Name: Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 30 s
Description: Aprenda a fabricar géis de poliacrilamida com microesferas fluorescentes localizadas próximo à superfície para microscopia de força de tração celular. Este método melhora a precisão na medição das forças mecânicas exercidas pelas células.

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Os autores gostariam de agradecer ao Programa Iniciativa Interdisciplinar de Inovação da Universidade de Illinois, conceder 12035. SK foi financiado pelo UIUC da National Science Foundation (NSF) Grant 0.965.918 IGERT: formação da próxima geração de Pesquisadores em Celular e Mecânica Molecular e bionanotecnologia.

Fabrico e funcionalização géis PA variando de rigidez com microesferas fluorescentes incorporadas perto da superfície da cultura de células. 1. Funcionalização o tampo de vidro lamínulas <ol><li> Limpo lamelas de vidro (# 1,0, 12 mm de diam.) Com sabão e água, seguida por etanol, para remover o pó estranhos. </li><li> Tampa de vidro lugar desliza sobre uma superfície ralado (ou seja, o titular da ponteira) de tal forma que eles não estão tocando para facilitar a facilidade de interação com as lamelas. </li><li> Bata de toda a superfície da tampa desliza com poli-D-lisina (0,1 mg / ml) durante 1 hora (Figura 1A). </li><li> Durante este tempo, realizar uma diluição de 1: a solução de colóide de 0,1 um de diâmetro de 10.000, microesferas fluorescentes vermelhas com desionizada (DI) de água para se obter uma densidade de partícula de cerca de 1 por microesfera 20 mM 2 sobre a superfície do gel. Ver Figura 2 para os resultados de várias diluições. Este dilution pode ser modificado para atender a necessidade de experimentos específicos. </li><li> Coloque a solução diluída em um banho de água de ultra-sons durante 30 min. </li><li> Depois de 1 hora, use uma pinça para levantar cuidadosamente cada lamínula e seque com o ar. Retorne os lamínulas secos à superfície ralado. </li><li> Remover a solução de colóide diluído a partir do banho de ultra-sons e uma pipeta de 150 uL em cada lamela. Deixe descansar por 10 min (Figura 1B). </li><li> Use uma pinça para levantar cuidadosamente cada lamínula e seque com o ar. Retorne a tampa seca desliza para a superfície e loja ralado no escuro até que esteja pronto para uso. </li></ol> 2 Preparando PA Gel Diretamente na Glass Bottom placas de Petri <ol><li> Placa de aquecimento de pré-aquecimento a 100 ° C. </li><li> Coloque para fora o número desejado de fundo de vidro placas de Petri (35 milímetros prato com 14 milímetros micro-bem, # 1.0) em uma superfície plana em um exaustor química. </li><li> Cubra a parte de vidro de cada placa de Petri micro-bem com 97% 3-Aminopropil-trimethoxysliane (3-APTES) para 7 min para ativação química. Tomar cuidado para evitar o gotejamento inadvertida dos 3-APTES à superfície do plástico na placa de Petri a fim de evitar a degradação do poliestireno. </li><li> Após 7 min, preencher a placa de Petri com água DI e dispor em recipiente de resíduos. </li><li> Repita o passo 2.4 3x para cada prato, em seguida, apertar a placa de Petri para remover a água extra. Colocar as placas de Petri sobre a placa quente até que a porção de vidro é seco. </li><li> Retirar as placas de Petri a partir da placa de aquecimento e voltar para uma superfície plana numa hote química. </li><li> Em uma coifa química, fazer uma solução de glutaraldeído a 0,5% e a porção de cobertura de vidro de cada placa de Petri bem com a solução durante 30 min. Tomar cuidado para evitar o gotejamento inadvertida do glutaraldeído para a superfície do plástico na placa de Petri a fim de evitar a degradação do plástico. </li><li> Após 30 min, preencher a placa de Petri