Name: Plataforma Ar levantou Flat-pavimentado: Um Novo Método para Combinando Comportamento com Microscopia ou Eletrofisiologia em Awake Roedores movendo-se livremente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Aprenda a realizar gravações ópticas e eletrofisiológicas em camundongos acordados e livres para se mover, utilizando uma gaiola móvel elevada por ar. Este método permite microscopia de dois fótons e patch clamp em comportamento natural.

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Os autores agradecem a Prof Eero Castren por seus valiosos comentários sobre o manuscrito. O trabalho é apoiado por subsídios da Academia da Finlândia, Centro de Mobilidade Internacional da Finlândia, eo finlandês Graduate School of Neuroscience (Mente Cérebro e Programa de Doutorado).

<ol><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329, 959-964 (2010).</li>
<li>Sitdikova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+suppresses+early+cortical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+and+Translational+Neurology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane suppresses early cortical activity.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).</li>
<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+high-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31, 903-912 (2001).</li>
<li>Piyawattanametha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+brain+imaging+using+a+portable+2.9+g+two-photon+microscope+based+on+a+microelectromechanical+systems+scanning+mirror%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+letters%22%5BJournal%5D)">In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror.</a> Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).</li>
<li>Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visually+evoked+activity+in+cortical+cells+imaged+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).</li>
<li>Fee, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+stabilization+of+electrodes+for+intracellular+recording+in+awake+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals.</a> Neuron. 27, 461-468 (2000).</li>
<li>Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+imaging+of+ongoing+neuronal+activity+in+the+visual+cortex+of+awake+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats.</a> Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).</li>
<li>Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reinforcing+operandum%3A+rapid+and+reliable+learning+of+skilled+forelimb+movements+by+head-fixed+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents.</a> Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).</li>
<li>Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Resolution+Functional+Imaging+in+Behaving+Rats+Using+Voluntary+Head+Restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint.</a> Neuron. 80, 371-384 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).</li>
<li>Parry, T. J., McElligott, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+restraining+awake+rats+using+head+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Physiolog+%26+behavior%22%5BJournal%5D)">A method for restraining awake rats using head immobilization.</a> Physiolog & behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).</li>
<li>Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whisker+movements+evoked+by+stimulation+of+single+pyramidal+cells+in+rat+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex.</a> Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).</li>
<li>Van Looij, M. A. J., Liem, S. -S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+conventional+anesthesia+on+auditory+brainstem+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice.</a> Hearing research. 193, 75-82 (2004).</li>
<li>Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+is+the+major+target+of+sedative+concentrations+of+volatile+anaesthetics%3A+strong+depression+of+firing+rates+and+increase+of+GABAA+receptor-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition.</a> The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).</li>
<li>Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo%2C+low-resistance%2C+whole-cell+recordings+from+neurons+in+the+anaesthetized+and+awake+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain.</a> Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).</li>
<li>Crochet, S., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+whisker+behavior+with+membrane+potential+in+barrel+cortex+of+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice.</a> Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).</li>
<li>Houweling, A. R., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+report+of+single+neuron+stimulation+in+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex.</a> Nature. 451, 65-68 (2008).</li>
<li>Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+brain+state+regulates+membrane+potential+synchrony+in+barrel+cortex+of+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice.</a> Nature. 454, 881-885 (2008).</li>
<li>Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+stereotaxic+recordings+of+neuronal+activity+in+awake%2C+head-restrained+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice.</a> Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).</li>
<li>De Kock, C. P. J., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiking+in+primary+somatosensory+cortex+during+natural+whisking+in+awake+head-restrained+rats+is+cell-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+signals+rapidly+switch+tactile+processing+in+rat+barrel+cortex+during+whisker+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements.</a> Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).</li>
<li>Stüttgen, M. C., Rüter, J., Schwarz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+psychophysical+channels+of+whisker+deflection+in+rats+align+with+two+neuronal+classes+of+primary+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents.</a> J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).</li>
<li>Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+activity+in+barrel+cortex+underlying+vibrissa-based+object+localization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice.</a> Neuron. 67, 1048-1061 (2010).</li>
<li>Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuating+and+sensory-induced+vasodynamics+in+rodent+cortex+extend+arteriole+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461, 941-946 (2009).</li>
<li>Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O’Keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+vision+and+movement+combine+in+the+hippocampal+place+code%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">How vision and movement combine in the hippocampal place code.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).</li>
<li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neocortical+Neurons+through+a+Chronic+Cranial+Window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).</li>
<li>Garaschuk, O., Milos, R. -I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).</li>
<li>Barry, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JPCalc%2C+a+software+package+for+calculating+liquid+junction+potential+corrections+in+patch-clamp%2C+intracellular%2C+epithelial+and+bilayer+measurements+and+for+correcting+junction+potential+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements.</a> Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).</li>
<li>Golshani, P., Gonçalves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internally+mediated+developmental+desynchronization+of+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity.</a> The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).</li>
<li>Polack, P. -O., Friedman, J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+brain+state-dependent+gain+modulation+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex.</a> Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).</li>
<li>Schwarz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+head-fixed+behaving+rat--procedures+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosensor.%2C+%26+motor+research%22%5BJournal%5D)">The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls.</a> Somatosensor., & motor research. 