Name: Rápido genotipagem dos animais Seguido por Estabelecer culturas primárias de neurônios do cérebro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprenda a genotipagem rápida de camundongos recém-nascidos e o estabelecimento de culturas primárias de neurônios cerebrais. Este método eficiente utiliza camadas alimentadoras de glia para pesquisa em neurociência.

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Os autores agradecem aos pesquisadores da Universidade de Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins e Beverly Davidson pelas instruções e comentários úteis sobre as culturas estriadas, e aos Drs. Kara Gordon, Nicole Bode e Pedro Gonzalez-Alegre pela assistência e discussões sobre a genotipagem. Também agradecemos ao Dr. Eric Weyand (Sistemas de Identificação e Marcação de Animais) pelos comentários úteis sobre a tatuagem, e ao Dr. Shutaro Katsurabayashi (Universidade de Fukuoka) pelos comentários úteis sobre a cultura do rato. Este trabalho foi apoiado por doações da American Heart Association, do Departamento de Defesa (prêmio W81XWH-14-1-0301 do Programa de Pesquisa Médica Revisado por Pares), da Dystonia Medical Research Foundation, da Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, da National Science Foundation e da Whitehall Foundation (NCH).

O autor (Zhengmin Huang) é o presidente da EZ BioResearch LLC que produz os reagentes descritos neste artigo.

O protocolo aqui apresentado inclui os procedimentos para a tatuagem para marcar / identificar ratos, camundongos para a genotipagem de pontas da cauda, ​​e para a cultura de neurônios do cérebro do rato em baixa densidade. Em uma rodada de experimentos usando 6-8 filhotes, estes procedimentos normalmente requerem ~ 0,5 hr, ~ 4 horas e ~ 2 horas, respectivamente, em um total de 6-7 horas. Isto torna mais prático para um único experimentador para completar todos os procedimentos necessários a partir do momento do nascime...

Modelos de roedores de doenças genéticas provaram útil para estabelecer as funções fisiológicas normais de proteínas e ácidos nucleicos, bem como as consequências de fisiopatológicos defeitos nestes. Exemplos incluem ratos deficientes para proteínas envolvidas em funções celulares essenciais, bem como modelos de rato de desordens tais como doença de Alzheimer. No entanto, certas manipulações genéticas podem levar a letalidade neonatal pouco ou alguns dias após o nascimento. Nestes casos, as culturas de células primárias são um instrumento importante porque as células vivas podem ser obtidos a partir dos filhotes embrionários ou neonatais antes da morte, que podem ser mantidos durante pelo menos algumas semanas in vitro, e durante este tempo o desenvolvimento neuronal precoce pode ser seguido pela experiências bioquímicas, funcionais e morfológicas. Para as culturas primárias, ela pode ser benéfica para os neurónios em placa de baixa densidade; isso faz com que seja possível visualizar a somata indivíduo, dendrites, eixos axonal e termi nervonais em alta resolução espacial. No entanto, a sobrevivência e diferenciação de neurónios a baixa densidade, tipicamente requer que eles são plaqueadas numa camada alimentadora de células gliais, a co-cultura com células gliais, na ausência de contacto físico com eles, ou cultivadas em meio condicionado por células gliais 1. O estabelecimento de culturas neuronais de baixa densidade em camadas alimentadoras gliais pode ser dependente de genotipagem rápida e fiável de antemão - dentro de algumas