com água DI e dispor em recipiente de resíduos para lavar e remover o glutaraldehyde. </li><li> Repita o passo 2.4 3x para cada prato, em seguida, apertar a placa de Petri para remover a água extra. Colocar as placas de Petri sobre a placa quente até que a porção de vidro é seco. </li><li> Antes de misturar os componentes da solução de gel de PA, mover as lâminas de vidro funcionalizadas no exaustor de fumos química de tal modo que eles são facilmente acessíveis, o que permite a rápida ensanduichar do gel com o fundo de vidro pratos de Petri depois de misturar a solução de gel. </li><li> Num tubo de centrífuga de 15 mL, misturar 40% bisacrilamida, 2% de acrilamida, e de ácido acrílico em sucessão imediata, nas concentrações listadas na Tabela 1 (adaptado do protocolo publicado 10) para atingir a desejada elasticidade da matriz. </li><li> Adicionar 100 mM de HEPES, 10% de persulfato de amónio e TEMED em quantidades indicadas na Tabela 1 correspondem a elasticidade da matriz desejada para completar a solução de gel. </li><li> Imediatamente pipeta 15 ul de solução de gel para o centro da porção de vidrodas placas de Petri. </li><li> Imediatamente pegar uma tampa de deslizamento de vidro funcionalizado com uma pinça. <ol><li> Vire a tampa de deslizamento de vidro sobre tal que as partículas fluorescentes estão na tomada de lado o contato com a solução de gel. </li><li> Coloque a tampa deslizante suavemente no topo do gel-líquido PA agora de tal modo que o lado funcionalizado está em contacto com o gel (Figura 1C). Nota: Para obter melhores resultados, uma segunda pessoa é recomendado para a função de adicionar o deslizamento da tampa, a fim de evitar a possibilidade de a polimerização parcial, enquanto pipetando solução líquida gel PA em várias placas de Petri. </li></ol></li><li> Virar todas as placas de Petri sobre para ajudar a evitar os efeitos da gravidade sobre nanopartículas fluorescentes polimerização em níveis mais baixos do gel PA. </li><li> Aguarde pelo menos 35 minutos, ou até que a solução estoque de gel PA visivelmente polimerizado em seu tubo de centrífuga. </li><li> Virar as placas de Petri de volta e enchê-los com PBS para ajudar com a remoção da tampa de deslizamento. </li><li> Com cuidado, faça contato com a parte de vidro da placa de Petri e os contornos da lamínula, usando uma pinça para raspar a circunferência da lamela. Execute vários ciclos até que a lamínula é desalojado. Retire a tampa de deslizamento e descarte em um recipiente de resíduos perfurocortantes adequada. </li><li> Após a remoção de todos os lamelas, contas fluorescentes terá transferido para o gel (Figura 1E). Cubra os géis PA completamente com PBS, coloque a tampa placa de Petri em cada prato, e armazenar a 4 ° C. </li></ol> 3. Funcionalização gel PA com fibronectina <ol><li> Preparar as seguintes soluções de pré-misturados tal como descrito no protocolo estabelecido 11: solução Soak (NaCl 137 mM, 5% (v / v) de glicerol) e 2x tampão de conjugação (0,2 H 2 (N-morfolino) etanossulfónico (MES), 10 % (v / v) de glicerol, pH 4,5). </li><li> Use uma bomba de vácuo em uma capa biológico para remover toda a PBS dos pratos com fundo de vidro contendo os géis PA. </li><li> Pipetate embebe a solução para cada gel de tal forma que o gel é completamente submerso. Incubar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hr. </li><li> Quente 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) e N -hydroxysulfosuccinimide (NHS) a temperatura ambiente. </li><li> Misturar 10x soluções de EDC (150 mM, 19 mg / ml em água desionizada) e NHS (250 mM, 29 mg / ml em água desionizada). </li><li> Misture uma parte de 10x EDC, uma parte 10x NHS, 3 partes de água DI e 5 peças 2x tampão