27, 131-148 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Para entender melhor a fisiologia do cérebro e da patologia, a pesquisa deve ser realizada em uma variedade de níveis de complexidade de preparação, utilizando as técnicas mais adequadas para cada preparação. Neste momento, uma grande variedade de metodologias de neurociência (de corpo inteiro fMRI para microscopia STED sub-organela) são facilmente aplicada aos animais anestesiados, enquanto experiências em animais acordados e se comportando ter representado um desafio metodológico significativo. Aqui, uma nova abordagem é descrita em um animal de laboratório, apesar de ser firmemente cabeça-fixados, pode mover-se em torno de um homecage móvel levantada ao ar e explorar seu ambiente tangível em condições livres de estresse. A preparação de animais se comportando fixo-cabeça apresentado aqui fornece uma série de vantagens cruciais. Primeiro, os dados eletrofisiológicos ou de imagem obtidos com este método são descomprometido nem pela anestesia nem por estresse induzido por constrangimento. Posicionamento do mouse para a casa móvelgaiola é rápido e não requer anestesia do animal, mesmo transitoriamente. Em segundo lugar, o homecage levantou-air garante a estabilidade mecânica necessária para quantificar alterações na morfologia neuronal bem e para gravar a atividade eletrofisiológica de uma única célula em animais acordados. Finalmente, o design do homecage móvel é mais compacta em comparação com a esteira esférica, permitindo assim o posicionamento da homecage móvel sob um microscópio vertical padrão para imagens de dois fótons ou gravação de patch-clamp no cérebro acordado do mouse. Fixação Firm cabeça na homecage móvel requer a implantação de um suporte de metal de quatro asas especialmente projetado, com uma rodada de abertura no centro para acesso óptico ou elétrico para a região cerebral subjacente. Estes suportes metálicos são ligados ao crânio por meio de uma combinação de cola, cimento dentário e um pequeno parafuso aparafusado no osso do crânio. Este procedimento cirúrgico foi desenvolvido com base em um grande número de anteriormenteprocedimentos publicados, e verificou-se resultar em uma janela craniana preparação estável e reprodutível. Para experimentos in vivo eletrofisiológicos, uma janela em forma de lua 34, uma pequena craniotomia tamanho (menos de 0,5 mm) 32, e uma preparação coberto de vidro perfurado 35 têm sido utilizados. Aqui, a janela craniana &quot;invertido&quot; foi implantado com qualquer uma grande (3.5 mm de diâmetro) ou pequena (menos de 0,5 mm de diâmetro) a craniotomia. Minimizando movimento cérebro é fundamental para gravações unicelulares estáveis, o que é por isso que é aconselhável realizar pequenas craniotomias tamanho para experimentos eletrofisiológicos. Após a implantação da janela craniana para experiências de imagiologia óptica, os animais são deixados a recuperar durante pelo menos 2 ou 3 semanas, durante o qual período a janela primeiro transitoriamente perde a sua transparência e, em seguida, recupera-lo (com um rendimento de 50-70%, dependendo o fundo genético da estirpe do rato). Transparência da janela craniana e stabildade do cimento dental &quot;cap&quot; anexado ao crânio pode ser verificada por meio de um microscópio binocular regular e inspeção física durante o manuseio do animal. No final do período de recuperação de 2-3 semanas, os animais que apresentam sinais de inflamação pós-operatório residual ou defeitos mecânicos na cimento dental deve ser excluída dos experimentos e terminada. A idade ideal para iniciar o treinamento dos ratos é de 2-4 meses (correspondentes ao peso corporal de 20-40 g). Em animais jovens, a ancoragem do cimento dental &quot;cap&quot; no crânio podem não ser confiáveis, o que pode diminuir a sua resistência ao estresse mecânico que é imposta pela locomoção do mouse fixo-cabeça na homecage móvel. Embora os ratos machos e fêmeas parecem igualmente dispostos para navegar em homecage móvel, há uma tendência para atingir melhor percentagem de janelas cranianos recuperar a sua transparência nos ratinhos fêmea (dados não mostrados). Assim, a fim to assegurar uma combinação equilibrada de gêneros no grupo de animais selecionados para a imagem latente, implantando janelas cranianas em aproximadamente 30% os ratos mais macho é recomendado. As interações sociais são conhecidos por melhorar o bem-estar dos animais e reduzir o estresse, por isso é aconselhável que ninhada são operados e treinados em paralelo e mantidos juntos em gaiolas de estabulação. Em contraste com os processos publicados para a preparação esteira esférica 13, o método que utiliza o homecage móvel não requer anestesia no ratinho, no momento da fixação da cabeça. Esta diferença é importante porque permite a descartar quaisquer efeitos residuais que mesmo uma breve e &quot;light&quot; episódio anestesia é provável que tenha nas medições fisiológicas obtidas logo após. Na verdade, mesmo que nos estudos onde a fixação cabeça foi feito sob anestesia e os experimentos reais foram iniciados após um breve período de espera 13, não se podeexcluir possíveis efeitos de longa duração do episódio breve anestesia sobre os dados experimentais. Outros estudos têm contado com privação de água para habituação sistemática dos animais a cabeça de fixação e usado recompensa água como meio de motivar o animal a permanecer imóvel 36. No entanto, o método de fixação de cabeça à base de recompensa limita a escolha dos testes comportamentais aplicáveis ​​e, mais importante, ocupa uma das associações estímulo-recompensa bem estabelecidos. Em contraste, o método de rato habituação a cabeça fixação em homecage móvel não exige a privação de água e recompensa subseqüente. Completando o homecage móvel com um sistema de distribuição de água é recomendado para experimentos de longa duração. As sessões de treinamento de animais e experimentos apresentados aqui foram feitas durante o dia (oito horas - seis horas), o que corresponde ao período fisiologicamente passiva para aqueles ratos que são mantidos sob a luz padrão horário de 12 horas (liGHTS on às 6 da manhã e desligar às 6 da tarde). Uma vez que a ingestão de água está diretamente associada com a atividade do mouse, durante os ratos período passivo não necessitam de fornecimento de água, se a duração de uma sessão de formação / imagem / gravação não exceda 2 horas. Além do tempo e duração das sessões de treinamento, é preciso resolver a questão do número ideal de sessões necessárias para habituar os animais para homecage móvel. Para este fim, foram utilizados dois critérios para avaliar a tensão induzida por processos de fixação de cabeça: i) perda de peso, e ii) a nível da actividade locomotora. Como mostrado na Figura 6, a perda de peso atinge o nível médio de 6% no dia 2 de formação, e é completamente invertido por dia de formação 4 (Figura 6A). De forma consistente com a dinâmica de pesagem, o nível de animais fixo de cabeça actividade locomotora é suprimida no primeiro dia de treino, mas estabiliza por dia de formação 4 (Figura 6D). Com base nestas medições, sugestõest que a duração mínima do período de formação do rato em homecage móvel é de 4 dias, como descrito no protocolo ora. O uso do, homecage móvel plana com piso levantado ao ar permite adicionar tarefas complexas (sensório-motoras, de percepção, e cognitivos) para os paradigmas de formação para os ratos fixo-cabeça. No presente estudo, dois protocolos de testes comportamentais são apresentados. Ambos os protocolos utilizar pistas de odor e pode ser combinado com longitudinais de imagem / gravações no córtex mouse. Embora o homecage móvel é fabricado a partir de materiais não absorventes, ainda precisa levar em conta possíveis interferências entre o cheiro do dispositivo e odor (s) de teste. Outro fator que pode interferir com / dicas táteis visuais de um experimento comportamental é a junção entre a parede ea inserção, o que não é perfeita e pode, portanto, ser percebido pelo animal como um marco. É importante notar aqui que, a fim de minimizar o sofrimento do animal durante tal interventions como a colocação de um algodão que apresenta odor à parede homecage móvel, o experimentalista deve praticar para realizar este tipo de intervenções, tão rapidamente quanto possível e evitar manipulação prolongada da gaiola de carbono. As estratégias alternativas para nova apresentação cheiro / objecto são concebíveis, por exemplo, colocação de uma solução à base de hidrogel de gotas ou objectos (tais como chips de alimento) em pequenas prateleiras fixados à superfície interna da parede da gaiola de carbono na altura compatível com o posicionamento da cabeça do animal. Homecage Mobile permite animais fixo-cabeça para executar uma ampla gama de movimentos bidimensionais incluindo locomoção horizontal, situp, higiene, mexendo, lambendo, nariz-cutucando, os movimentos das patas dianteiras qualificados, e tocar parede com membros anteriores, como ilustrado no presente estudo . Usando homecage móvel e os protocolos aqui apresentados, os pesquisadores podem estudar o sistema sensório-motor neuronal com um alto nível de controle sobre tanto a condição estimulaçãos e as comportamentais de leitura-outs. Além disso, estudos de habilidades cognitivas em camundongos despertos pode ser realizada durante condicionado, navegação espacial e as tarefas de tomada de decisão. Existem várias limitações práticas deste método. Em primeiro lugar, uma quantidade significativa de ar pressurizado é necessário para atingir o poder de elevação homecage e para realizar experiências de longa duração. Em segundo lugar, o homecage móvel na sua actual aplicação é de apenas 18 cm de diâmetro, e, por conseguinte, fornece um relativamente pequeno e simples, em comparação com o espaço de realidade virtual, onde um ambiente experimental complexo pode ser concebido sem quaisquer restrições espaciais. Em terceiro lugar, durante a estimulação bigode e experimentos baseados em recompensa aqui apresentados, um dispositivo foi utilizado, que limita a possibilidade do contato de parede para o mouse. A adição de um canal de estimulação visual ou sensorial externo (como um projetor de luz olho-dirigida) exigiria a concepção de um dispositivo mais ergonômico e compacto em comparação comas soluções de ecrã múltiplo ou cúpula de projeção que foram utilizados nos experimentos de esteira esféricas. Em resumo, a utilização dos ratinhos fixo de cabeça que se deslocam no homecage móvel levantado ao ar facilita grandemente os estudos que combinam os níveis celulares, moleculares e comportamentais de observação e manipulação numa única experiência. As aplicações específicas ilustradas aqui incluem dois fótons de imagem microscópica, intrínseca sinal óptico de imagem e gravação de patch-clamp em camundongos comportando não anestesiados. Espera-se que esta abordagem irá abrir novos horizontes em experimentação sobre acordado, rato comportar e servir como uma ferramenta útil tanto para o desenvolvimento de medicamentos e pesquisa básica da função cerebral.