horas, em contraste com alguns dias. A velocidade é especialmente importante quando o genótipo neuronal precisa de ser compensada com o de uma camada alimentadora glial preparado de antemão. Como um exemplo mais prático, pode ser necessário decidir qual das crias que genótipo de usar na geração de culturas, para optimizar a eficiência de uma experiência. Aqui demonstramos o protocolo de trabalho que tenha sido utilizado para rápido, simplificado e fiável genotipagem rato em publicações anteriores 2-6. Rabos de rato eum kit disponível comercialmente são usados. Este protocolo inclui a extracção de passo único de ácidos nucleicos a partir do tecido, e não exige nem um passo de purificação de ácido nucleico que nem o uso de um tampão de terminação (&#39;solução parar&#39;). A fiabilidade deste método de genotipagem é ilustrada, apresentando os resultados de uma série de testes em que são introduzidas diferenças no que diz respeito à quantidade de partida das amostras, a idade dos animais e do comprimento dos produtos de amplificação de PCR. Este kit oferece as vantagens de extracção e fiabilidade automatizado. Por causa de ser abrangente, a utilização de tatuagem para identificação de longo prazo dos ratinhos cujo genótipo é também demonstrada. A tatuagem é conseguido pela aplicação de tinta para tatuagem a derme da pele (epiderme sob as) 7. Um procedimento é descrito para tatuar as almofadas das patas de ratos recém-nascidos ou 1 dias de idade, embora tatuagens pode ser aplicado a outras partes do corpo, tais como as caudas e os dedos do pé, e a Animals de todas as idades. Além disso, os procedimentos será demonstrada para o plaqueamento e a cultura de neurónios de rato, a uma densidade baixa, com base na preparação optimizado de diferentes tipos de camadas alimentadoras gliais 2,8. Nós usamos um modelo genético do rato da desordem neurológica DYT1 distonia herdada - uma desordem de movimento autossômica dominante, causada por uma mutação no gene TOR1A (c.904_906delGAG / c.907_909delGAG; p.Glu302del / p.Glu303del) 9. A proteína codificada, torsinA, pertence aos &quot;ATPases associadas a diversas atividades celulares&quot; (AAA +) família de proteínas, cujos membros geralmente desempenham funções semelhantes a chaperonas, auxiliando em: proteínas que se desdobram, desmontagem proteína do complexo, o tráfico de membrana e fusão das vesículas 10-13. Os resultados de mutação em uma deleção em enquadramento de um codão para ácido glutâmico, e pode conduzir a manifestação de &quot;início precoce generalizada isolado distonia &#39;14,15. No entanto, o caminhomecanismos ophysiological responsáveis ​​por esta desordem permanecem pouco compreendidos. Em um modelo de rato knock-in, o alelo mutante é Tor1a tm2Wtd, mencionados a seguir como Tor1a AE. Heterozygous AE-torsinA knock-nos ratos são pacientes humanos viáveis ​​e geneticamente mímica com DYT1 distonia, enquanto homozigoto knock-in ratos morrerem após o nascimento 16,17, com a latência para a morte pós-natal afetados por fundo genético 18. A morte prematura de homozigose camundongos knock-in exige que tanto a genotipagem dos animais eo estabelecimento de culturas neuronais são concluídas rapidamente. Como outro exemplo de genotipagem, Tfap2a (fator de transcrição AP-2α, ativando obrigatório 2α proteína potenciador) será usado. A proteína codificada por este gene é importante na regulação de vários processos celulares, tais como a proliferação, a diferenciação, a sobrevivência e a apoptose 19.