conjugação. </li><li> Usar uma bomba de vácuo com um capuz biológico para remover a solução de impregnação. Certifique-se de todo o fluido é removido da superfície do gel. </li><li> Adicionar suficiente solução de NHS / EDC, para se cobrir a superfície do gel e encher o poço com fundo de vidro da placa de Petri (150-250 uL). Incubar à temperatura ambiente durante 30 min no escuro. </li><li> Fibronectina Descongelar à temperatura ambiente. Uma vez descongelado, misturar água estéril DI para criar um / ml solução de fibronectina 50 ug. </li><li> Usar uma bomba de vácuo com um capuz biológico para remover as solu NHS / EDCção. Certifique-se de todo o fluido é removido da superfície do gel. </li><li> Adicionar 150 ul de solução de fibronectina para cada gel. Incubar à temperatura ambiente durante 35 min para permitir a ligação da fibronectina. </li><li> Após 35 minutos, adiciona-PBS a cada prato de Petri e armazenar a 4 ° C durante até 2 semanas. </li></ol> 4. Experimentos TRACCÇÃO <ol><li> Meios de célula quente, PBS, e tripsina a 37 ° C em um banho de água. </li><li> Lavar géis 5x com PBS estéril, aspirar o PBS entre lavagens, e deixe coberto na capa. </li><li> Adicionar 1 ml de tripsina por cada 25 cm2 de frasco contendo células. Após as células são levantadas a partir de frasco, diluir a tripsina com meio celular e contar as células. Com base na área superficial do gel, determinar o número de células necessário por gel para uma densidade final de células de semeadura de 3000 células / cm 2. Dilui-se ou concentrar-se a suspensão de modo a que 150 uL da mistura de células-media contém este número de células. Alíquota de 150 mL de suspens celularesião positivo para cada gel. </li><li> Colocar as placas de Petri contendo as células numa incubadora durante 30 min. Em seguida, remove cuidadosamente os pratos de Petri e encher o restante da placa de Petri com meios de comunicação (aproximadamente 2 ml) de tal modo que a superfície do prato é completamente submerso. </li><li> Colocar as placas de Petri de volta na incubadora até que a aquisição de imagem. </li><li> Prepare o sistema de aquisição de microscópio e dados para geração de imagens: inserir a objetiva de imersão 40x de água, insira o contraste de interferência diferencial (DIC) Prisma, selecione o mCherry ou filtro fluorescente equivalente, e ligue a câmara ambiental. </li><li> Quando preparado para imagens, remover uma placa de Petri da incubadora e coloque-o suavemente sobre o estágio do microscópio. Remover a tampa do prato de Petri para DIC imagiologia. </li><li> Localize uma única célula e capturar uma única imagem da célula na DIC. </li><li> Sem mover o estágio do microscópio, mude o modo de imagem para fluorescência. Concentre-se nas microesferas fluorescentes e record uma imagem das microesferas. </li><li> Remover cuidadosamente a partir de meio celular a placa de Petri com uma pipeta e adicionar 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> Imagem das microesferas sob a célula após as células têm destacado. </li><li> Velocimetria de imagem (PIV) Use análise de partículas no ImageJ 12 para calcular o campo de deslocamento devido a forças de celulares. </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Ao utilizar esta técnica, é essencial que a solução do grânulo é adequadamente diluída e os grânulos são escolhidos com base no diâmetro desejado, PA rigidez substrato de gel, e a escala de tamanho dos fenómenos que é explorado na experiência desejada. O cuidado deve ser tomado ao diluir a solução talão antes de funcionalização top lamínulas de vidro. O espaçamento entre as esferas na superfície do gel pode ser alterada alterando o factor de diluição da solução coloidal. A diluição da soluçã...