Uma tendência recente emocionante nas Neurociências é desenvolver abordagens experimentais para celular e molecular sondagem de redes neuronais no cérebro de acordado, comportando roedores. Tais abordagens promissoras para lançar uma nova luz sobre os processos neurofisiológicos subjacentes a função motora, a integração sensório-motora, percepção, aprendizagem, memória, bem como progressão lesão, neurodegeneração e doenças genéticas. Além disso, a gravação do cérebro acordado do animal é uma promessa para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e tratamentos. Há uma consciência crescente de que a anestesia, o que tem sido comumente utilizados em experimentos neurofisiológicos, pode afetar os mecanismos básicos de funcionamento do cérebro, podendo levar a uma interpretação errônea dos resultados experimentais. Assim, o anestésico cetamina amplamente utilizado aumenta rapidamente a formação de novas espinhas dendríticas e melhora a função sináptica 1; outro anestésicos utilizadaic isoflurano em níveis anestesia cirúrgica suprime completamente a atividade cortical espontânea em ratos recém-nascidos e bloqueia oscilações do eixo-burst em animais adultos 2. Actualmente, apenas um número limitado de abordagens permitir experimentos em camundongos não anestesiados por meio de dois fótons de imagem microscópica ou gravações de patch-clamp. Estas abordagens podem ser divididas em preparações livremente móveis e fixas de cabeça. A atracção única de uma preparação de animais movimento livre é que ele permite a avaliação do comportamento natural, incluindo os movimentos do corpo inteiro durante a navegação. Uma forma de imagem dentro do cérebro de um roedor movendo-se livremente é anexar um microscópio montado na cabeça miniaturizada ou fiberscope 3-5. No entanto, os dispositivos miniaturizados tendem a ter um desempenho óptico limitada em comparação com a microscopia à base objectivo de dois fotões, e não pode ser facilmente combinado com as gravações de células inteiras de patch-clamp 6. A exisoluções picada para fixação de cabeça um roedor acordado têm se baseou principalmente na contenção física ou 7,8 ou em treinar o animal para exibir apoio de cabeça voluntária 9. Outra abordagem popular é o de permitir que membros do animal para se mover, colocando-o em, por exemplo, um tapete rolante esférica 10; esta abordagem é muitas vezes combinado com a realidade virtual gerado por computador. Experimentos eletrofisiológicos em ratos fixo-cabeça têm usado principalmente gravações extracelular e foram usados ​​para estudar regulação central da função cardiovascular 11, os efeitos da anestesia sobre a atividade neuronal 12, a resposta auditiva no tronco encefálico 13 e processamento de informação 14. As gravações pioneiras intracelulares / celulares totais em animais se comportando acordado foram realizados na década de 2000 e têm-se centrado sobre a atividade neural relacionada à percepção e movimento 15-20. Ao mesmo tempo, os primeiros estudos de imagem microscópica em ratos acordados foram pubcido, onde a microscopia de dois fótons foi usado no córtex sensorial de ratos fisicamente contido 7 e em ratos correndo em uma esteira esférica 21. Estudos in vivo de microscopia e de eletrofisiologia posteriores demonstraram que uma preparação de fixação da cabeça podem ser combinados com sucesso com paradigmas comportamentais baseados em movimentos de membros anteriores, o reconhecimento odor, mexendo, e lambendo 8,22-25. Ratos colocados na esteira esférica podem ser treinados para navegar no ambiente virtual visual gerada por um computador 10,26. Gravações intracelulares / extracelulares demonstraram que, em um animal fixo-cabeça navegar nesse ambiente virtual, a ativação de células lugar do hipocampo pode ser detectado 27. Em um ambiente virtual visual, ratos demonstram ritmo normal teta relacionados com o movimento no potencial de campo local e precessão da fase theta durante o movimento ativo 27. Recentemente, o activit espacial e temporalpadrões y de populações neuronais foram registrados opticamente em ratos durante as tarefas de decisão memória de trabalho em um ambiente virtual 28. Apesar de ter habilitado pesquisa da descoberta, o projeto esteira esférica tem várias limitações inerentes. Primeiro, o animal é necessária para mover sobre uma superfície ilimitada de uma bola levantada ao ar rotativo, que não coloca obstáculos tangíveis, tais como paredes ou barreiras. Essa limitação é apenas em parte compensada pela &quot;realidade virtual&quot; gerado por computador, porque input visual é sem dúvida menos eficaz em camundongos e ratos, em comparação com a entrada sensorial tátil (por exemplo, bigode de toque ou lamber), que estas espécies naturalmente confiar na. Em segundo lugar, a curvatura considerável da superfície da bola pode ser desconfortável para os ratos de laboratório usados ​​para caminhar sobre um piso liso em suas gaiolas. Finalmente, o diâmetro da esfera pura (pelo menos 200 mm para os ratos e 300 mm para os ratos) processa o tamanho vertical do esféricadispositivo esteira relativamente grande. Isso torna difícil para combinar esteira esférico com a maioria das configurações de microscopia disponíveis no mercado, e muitas vezes requer a construção de uma nova configuração em torno da esteira por meio de quadros de microscópio feitos sob medida. Aqui, um novo método é descrito em que um mouse fixo-cabeça podem se mover em torno de um homecage móvel levantou-ar que dispõe de um piso plano e paredes tangíveis, e explorar o ambiente físico em condições livres de estresse. Este artigo demonstra os procedimentos de treinamento do mouse e fixação cabeça, e fornece exemplos representativos onde as gravações de microscopia de dois fótons, de imagem óptico intrínseco e patch-clamp são realizadas no cérebro de ratos comportando acordado.