<table><tbody><tr><td>REAGENTES - Máquina de tatuagem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Limpador</td> Sistemas de <td>Identificação e Marcação de Animais, Inc.</td><td>NMCR3</td><td>Isso é usado para limpar as agulhas e o suporte após a tatuagem.</td></tr><tr><td>Agente de secagem de máquina</td><td>Sistemas de identificação e marcação de animais, Inc.</td><td>NDAR4</td><td>É usado para secar as agulhas e o suporte após a limpeza.</td></tr><tr><td>Neonate Tattoo Black Pigment</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NBP01</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de Preparação de Pele</td><td>Sistemas de Identificação e Marcação de Animais, Inc.</td><td>NSPA1</td><td>Ponta Q.</td></tr><tr><td>Solução de preparação da pele</td><td>Sistemas de identificação e marcação de animais, Inc.</td><td>NSP01</td><td>Este reagente fornece uma fina camada de óleo que aumenta a eficiência da tatuagem e previne o desbotamento da tatuagem, por (informações do fornecedor): 1) evitando que a pele não tatuada seja manchada temporariamente, permitindo assim que a qualidade de uma tatuagem de almofada de pata seja facilmente avaliada antes que o filhote seja devolvido à sua gaiola de origem &ndash; A superfície da pele manchada pode ser confundida com a pele tatuada, 2) reduzindo os danos à pele durante a tatuagem - Amolecer a pele e lubrificar a agulha ajudará a agulha a penetrar na pele sem causar danos à pele e 3) impedir que o oxigênio molecular entre na pele, reduzindo assim as respostas inflamatórias às espécies reativas de oxigênio que podem ser geradas.</td></tr><tr><td>REAGENTES - genotipagem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Formato de Tubo de Tira)</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Ready Mix II</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Um corante vermelho, de carga para eletroforese, está incluído na solução 2X PCR Ready Mix.</td></tr><tr><td>Solução de Lise de Tecido A</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Prepare a Solução de Extração de DNA misturando 20 &micro; l de Solução de Lise Tecidual A e 180 &micro; l de solução de lise tecidual B por amostra.</td></tr><tr><td>Solução de Lise de Tecido B</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Prepare a Solução de Extração de DNA misturando 20 &micro; l de Solução de Lise Tecidual A e 180 &micro; l de solução de lise tecidual B por amostra.</td></tr><tr><td>Ácido acético, glacial</td><td>VWR</td><td>BDH 3092</td><td></td></tr><tr><td>Grau otimizado para agarose, grau de biologia molecular</td><td>rpi</td><td>A20090-500&nbsp;</td><td>Usamos géis de agarose a 2% em tampão TAE contendo a coloração de gel de DNA SYBR Safe (diluída 10.000 vezes) ou brometo de etídio (0,5 &micro; g/ml de volume de gel).</td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiamina tetracético, sal dissódico dihidratado (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta Filtradas, Sem Aerossóis, 0.1-10 &micro; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG104-96RS&nbsp;</td><td>Use pontas de pipeta estéreis e livres de DNA, RNase e DNase. Para todas as etapas que envolvem DNA, use ponteiras de pipeta filtradas para evitar contaminação cruzada.</td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta Filtradas, Pontas de Filtro de Ajuste Premium, 0.5-20 &micro; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2020-RS</td><td>Use ponteiras de pipeta estéreis e livres de DNA, RNase e DNase. Para todas as etapas que envolvem DNA, use ponteiras de pipeta filtradas para evitar contaminação cruzada.</td></tr><tr><td>Pontas de Pipeta Filtradas, Pontas de Filtro de Ajuste Premium, 1-200 &micro; l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2812-RS</td><td>Use ponteiras de pipeta estéreis e livres de DNA, RNase e DNase. Para todas as etapas que envolvem DNA, use ponteiras de pipeta filtradas para evitar contaminação cruzada.</td></tr><tr><td>Marcador de peso molecular, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1001</td><td>Usamos qualquer um desses três marcadores de peso molecular.</td></tr><tr><td>Marcador de peso molecular, EZ DNA Even Ladders 1000 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de peso molecular, TrackIt, 100 bp DNA Ladder</td><td>Tubos PCR GIBCO-Invitrogen</td><td>10488-058</td><td></td></tr><tr><td>, 8 tiras de tubos com tampas de cúpula individualmente anexadas, naturais, 0,2 ml&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>Use tubos estéreis e livres de DNA, RNase e DNase. Uma tira de 8 tubos é fácil de manusear e agrupar as amostras do que os tubos individuais.</td></tr><tr><td>Tubos de PCR, Ultraflux Individual&nbsp;</td><td>rpi</td><td>145660</td><td>Use tubos estéreis e livres de DNA, RNase e DNase.</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga Seal-Rite 0,5 ml, natural</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td>Use tubos estéreis e livres de DNA, RNase e DNase.