A interação mecânica de uma célula viva com o seu ambiente local tem sido comumente estudada utilizando géis PA. Estes substratos de contar com um protocolo simples, bem caracterizado estabelecida por Dembo e Wang, em 1997, 1. Uma das principais vantagens destes substratos é que a sua rigidez pode ser ajustado por modificação das concentrações de componentes específicos da solução de gel. Isso fornece uma plataforma desejável estudar a interação das células com ambientes de diferentes rigidez. Quando géis PA são revestidos com proteínas (ECM) de matriz extracelular, as células aderir a elas, a geração de força. Como resultado da força da célula, o gel se deforma como um corpo elástico. Esta deformação depende da intensidade da força aplicada pelas células e as propriedades elásticas do gel. Vários estudos têm empregado géis PA para investigar forças de tração celulares. Numa variação de fabricação de gel PA, microesferas fluorescentes (esferas) são incorporados turante o gel para quantificar as forças de tração na célula em géis de diferentes rigidezes 2. Após a aplicação da força de células, as contas de deslocar da sua posição inicial após a deformação de gel. O campo de deformação é medida a partir dos deslocamentos individuais grânulo. Este campo é utilizado com deformação teoria da elasticidade e as propriedades elásticas do gel para calcular as forças de tracção. Essas medidas fornecem uma visão de como as células perceber e interagir com seu microambiente local 3 mecanicamente. Em muitos PA protocolos de fabricação de gel utilizado, as contas são misturados em todo o gel PA na sua, não polimerizada estado líquido. Um gel de PA totalmente polimerizado contém pérolas fluorescentes todo o seu volume. Ao calcular as forças de tração na célula, contas a maioria perto da superfície do gel (interface de célula-substrato) são monitorados. Os deslocamentos destes grânulos são assumidos como ocorrem na superfície da cultura de células para manter a simplicidade da força CÁLCULOn. A localização exacta dos grânulos dentro da profundidade do gel é ignorado. No entanto, em um meio elástico (tal como gel de PA), um grânulo mais perto de um ponto de aplicação de força irá mover-se mais do que uma camada que está mais longe do ponto. Assim, tratando o deslocamento de um ponto (no local do grânulo) distal a partir da superfície como os resultados que a superfície em uma subestimação de trações celulares. O grau de erro depende da distância do rebordo a partir da superfície. O erro não pode ser estimado sem o conhecimento da localização do rolete. A necessidade de um método simples para limitar grânulos muito perto da superfície da cultura de células foi tratada por algumas técnicas. Uma maneira é a de aumentar a densidade dos grânulos durante todo o gel de modo a que haja um número suficiente de esferas no plano focal de cima para medir o movimento muito perto da superfície. Outra técnica envolve a construção de uma câmara de imagem confocal de imagem de células vivas, tais que a luz a partir deapenas as contas no plano superior mais focal é coletado 4. Um método diferente envolve a sobreposição de uma camada extremamente fina de gel PA contendo contas em cima de um gel já polimerizado sem contas 5. Uma desvantagem de cada uma destas técnicas é que o local exacto dos grânulos dentro do gel não seja conhecida. Isto introduz erro no cálculo do campo de deslocamento dos grânulos e, assim, o cálculo das forças de células. Outra técnica envolve a conjugação de grânulos para a superfície de topo de um gel de AP já polimerizado usando Sulfo-SANPAH 6. Esta técnica assegura que os grânulos são, de facto apenas no topo do gel de AP, mas o grau em que eles são incorporados na profundidade do gel é desconhecido. Isto pode, potencialmente, criar uma topografia local para as células, o que poderia alterar o comportamento celular, como o trabalho anterior sugeriu que as células podem sentir forças vários microns de distância 7. Recentemente, uma técnica de padronização géis PA com 1 mícron de diâmetro fluorescent marcadores fibronectina pontos em uma matriz regularizada foi estabelecido 8. Neste caso, a profundidade dos marcadores fluorescentes é conhecido, e é essencialmente zero, enquanto o padrão