<table><tbody><tr><td>Pinça, aço inoxidável, 115 mm</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td></td></tr><tr><td>Aparador de animais, máquina de barbear</td><td>Aesculap</td><td>Isis GT420</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio binocular</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Controlador biológico de temperatura com almofada de aquecimento de aço inoxidável</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina microcirúrgica romba</td><td>BD</td><td>REF </td><td></td>374769</tr><tr><td>Tubo de borosilicato com filamento</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>Para produção de pipetas de patch</td></tr><tr><td>Câmera&nbsp;</td><td>Foscam</td><td>FI8903W</td><td>Visibilidade noturna</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl vet</td><td></td></tr><tr><td>Cimento dentário</td><td>DrguDent, Dentsply</td><td>REF 640 200 271</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>FaunaPharma</td><td>Rapidexon vet</td><td></td></tr><tr><td>Brocas descartáveis</td><td>Meisinger</td><td>HP 310104001001008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s PBS 10x</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fórceps, 110 mm</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Lubrificante para os olhos</td><td>Novartis</td><td>Viscotears</td><td>Para proteção dos olhos durante a operação e como solução de viscose para imersão&nbsp;</td></tr><tr><td>Controle de perfuração</td><td>Foredom Foredom&nbsp;</td><td>FM3545</td><td></td></tr><tr><td>Foredom micro motor handpiece</td><td>Foredom</td><td>MH-145</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de metal de quatro asas</td> Suporte de cabeça de <td>neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>para camundongos</td><td>Narishige</td><td>SG-4N</td><td>Montado em instrumento estereotáxico</td></tr><tr><td>Hemostasia Esponja de colágeno</td><td>Avitene, Ultrafoam BARD</td><td>Ref 1050050</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Intervet</td><td>Ketaminol vet</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-Sil&nbsp;</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro pinça de curativo, 105 mm</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de microeletrodo</td><td>Narishige</td><td>PC-10H</td><td>Extrator vertical para produção de pipetas de vidro</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sensapex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini parafuso</td><td>Centrostyle</td><td>Ref. 00343 s/aço M1.0x4.5</td><td></td></tr><tr><td>Mobile Homecage</td><td>Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiphoton Laser Scanning Microscópio</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes não tecidos, 5 x 5</td><td>Molnlycke Health Care</td><td>Mesoft</td><td>Tampões cirúrgicos</td></tr> cola <tr><td>poliacrílica</td><td>Henkel</td><td>Loctite 401</td><td></td></tr><tr><td>lamínula de vidro redonda</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td></td><td>1.5 espessura</td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico para pequenos animais</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de íris para estudantes, reta 11,5 cm</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Health</td><td>Care Rompun vet</td><td></td></tr></tbody></table>

plataforma ar levantou flat-pavimentado: um novo método para combinando comportamento com microscopia ou eletrofisiologia em awake roedores movendo-se livremente

Flat-floored Air-lifted Platform: A New Method for Combining Behavior with Microscopy or Electrophysiology on Awake Freely Moving Rodents

É amplamente reconhecido que o uso de anestésicos gerais pode minar a relevância dos dados eletrofisiológicos ou microscópicos obtidos com o cérebro de um animal vivo. Além disso, a longa recuperação da anestesia limita a freqüência de episódios de gravação / imagens repetidas em estudos longitudinais. Assim, novos métodos que permitam gravações estáveis ​​a partir de ratinhos não anestesiados, comportando são esperados para o avanço dos campos de ciências neurológicas e cognitivas celulares. As soluções existentes variam de mera contenção física para abordagens mais sofisticadas, tais como esteiras lineares e esféricos usados ​​em combinação com realidade virtual gerado por computador. Aqui, um novo método é descrito em que um mouse fixo-cabeça podem se mover em torno de um homecage móvel levantada ao ar e explorar seu ambiente em condições livres de estresse. Este método permite que os pesquisadores para realizar testes comportamentais (por exemplo, de aprendizagem, de habituação ou novela de reconhecimento de objeto) em simultâneo comdois fótons de imagem microscópica e / ou gravações de patch-clamp, todos combinados em um único experimento. Este vídeo-artigo descreve o uso do dispositivo de fixação da cabeça dos animais acordados (homecage móvel), demonstra os procedimentos de habituação dos animais, e exemplifica um número de possíveis aplicações do método.

