão opostas uma à outra. Cor.

Codifice-os com marcadores no lado externo das paredes da gaiola doméstica durante o primeiro teste. Coloque dois pedaços de algodão limpos. Em seguida, substitua os dois por algodão embebido em 1% de extrato de baunilha.

Durante o terceiro teste, coloque o algodão de baunilha na zona número um e o pedaço de algodão embebido em 1% de extrato de banana na zona. Número dois, para medir a preferência por nenhum cheiro. Calcule o tempo que os animais passam enfrentando o sem cheiro como porcentagem do tempo acumulado voltado para outras zonas.

Olá, sou Leo Kiro, investigador principal do Centro de Neurociências da Universidade de Helsinque. Espero que você tenha gostado de assistir ao vídeo e o tenha achado útil. Temos trabalhado com dupla microscopia in vivo nos últimos cinco anos, e o uso de geral e estética sempre foi uma grande preocupação porque uma estética interfere na função cerebral, no fluxo sanguíneo e tudo mais.

E hoje estou feliz por podermos trabalhar em animais acordados e realizar experimentos de imagem microscópica estáveis e validar e verificar os resultados que obtivemos anteriormente em animais anestesiados. Tenho certeza de que o uso de gaiolas para casas móveis e os métodos que apresentamos hoje aumentarão a relevância da pesquisa in vivo em geral e levarão a resultados novos e inovadores, e estou ansioso por isso.