impresso é indirectamente fibronectina na superfície do gel. No entanto, este método não proporcionar um ambiente no qual as células contínua pode anexar, como a proteína de ECM está limitada a um um de diâmetro pontos. Um método para integrar plenamente contas rastreador dentro géis PA e confiná-los em um local conhecido muito perto da superfície ainda não foi estabelecida. Aqui, nós desenvolvemos uma técnica para limitar sub mícrons de diâmetro de partículas fluorescentes uM para um plano focal muito perto da superfície de cultura de células dentro de gel de PA. Um gel é geralmente curado por ensanduichamento solução gel líquido não polimerizado entre duas chapas de vidro. Uma das placas é funcionalizado de modo a que o gel adira fortemente a ele. A outra é não funcionalizados e é removido após a cura do gel. Nós modificar este vidro removível surface revestindo-o com uma camada de grânulos. Após a ensanduichar o gel líquido entre a superfície de vidro funcionalizada e a pérola revestida, a transferência de contas para o gel, ao passo que se a cura. Isto limita a distância de integração dos grânulos no gel a cerca de 1,6 uM da superfície. Pratos de Petri de vidro de fundo são usados ​​como a superfície aderente em que o gel é curado. Para formar uma superfície superior plana de gel durante a polimerização, uma lamela circular de vidro é usado para o gel de sanduíche com a placa de Petri com fundo de vidro. Antes da fabricação de gel, a parte superior da tampa deslizante de vidro é revestido com poli-D-lisina (PDL), obtendo-se uma carga de superfície positiva. O PDL é soprado com ar comprimido, e com uma solução de pérolas em água é depositada sobre as lamelas. Nós utilizamos microesferas fluorescentes carboxilados, que carregam uma carga negativa, e interagir com a superfície carregada positivamente criado por tratamento com PDL. Após a solução de sopro grânulo fora da lamela com ar comprimido, de uma única camada decontas permanece eletrostático acoplado à tampa de deslizamento seco. O revestimento PDL não afecta a adesividade da superfície de vidro para o gel, como as lâminas de vidro são sem danos e removido do gel de AP totalmente intacta. As placas de Petri de fundo de vidro são feitos aderente por tratamento com 97% de 3-aminopropil-trimethoxysliane e 0,5% de glutaraldeído. Géis PA de rigidez desejados são criados através da mistura de concentrações adequadas de bisacrilamida e acrilamida através de um procedimento padrão 9. Uma gota da solução de gel é pipetada para o fundo uma placa de Petri de vidro. A lamela de vidro contendo as pérolas é usada para sanduíche do gel com a placa de Petri. Quando o gel é curado, o topo da tampa deslizante é removido, deixando as pérolas embutidas no gel PA dentro de 1,6 pM a partir da superfície.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>97% 3-Aminopropil-trimetoxisliana (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>70% Glutaraldeído</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>Solução tampão HEPES 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida a 40%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>Bisacrilamida a 2%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533</td><td></td></tr><tr><td>0,1 &micro; m Microesferas fluorescentes (mCherry)</td><td>Invitrogen</td><td>F8801</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina, Humana, 1 mg</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td><td>Bio-RAD</td><td>161-0801</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hidroxisulfosuccinimida (NHS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Tripsina-EDTA (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acrílico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>147230</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morfolino)ácido etanossulfônico (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>35 mm Prato de fundo de vidro com vidro de cobertura micro-well #1 de 14 mm</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-14-1-N</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro, 12 mm de diâmetro. </td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Rolamento 26023</td><td></td></tr></tbody></table>