O método aqui apresentado destina-se a imagens microscópicas ou unicelulares registros eletrofisiológicos em ratos, fixo-cabeça, mas de outra forma livremente em movimento e se comportando acordado. O animal pode mover-se em duas dimensões em uma real (em oposição a virtual), meio tangível e familiar, enquanto crânio dos animais é fixada firmemente ao braço de fixação da cabeça. Habituar a ratinhos para o homecage móvel levantado ao ar é constituída por 4-6 dias de sessões de treino de 2 horas duas vezes por dia (Figura 1). Os animais treinados pode então ser utilizado nas experiências de imediato. Um estudo típico inclui uma série de sessões de imagem ou sessões de gravação de patch-clamp que estão espaçados a intervalos que vão de algumas horas até vários dias ou semanas. É importante ressaltar que ambas as gravações ópticas e eletrofisiológicos podem ser realizadas simultaneamente com os estímulos e leituras cognitivas ou comportamentais, dentro de um único experimento. Para avaliar a estabilidade mecânica defixação do rato cabeça na homecage móvel, as sequências de imagens de vasos corticais marcados com dextrano fluorescente conjugado e de dendritos corticais expressando YFP foram coletadas enquanto os animais experimentais foram navegar no homecage móvel (Figura 2). Os deslocamentos máximos do cérebro durante a locomoção do animal não exceder normalmente 1-1,5 micrômetros. Estes deslocamentos ocorridos nas direções horizontal e muito raramente resultou em uma mudança detectável do plano de imagem, tornando desnecessário qualquer correção de artefatos de movimento. Fixação estável cabeça em homecage móvel permite a quantificação das espinhas dendríticas individuais em animais acordados com a mesma confiabilidade como em ratos anestesiados. Densidade das espinhas dendríticas, morfologia e volume de negócios podem ser monitorados durante os estudos longitudinais com várias sessões de imagem realizados em intervalos que variam de algumas horas a vários dias ou semanas. A usabilidade do móvel homecage para imagiologia óptica funcional foi testada no córtex somatossensorial de ratos acordados utilizando duas abordagens: i) microscopia de dois fotões nos ratinhos transgénicos Thy1-GCaMP3 e ii) intrínseca de imagem do sinal óptico em murganhos de tipo selvagem. Ca 2 + de imagem foi realizado na camada 2/3, que contém os corpos celulares de muitos neurónios marcados com fluorescência, bem como as suas dendrites e axónios (Figura 3). As parcelas de fluorescência-over-time de regiões selecionadas de interesse (ROI) são mostrados na Figura 3, o que demonstra a atividade neuronal espontânea (medido como aumentos transitórios da GCaMP3 fluorescência) durante a navegação ativa do mouse na homecage móvel. Imageamento óptico baseado em sinais intrínsecos permite o mapeamento da distribuição espacial dos domínios funcionais. Figura 4 ilustra mudanças wave-like no nível de oxigenação do sangue (que refletem a ativação neuronal regionais) que se propagam ao longo de córtex somatosensorial em resposta à vibrissa estimulação na freqüência de 0,05 Hz. Para testar a viabilidade de gravações de patch-clamp com homecage móvel, foram utilizados camundongos 2-3 meses de idade C57Bl/6J. Camada 2/3 neurônios do córtex somatossensorial foram registrados a partir de configuração de célula inteira usando o modo de fixação atual. Gravação de patch-clamp no cérebro de ratos acordados em homecage móvel fixo-cabeça era essencialmente similar a cegar patch-fixação em fatias de cérebro. Aproximadamente 50% das tentativas resultou na formação gigaseal bem sucedida, em que mais de 70% originou estável gravação configuração de célula inteira. Não foram observados eventos de perder contato gigaseal devido ao deslocamento mecânico de células. Figura 5 ilustra um fragmento de 60 segundos de um representante de 10 min gravação longa corrente-clamp correlacionados com episódios de camundongo ativa (em execução) e (repouso) estados passivos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src='"/' files width='"600"'> Figura 1. O método de fixação de cabeça de ratos acordados no homecage móvel. A) Visão geral do projeto homecage móvel levantada ao ar e ilustrações do conceito geral. B) Diagrama de um cronograma experimental típico. O estudo começa com a implantação da janela craniana duas semanas antes habituar o rato para manuseio e empacotamento, a qual é seguida por oito sessões de treino duas vezes por dia. O estudo típico inclui uma série de sessões de imagem ou sessões de gravação de fixação de membranas que estão espaçados a intervalos que vão de algumas horas até vários dias ou semanas. Ambas as medições ópticas e eletrofisiológicos pode ser feito em paralelo com estímulos e leituras cognitivos ou comportamentais em um único experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig1highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 2. Exemplo de dois fótons de imagem microscópica em ratos acordados em movimento ao redor do homecage móvel. A, B) a vasculatura cortical, marcado com o de 70 kDa de Texas Red-dextrano conjugado. O diâmetro dos segmentos individuais de navios é medida ao longo do tempo, traçando o perfil das linhas traçadas através do lúmen do vaso durante os períodos de descanso de rato e em execução (A). A taxa de fluxo sanguíneo nas artérias e veias é medido por linha de varredura ao longo das linhas traçadas paralelamente à parede do vaso (B). C, d) detalhes de morfologia neuronal visualizado no cérebro de camundongos transgênicos que expressam YFP na subpopulação de neurônios sob o promotor Thy1. Reconstrução tridimensional de neurônios piramidais no córtex somatossensorial do rato (C). As imagens de uma b dendríticafazenda adquirida em uma vigília, rato comportando são suficientemente estáveis ​​para quantificação de indivíduo dendrítica morfologia da coluna (D) E) A quantificação de movimento do cérebro causada por movimentos do mouse.. Maiores deslocamentos de amplitude correlacionar com períodos de funcionamento do mouse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig2highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" width="600"> Figura 3. Exemplo de atividade população neuronal em acordada Thy1-GCaMP3 rato mover-se ao redor do homecage móvel. A) imagem de dois fótons de camada cortical II / III neurônios. ROI, por exemplo neuronais corpos celulares, dendritos e axônios são mostrados em amarelo. B) Af / F traços da fluorescência GCaMP3 de ROIs mostrados em A (tempo de sD) Fluorescência de ROIs amarelos em C eries gravado em 1,5 seg / frame). C) zoom-in região fotografada a 65 ms / frame. plotados ao longo do tempo, mostra os aumentos transitórios (vermelhas) na fluorescência GCaMP3 que correspondem à ação Ca 2 episódios de potencial induzida + influxo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" width="600"> Figura 4. Exemplo de mapeamento da distribuição espacial das respostas funcionais no córtex de um rato desperto, por meio de imagiologia os sinais ópticos intrínsecas. A) vista Bright-campo dos vasos sanguíneos superficiais através da janela craniana. B) mapa magnitude da atividade da linha de base em móveis homecage durante um episódio de 6 min. C) mapa Magnitude da atividade neuronal propaga ao longo córtex somatosensorial, em resposta à estimulação vibrissa a uma freqüência de 0,05 Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" width="600"> Figura 5. Exemplo de célula inteira de gravação de patch-clamp no córtex de um rato desperto em movimento ao redor do homecage móvel. A) de gravação actual-clamp de um neurônio na camada cortical do rato 2/3. A 0,5 seg, 100-pA injeção de corrente (indicado abaixo do traço) resulta em uma explosão de potenciais de ação. A célula mostrou característica de adaptação à freqüência de pico para os neurônios piramidais. B) contínua gravação atual-clampdo mesmo neurônio correlacionada com a atividade de mouse locomotor "(mostrado na rosa acima do traço). Atividade espontânea Representante do neurônio da camada 2/3 durante períodos do mouse do repouso (C) e corrida (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" width="600"> Figura 6. Perda de peso animal e atividade locomotora de camundongos head-fixed/non-fixed durante as sessões de treinamento no homecage móvel. A) O peso do animal (média + SD,%) antes das sessões de treinamento. Note-se que a perda de peso é totalmente revertida pela sessão de treinamento 7-8 ª. B) Trajetória do rato locomoção horizontal relativa ao homecage móvel,que foi extrapolado a partir do movimento rastreado do homecage móvel durante 8 ª sessão de treinamento. c) A circulação de lagartas de um mouse não-cabeça-fixada explorar a gaiola redonda durante 8 ª sessão de treinamento. D) Duração do fixo-cabeça (círculo) e não fixa (triângulo) movimento camundongos durante 1-4 º dia de treinamento (média + SD,%). Note-se que, no dia 4, os ratos fixo-cabeça exibir nem congelamento (como no 1 º dia), nem atividade locomotora excessiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51869/51869fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este método cria um ambiente tangível, familiar para o mouse para navegar e explorar durante o exame ou unicelulares microscópicos registros eletrofisiológicos, que exigem a fixação firme da cabeça do animal.