um novo método para localizar repórter fluorescentes beads perto da superfície de cultivo celular para tração microscopia de força

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA géis têm sido muito utilizadas como uma plataforma para estudar as forças de tracção da célula devido à facilidade de fabrico e a capacidade para sintonizar as suas propriedades elásticas. Quando o substrato é revestido com uma proteína da matriz extracelular, as células aderem ao gel e aplicar forças, fazendo com que o gel para se deformar. A deformação de tracção depende da célula e as propriedades elásticas do gel. Se o campo de deformação da superfície é conhecido, a superfície de tracção pode ser calculada usando a teoria de elasticidade. Gel de deformação é normalmente medida por incorporação de grânulos de marcadores fluorescentes para o gel de modo uniforme. As sondas deslocam como o gel se deforma. As sondas perto da superfície do gel são rastreados. Os deslocamentos relatados por estas sondas são considerados como deslocamentos de superfície. As profundidades da superfície são ignorados. Esta hipótese apresenta erro na avaliação da força de tração. Para a medição precisa das forças de células, é essencial para a localização dos grânulos a ser conhecido. Nós desenvolvemosuma técnica que utiliza a química simples para limitar grânulos marcadores fluorescentes, 0,1 e 1 m de diâmetro, em géis de PA, dentro de 1,6 uM da superfície. Nós revestir uma lamela com poli-D-lisina (PDL) e esferas fluorescentes. Solução gel PA é então espremido entre a lamela e uma superfície aderente. As contas fluorescentes transferir para a solução de gel durante a cura. Após a polimerização, o gel PA contém pérolas fluorescentes num plano perto da superfície do gel.

Imagiologia confocal foi utilizada para determinar que os grânulos eram de facto sob a superfície do gel e para quantificar a sua localização precisa dentro da profundidade de gel. As contas fluorescentes de um comprimento de onda diferente do que os que estão dentro do gel foram deixadas a assentar sobre a superfície, e a distância entre as nanopartículas fluorescentes incorporadas e aqueles em que o revestimento foi calculada utilizando um algoritmo de identificação centróide. A localização do cordão na superfície do ...

As técnicas tradicionais para a fabricação de poliacrilamida (PA) géis contendo sondas fluorescentes envolvem imprensando um gel entre uma superfície aderente e uma lâmina de vidro. Aqui, mostramos que este revestimento de lâmina com poli-D-lisina (PDL) e sondas fluorescentes localiza as sondas para dentro de 1,6 pM a partir da superfície do gel.

Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

O objetivo geral deste procedimento é fabricar géis de poliacrilamida ou PA para cultura de células com microesferas fluorescentes embutidas muito perto da superfície do gel. Isso é feito primeiro funcionalizando lamínulas de vidro com poli D lisina. O segundo passo é revestir as lamínulas de vidro com uma solução contendo microesferas fluorescentes.Em seguida, os géis PA são formulados misturando concentrações apropriadas de bis, acrilamida e acrilamida, e imprensados entre uma superfície subjacente e o lado funcionalizado das lamínulas de vidro. A etapa final é funcionalizar o gel com uma proteína de matriz extracelular e células de cultura na superfície do gel. Em última análise, a microscopia de força de tração é usada para medir as forças mecânicas exercidas pelas células como resultado da deformação do substrato induzida pela célula.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a fabricação tradicional de PHL, é que ela localiza microesferas fluorescentes em um local conhecido dentro da profundidade do gel, permitindo um cálculo mais preciso das forças de tração celular. A demonstração visual deste método é crítica, pois a cura espacial deve ser tomada ao funcionalizar as lamínulas de cobertura de vidro, a fim de garantir que os bits de fluorescência sejam transferidos adequadamente para o PHL First place. A tampa de vidro previamente limpa desliza sobre uma superfície ralada de forma que não se toque.Para facilitar a interação com as lamínulas, cubra toda a superfície das lamínulas com 0,1 miligramas por mililitro de poli D lisina por uma hora. Durante este