Plataforma Ar levantou Flat-pavimentado: Um Novo Método para Combinando Comportamento com Microscopia ou Eletrofisiologia em Awake Roedores movendo-se livremente

It is widely acknowledged that the use of general anesthetics can undermine the relevance of electrophysiological or microscopical data obtained from a ...

Olá, sou Hel Lin, estudante de pós-graduação no Near Science Center, da Universidade de Helsinque. Hoje, meus colegas e eu mostraremos como realizar gravações ópticas e eletrofisiológicas em animais de cabeça acordada, mas em movimento livre e comportados. Nosso método cria um ambiente tangível e familiar para o mouse navegar e explorar.Durante imagens microscópicas ou registros eletrofisiológicos de célula única, que requerem fixação firme da cabeça do animal, implantamos uma janela craniana crônica e habituamos o camundongo a uma gaiola de casa móvel transportada por via aérea, que desliza sob os pés do animal. Durante a locomoção em uma superfície plana, a gaiola da casa móvel pode ser posicionada sob um microscópio vertical padrão para imagens de dois fótons ou colocada em uma eletrofisiologia configurada para gravações de patch clamp em um cérebro de camundongo acordado. Todos os procedimentos experimentais aqui apresentados foram aprovados pelo comitê de ética local.Implantamos janelas cranianas de acordo com os protocolos publicados com pequenas modificações após o implante da janela craniana. O animal pode se recuperar por pelo menos duas ou três semanas durante esse período de recuperação, a janela normalmente recupera sua transparência. Animais com quaisquer sinais de inflamação pós-operatória residual são excluídos dos experimentos.Treine os animais selecionados para um estudo para habituá-los à fixação da cabeça. Na gaiola da casa móvel, manuseie o mouse com calma por cinco a 10 minutos, evitando movimentos bruscos e ruídos, depois devolva-o à gaiola da casa. Repita o procedimento duas ou três vezes em intervalos desiguais.A gaiola da casa móvel permite a fixação da cabeça sem anestesiar o animal antes da fixação da cabeça. Use um pano para enrolar o mouse duas ou três vezes em intervalos desiguais. Certifique-se de que o animal permaneça calmo enquanto estiver embrulhado.Caso contrário, repita o procedimento até que o mouse esteja totalmente habituado a ele. Comece o treinamento duas vezes ao dia dos ratos na gaiola da casa móvel no dia seguinte após a conclusão do manuseio. Pesar os animais antes de cada sessão de treino.Os animais que apresentem perda de peso superior a 10% devem ser excluídos do estudo. Ajuste a posição do braço de fixação da cabeça para corresponder ao tamanho do animal treinado. Conecte a entrada de ar do dispositivo de gaiola de casa móvel à saída de ar pressurizada padrão do laboratório.Certifique-se de que a pressão do ar seja suficiente para a flutuação livre da gaiola doméstica transportada por ar. Comece o treinamento de animais habituados na gaiola da casa móvel. Imobilize o mouse envolvendo-o no pano.Insira o suporte de metal preso à cabeça do animal no braço de fixação da cabeça e fixe-o firmemente apertando os parafusos. Ligue o fluxo de ar para fazer a gaiola doméstica transportada levitar. Remova o pano e deixe o mouse explorar a gaiola doméstica.Durante a primeira sessão de treinamento, os camundongos podem apresentar comportamento de congelamento e tremor e ereção da cauda. Para habituar o animal ao ruído, forneça uma exposição constante aos sons ambientes usando, por exemplo, uma tradução de rádio ou música e fala gravadas durante todas as sessões de treinamento, bem como durante os experimentos. Para evitar o estresse crônico, use iluminação de luz brilhante durante a primeira hora da sessão de treinamento.Após a primeira hora, faça o treinamento no escuro e use uma câmera infravermelha próxima para monitorar o comportamento do animal. Quando a sessão de treinamento estiver concluída, solte o animal do braço de fixação da cabeça perdendo os parafusos. Retorne o animal de volta à gaiola de origem por pelo menos duas horas antes da próxima sessão de treinamento.Manter o mouse em uma gaiola com dois ou mais outros ratos diminuirá o nível de estresse. Opcionalmente, você pode colocar a gaiola transportada junto com o animal em sua gaiola doméstica. Isso enriquecerá o ambiente e poderá reforçar a habitação do animal na gaiola da casa móvel.Durante a última sessão de treinamento, os ratos estão habituados à fixação da cabeça e devem exibir um comportamento sem estresse navegando calmamente ao redor da gaiola doméstica transportada por ar. Na ausência de luz visível, a trajetória da locomoção do rato pode ser rastreada monitorando os movimentos da gaiola com uma câmera infravermelha próxima ou com um mouse óptico de computador. Durante sessões de treinamento prolongadas que duram mais de uma ou duas horas, considere fornecer água potável ao mouse, manualmente ou usando um porta-pipeta preso à estrutura da gaiola da casa móvel.O diagrama a seguir resume a linha do tempo de um estudo experimental típico. O estudo começa com a implantação da janela craniana duas semanas antes do manuseio do camundongo e continua com oito sessões de treinamento duas vezes ao dia. O estudo típico inclui várias sessões de imagem ou sessões de gravação de patch clamp que são espaçadas em um intervalo de algumas horas a vários dias ou semanas.Experimentos ópticos e eletrofisiológicos podem ser feitos em paralelo com estímulos e leituras cognitivas ou comportamentais. A microscopia de dois fótons é uma tecnologia óptica não linear exclusiva que permite a visualização em tempo real de estruturas celulares e até subcelulares em camadas corticais profundas do cérebro de um roedor. Para realizar um experimento de imagem microscópica de dois fótons, coloque um animal treinado na gaiola da casa móvel, ajuste as rolhas para proteger a óptica do microscópio contra danos acidentais.Limpe a lamínula da janela craniana para remover partículas de poeira. Coloque um fluido de imersão na lamínula. Recomendamos o uso de solução de víscera porque a água evapora rapidamente.A plataforma pode ser colocada em cima de uma mesa óptica motorizada típica usando o modo de campo amplo do microscópio de fluorescência e um filtro de emissão de passagem longa. Avalie a vasculatura cerebral e selecione uma região de interesse. Para a imagem da vasculatura cortical injetar na veia da cauda de um animal fixo e imobilizado na cabeça, um texto conjugado vermelho de 70 quilos Dalton, Texas Tran.Esta sequência de imagens mostra uma gravação de lapso de tempo de locais e artérias no córtex de um camundongo que se comporta enquanto navega ao redor da gaiola da casa móvel. Ao traçar o perfil das linhas traçadas no lúmen do vaso, pode-se medir as mudanças no diâmetro do vaso e a motilidade de segmentos individuais do vaso. A taxa de fluxo sanguíneo nas artérias e veias pode ser medida por varredura de linha ao longo das linhas traçadas paralelamente à parede do vaso. Multa.Detalhes da morfologia dos neurônios podem ser visualizados em camundongos transgênicos que expressam YFP na subpopulação de neurônios sob o promotor de Taiwan. Esses dois Zacks comparam a estabilidade de imagem entre animais anestesiados e acordados. O painel do lado direito mostra dendritos do animal anestesiado com a mistura de cetamina xilazina.Enquanto o painel do lado esquerdo mostra uma imagem de dendritos em um animal acordado andando em torno de uma gaiola de casa móvel. A morfologia individual da coluna vertebral em animais acordados pode ser analisada com a mesma confiabilidade e precisão que nos camundongos anestesiados. O deslocamento do cérebro durante a corrida dos animais normalmente não excede um a um micrômetro e meio.Esses movimentos ocorrem nas direções horizontais e muito raramente resultam em um deslocamento do plano de imagem, tornando desnecessária a correção de artefatos de movimento. Na maioria dos casos, a capacidade de monitorar cronicamente a atividade neuronal no cérebro vivo acordado é essencial para entender a organização e a função do sistema nervoso. Usando o tie one G Camp três camundongos transgênicos, visualizamos a atividade neuronal espontânea nos camundongos acordados que se comportam na gaiola da casa móvel.Esta sequência de imagens de lapso de tempo mostra exemplos representativos de picos de cálcio em corpos celulares neuronais, nites e axônios. A imagem óptica baseada em sinais intrínsecos permite mapear a distribuição espacial de domínios funcionais para realizar um experimento de imagem óptica intrínseca. Coloque o animal treinado na gaiola doméstica posicionada sob a objetiva da câmera.Limpe a lamínula da poeira. Coloque uma gota de glicerol e cubra-a com uma lamínula redonda de cinco milímetros. Ajuste a posição de uma câmera de alta velocidade.Coloque um manipulador com um tubo de sopro de ar oposto à vibração contralateral. Use luzes verdes para criar imagens do mapa da embarcação. Concentre-se mais profundamente no córtex, aproximadamente 400 micrômetros abaixo dos vasos corticais.Coloque um filtro passa-banda na frente da câmera e ilumine o córtex com uma luz vermelha. Deixe o mouse adotar a plataforma por pelo menos 30 minutos. Registre a atividade de linha de base durante um episódio de seis minutos.Estimule a vibração a cada 10 segundos com sopros de ar pelo período total de seis minutos. Esta imagem ilustra a atividade neural se propagando ao longo do córtex somatossensorial em resposta à estimulação vibratória na frequência de 0,05 hertz. Para realizar registros eletrofisiológicos de célula única, coloque o animal treinado implantado com uma janela craniana invertida na gaiola da casa móvel.Lenta e cuidadosamente, remova a lamínula do suporte de metal. Atualize o tampão cortical e limpe a janela craniana de detritos com um tampão hemostático. Coloque o eletrodo de aterramento no tampão cortical.Encha a pipeta de grampo de remendo com solução intracelular. Aplique uma pressão positiva na pipeta de registro usando um micromanipulador motorizado, aprofunde a pipeta no córtex e obtenha um contato de giga selo com a célula de interesse. Após a gravação, remova a pipeta, atualize o tampão cortical e feche a janela craniana com cola em uma lamínula no suporte de metal.O uso de uma gaiola doméstica transportada por via aérea permite combinar imagens e eletrofisiologia com paradigmas comportamentais clássicos, como aprendizado, reabilitação ou comportamento relacionado à ansiedade. O olfato é uma importante entrada sensorial para camundongos e pode ser usado para estimulação em testes de memória e para avaliação da reação à novidade. Para realizar um teste de habituação disolfativa, coloque o animal treinado na gaiola da casa móvel e deixe-o adotar.Por 30 minutos, prenda um pedaço de algodão limpo embebido em água da torneira na parede interna da gaiola da casa móvel usando uma fita adesiva de dois lados. Após cinco minutos, substitua o algodão limpo na parede da gaiola doméstica por um novo embebido em um líquido contendo o cheiro de baunilha. Repita as exposições de cinco minutos ao cheiro de baunilha três vezes com intervalos de cinco minutos entre as sessões.Para medir o nível de interesse pelo cheiro. Conte o tempo acumulado que o animal passa de frente para a zona-alvo e o tempo total de movimento da gaiola da casa móvel. Durante a última quinta sessão, apresentar um cheiro socialmente significativo.Molhe o novo aplicador de algodão com algumas gotas de urina de camundongos do sexo oposto. Para avaliar a reação à novidade, divida a gaiola da casa móvel em quatro zonas. Prenda duas peças de algodão opostas uma à outra. Cor.Codifice-os com marcadores no lado externo das paredes da gaiola doméstica durante o primeiro teste. Coloque dois pedaços de algodão limpos. Em seguida, substitua os dois por algodão embebido em 1% de extrato de baunilha.Durante o terceiro teste, coloque o algodão de baunilha na zona número um e o pedaço de algodão embebido em 1% de extrato de banana na zona. Número dois, para medir a preferência por nenhum cheiro. Calcule o tempo que os animais passam enfrentando o sem cheiro como porcentagem do tempo acumulado voltado para outras zonas.Olá, sou Leo Kiro, investigador principal do Centro de Neurociências da Universidade de Helsinque. Espero que você tenha gostado de assistir ao vídeo e o tenha achado útil. Temos trabalhado com dupla microscopia in vivo nos últimos cinco anos, e o uso de geral e estética sempre foi uma grande preocupação porque uma estética interfere na função cerebral, no fluxo sanguíneo e tudo mais.E hoje estou feliz por podermos trabalhar em animais acordados e realizar experimentos de imagem microscópica estáveis e validar e verificar os resultados que obtivemos anteriormente em animais anestesiados. Tenho certeza de que o uso de gaiolas para casas móveis e os métodos que apresentamos hoje aumentarão a relevância da pesquisa in vivo em geral e levarão a resultados novos e inovadores, e estou ansioso por isso.