tempo, efectuar uma diluição de um a 10 000 da solução coloidal de 0,1 micrómetros de diâmetro. Microesferas fluorescentes vermelhas com água deionizada para obter uma densidade de partículas de aproximadamente uma microesfera por 20 mícrons quadrados na superfície do gel.Colocar a solução diluída num banho-maria ultrassónico durante 30 minutos. Após uma hora, use uma pinça para levantar cuidadosamente cada lamínula e seque com ar. Em seguida, retorne as lamínulas secas para a superfície ralada.Uma vez que a solução colóide diluída tenha sido removida do banho ultrassônico, pipete 150 microlitros da solução em cada lamínula. Após 10 minutos, use uma pinça para levantar cuidadosamente cada lamínula e seque com ar. Depois que as lamínulas secas forem devolvidas à superfície graduada, guarde-as no escuro até que estejam prontas para uso.Em seguida, coloque o número desejado de placas de Petri com fundo de vidro em uma superfície plana em uma capela de exaustão química. Cubra a parte de vidro de cada placa de Petri. Micro bem com 97% de três amino propil trimetil por sete minutos para ativação química.Após sete minutos, encha a placa de Petri com água deionizada e descarte a solução em um recipiente de lixo. Cubra cuidadosamente a parte de vidro de cada placa de Petri. Bem com uma solução de glutaraldeído a 0,5% previamente preparada por 30 minutos.Após 30 minutos, encha a placa de Petri com água deionizada e descarte-a em um recipiente de lixo para enxaguar e remover a pele de glutaraldeído. Antes de misturar os componentes da solução de gel de poliacrilamida, mova as lâminas de vidro funcionalizadas para a capela de exaustão química de forma que sejam facilmente acessíveis, permitindo o rápido sanduíche do gel com as placas de Petri com fundo de vidro. Depois de misturar a solução de gel em um tubo de centrífuga de 15 mililitros, misture 40% de acrilamida, 2% de acrilamida e ácido acrílico em sucessão imediata.Para obter a elasticidade da matriz desejada, adicione 100 HEPs milimolares, 10% de amônio por sulfato e agrupados em quantidades correspondentes à elasticidade desejada da matriz. Para completar a solução em gel, pipete imediatamente 15 microlitros de solução em gel no centro da parte de vidro das placas de Petri. Depois de pegar uma lamínula de vidro funcionalizada com uma pinça, vire-a de forma que as esferas fluorescentes fiquem do lado em contato com a solução de gel.Em seguida, coloque a lamínula suavemente em cima do gel de poliacrilamida agora líquido, de modo que o lado funcionalizado fique em contato com o gel. Em seguida, vire todas as placas de Petri para ajudar a evitar os efeitos da gravidade nas nanopartículas fluorescentes. Polimerização em níveis mais baixos do gel de poliacrilamida.Após a polimerização, vire as placas de Petri de volta e encha-as com BS. Faça contato cuidadosamente com a parte de vidro da placa de Petri e o contorno da lamínula usando uma pinça para raspar a circunferência da lamínula. Após vários ciclos de raspagem. Remova a lamínula e descarte-a em um recipiente adequado para objetos cortantes.Depois de remover todas as lamínulas, coloque a tampa da placa de Petri em cada placa e guarde a quatro graus Celsius. Uma vez que os géis de poliacrilamida estejam quentes à temperatura ambiente, use uma bomba de vácuo em um exaustor biológico para remover todo o PBS dos pratos com fundo de vidro contendo os géis pipeta previamente preparada para embeber a solução em cada gel de forma que o gel fique completamente submerso. Após a incubação em temperatura ambiente por pelo menos uma hora, adicione 150 a 250 microlitros de uma solução de HSED previamente preparada para cobrir a superfície do gel e encher o poço do fundo do vidro da placa de Petri.Em seguida, incube os géis em temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Uma vez que a solução N-H-S-E-D-C tenha sido removida por vácuo, adicione 150 microlitros de uma solução de fibronectina previamente preparada a cada gel. Mais uma vez, incube em temperatura ambiente por 35 minutos para permitir a fixação da fibronectina.Neste ponto, aqueça o meio celular PBS e tripsina a 37 graus Celsius em banho-maria. Enxágue os géis cinco vezes com água deionizada estéril. Aspirando a água entre os