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Research

JoVE Journal

Behavior

Comportamento

Um procedimento é descrito para manipular a actividade de neurónios piramidais corticais cerebrais optogenetically enquanto o electroencefalograma, electromiograma, e concentração do lactato cerebral são monitorados. Gravações experimentais são realizados em ratinhos de cabo-cativos, enquanto eles sofrem espontâneas do sono / vigília ciclos. Optogenética equipamento é montado no nosso laboratório, o equipamento de gravação encontra-se comercialmente disponível.

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Este protocolo descreve o projeto e a implantação cirúrgica de um mecanismo de restrição da cabeça para monitorar a atividade neuronal em estruturas cerebrais subcorticais em ratos alertas.  Ele delineia procedimentos para isolar neurônios individuais na configuração justacelular e identificar com eficiência suas localizações anatômicas.

Monitoramento Juxtacellular e Localização de solteiro Neurônios dentro Estruturas Cerebrais Sub-corticais de alerta, conteve-Cabeça Rats

Instruções para a construção de baixo custo e implantação cirúrgica de uma montagem eletroencefalográfica transcraniana crônica de alta densidade em camundongos são fornecidas. Técnicas de gravação, extração e processamento de sinais também são descritas.

De alta densidade Electroencefalografia Aquisição em um modelo de roedor Usando de baixo custo e de código aberto Recursos

Aqui, apresentamos um procedimento para a realização de imagens de Ca 2 + em larga escala com resolução celular em múltiplas camadas corticais em camundongos que se movem livremente. Centenas de células ativas podem ser observadas simultaneamente usando um microscópio em miniatura montado na cabeça acoplado com uma sonda de prisma implantada.

Multi-layer Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging em ratos com movimento livre com sondas de prisma e microscopia de fluorescência miniaturizada

Uma rede sem fio, sistema bidirecional para multi-canal neurais gravações e estimulação em livremente se comportando ratos é introduzido. O sistema é leve e compacto, tendo assim um impacto mínimo sobre o repertório comportamental de animal´s. Além disso, este sistema bidirecional fornece uma ferramenta sofisticada para avaliar relações causais entre os padrões de ativação do cérebro e comportamento.

Uma rede sem fio, Interface bidirecional para gravação na Vivo e estimulação da atividade Neural em livremente, comportando-se ratos

Este estudo apresenta um método para a gravação simultânea dos potenciais do campo local no cérebro, eletrocardiogramas, electromyograms e respirando os sinais de um rato andando livremente. Esta técnica, o que reduz custos experimentais e simplifica a análise de dados, irá contribuir para a compreensão das interacções entre o cérebro e os órgãos periféricos.

Gravações simultâneas de potenciais de campo corticais Local, eletrocardiograma, eletromiograma e respirar o ritmo de um rato andando livremente

O protocolo aqui apresentado fornece informações sobre o eletroencefalograma (EEG) simultâneo e avaliação comportamental em tempo real. Discutimos todas as etapas envolvidas neste protocolo como uma solução atraente para pesquisadores em muitos campos da neurociência, particularmente nas áreas de aprendizagem e memória.

Monitoramento Simultâneo da Eletrofisiologia Wireless e Teste Comportamental de Memória como Ferramenta para Estudo da Neurogênese do Hipocampo

Apresentado aqui é um protocolo para a implantação de uma janela craniana crônica para a imagem longitudinal de células cerebrais em camundongos acordados e com a cabeça.

Implantação de uma janela craniana para imagem repetida em vivo em ratos acordados

Desenvolvemos uma única plataforma para rastrear o comportamento animal durante duas tarefas de aprendizagem associativa dependentes de fibras. O design de baixo custo permite a integração com experimentos optogenéticos ou de imagem direcionados à atividade cerebelar associada à fibra.

Uma plataforma flexível para monitorar o aprendizado associativo sensorial dependente do cerebellum

Um novo procedimento detalhado para imagens funcionais de ratos acordados com a cabeça fixada é descrito.

Implantes de Cabeça para Neuroimagem de Ratos Acordados e Fixados na Cabeça

O protocolo descreve a metodologia de registro extracelular no córtex motor (CM) para revelar propriedades eletrofisiológicas extracelulares em camundongos conscientes em movimento livre, bem como a análise de dados de potenciais de campo local (LFPs) e picos, o que é útil para avaliar a atividade neural da rede subjacente aos comportamentos de interesse.

Gravação Extracelular Multicanal em Ratos em Movimento Livre

Aprenda a realizar gravações ópticas e eletrofisiológicas em camundongos acordados e livres para se mover, utilizando uma gaiola móvel elevada por ar. Este método permite microscopia de dois fótons e patch clamp em comportamento natural.

Plataforma Ar levantou Flat-pavimentado: Um Novo Método para Combinando Comportamento com Microscopia ou Eletrofisiologia em Awake Roedores movendo-se livremente (Vídeo) | JoVE Journal

Plataforma Ar levantou Flat-pavimentado: Um Novo Método para Combinando Comportamento com Microscopia ou Eletrofisiologia em Awake Roedores movendo-se livremente

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