enxágues, cubra os géis, deixando-os no capô.Adicionar um mililitro de tripsina por 25 centímetros quadrados ao balão que contém as células. Depois que as células forem retiradas do frasco, dilua a tripsina com meio celular. Em seguida, conte as células usando um hemocitômetro com base na área da superfície do gel.Determine o número de células necessárias por gel para uma densidade final de assento celular de 3000 células por centímetro quadrado, dilua ou concentre a suspensão de modo que 150 microlitros da mistura de mídia celular contenham esse número de células. Em seguida, Eloqua um 50 microlitros da suspensão celular em cada gel. Seguindo este local, as placas de Petri contendo células em uma incubadora por 30 minutos.Depois de remover cuidadosamente as placas de Petri da incubadora, encha o restante da placa de Petri com aproximadamente dois mililitros de meio de forma que a superfície da placa fique completamente submersa. Coloque as placas de Petri de volta na incubadora até a aquisição da imagem. Quando preparado para a imagem, coloque uma das placas de Petri suavemente no microscópio stage.Depois de remover a tampa da placa de Petri para imagens DIC, localize uma única célula e capture uma única imagem estática da célula no DIC sem mover a platina do microscópio. Mude o modo de imagem para fluorescência. Concentre-se nas microesferas fluorescentes e registre uma imagem das microesferas.Remova cuidadosamente a mídia celular da placa de Petri com a pipeta e adicione 0,05% de tripsina EDTA. Concentre-se na imagem DIC para mostrar o gel do qual a célula se desprendeu. Em seguida, imagine as microesferas sob a célula depois que as células se separarem.A imagem confocal foi usada para determinar se as esferas estavam sob a superfície do gel e, para quantificar sua localização precisa, esferas fluorescentes de tamanho e comprimento de onda diferentes das que estavam dentro do gel foram deixadas se depositar na superfície. A localização dos grânulos assentados serve como referência para a superfície superior do gel, onde as células aplicam força após a adesão. Após a imagem confocal, a distância entre as nanopartículas fluorescentes incorporadas e as da superfície foi calculada.Essa distância determinou a profundidade precisa das esferas dentro do gel. Aqui é mostrada a distribuição espacial do grânulo e a vista projetada no plano YZ. A escada fornece as profundidades de todos os grânulos da superfície do gel.A profundidade média de grânulos de 0,1 mícron é de 619 nanômetros, 467 nanômetros, 278 nanômetros para géis de poliacrilamida de rigidez de 10 e 40 quilopascais, respectivamente. As profundidades correspondentes para grânulos de um mícron de diâmetro são menos 20 nanômetros em géis de 40 quilopascal, 12 nanômetros em 10 géis e 1.255 nanômetros em géis de um quilopascal. A profundidade dos grânulos dispersos por todo o gel foi medida e comparada com as profundidades.Usando a técnica apresentada. A variabilidade da dispersão do grânulo dentro da profundidade de um gel de poliacrilamida usando métodos tradicionais de fabricação é mostrada aqui. O campo de deslocamento para uma célula de fibroblasto e a camada de grânulos fluorescentes correspondente são mostrados aqui.As contas próximas à periferia da imagem parecem ligeiramente fora de foco, o que é um efeito óptico devido à objetiva de imersão em água. Após a adição de tripsina, a célula é liberada da superfície, resultando no retorno da superfície deformada do gel de poliacrilamida ao seu estado original. Uma vez dominada, esta técnica de fabricação e funcionalização PHL pode ser feita em seis horas se for executada corretamente.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar géis de poliacrilamida com microesferas fluorescentes, localizadas em um local conhecido dentro da profundidade do gel próximo à superfície da cultura de células. Para um cálculo mais preciso das forças de tração da célula.

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Bioengineering

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Um novo método para localizar Repórter fluorescentes Beads perto da superfície de cultivo celular para Tração Microscopia de Força (Vídeo) | JoVE Journal

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