</td></tr><tr><td>Coloração segura do gel do ADN de SYBR * concentração de 10.000x em DMSO</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>rpi</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>Primeiras demão para amplificar o gene de Tor1a dentro &Delta; Camundongos knock-in E-torsinA</td> 5'-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3' (para frente) e 5'-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3' (reverso) (referência 18).<td></td><td></td><td> Esses primers foram usados em uma concentração final de 1,0 ng/&micro; l (~0,16 &micro; M) (referência 2).</td></tr><tr><td>Primers para amplificação do gene Tfap2a em camundongos</td><td></td><td></td> selvagens <td>5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (para frente), 5'-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3' (reverso) para o amplicon de 498 pb, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (para frente), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (reverso) para o amplicon de 983 pb, e 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (para frente), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (reverso) para o amplicon de 1990 pb. Esses primers são usados a 0,5 &micro;M.</td></tr><tr><td>REAGENTES - cultura</td><td></td><td></td><td></td>de células</tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-desoxiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>Consulte a seção de comentários da uridina para obter mais informações.</td></tr><tr><td>Suplemento B-27</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células 35 x 10 mm,</td> Frascos de cultura de células <td>de falcão BD</td> tratados <td>com cultura 353001 de</td><td></td></tr><tr><td>tecidos, T25, tratados com cultura de tecidos, pescoço inclinado, tampa de vedação de plugue, área de crescimento de 25 cm2</td>, <td>353082</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de falcão BD de 70 mlFrascos de cultura de células, T75, tratados para cultura de tecidos, pescoço inclinado, tampa ventilada, 75 cm2 Área de crescimento, 250 ml</td><td>BD falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico, polipropileno, 15 ml</td><td>BD falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Countess (contador de número de células) lâminas de câmara</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de citosina &beta;-D-Arabinofuranosídeo (cloridrato de Ara-C)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6645-100mg</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose (Dextrose) anidra, SigmaUltra, 99,5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Prato, Vidro de Petri 100 x 15 mm</td><td>Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Água destilada</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>DNase Tipo II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-200KU</td><td>A solução de estoque é preparada a 1.500 unidades/20 &mu; l = 75.000 unidades/ml em água destilada.</td></tr><tr><td>Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), glicose alta, GlutaMAX, piruvato</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10569-010,</td> Unidade de Filtro PES Rápido de 500 ml<td></td></tr><tr><td>, 250 ml, membrana de 50 mm de diâmetro, 0,2 &micro; m Tamanho dos Poros</td><td>Nalgene</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Filtro PES Rápido, 500 ml, membrana de 90 mm de diâmetro, 0.2 &micro; m Tamanho dos Poros</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula de vidro, 12 mm Redondo, espessura 0.09&ndash; 0.12 mm, No. 0</td><td>Carolina</td><td>633017</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sais Balanceados Hanks'</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387-10X</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, &ge; 99,5% (titulação)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico, 37%, reagente AC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-100 ML</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO4&bull;( 7H2O), BioUltra, &ge; 99,5% (Fluka)</td>Solução de matriz de membrana basal <td>Sigma-Aldrich</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr>, BD <td>Biosciences</td><td>sem vermelho de fenol</td><td>356237</td><td>Este é o material de revestimento para lamínulas e frascos. 1) Para prepará-lo, descongele a solução de matriz de membrana basal Matrigel no gelo, o que geralmente leva ~ 1 dia. Com uma pipeta pré-arrefecida, alíquota da solução descongelada em balões T25 pré-arrefecidos sobre gelo e conservar os balões a -20 °C. Para preparar a solução de Matrigel de trabalho, descongele o Matrigel alíquota em um frasco com gelo, dilua 50 vezes adicionando a solução de MEM pré-resfriada e mantenha a solução diluída a 4 ° C. É importante pré-resfriar todos os utensílios de cultura e meios que entram em contato com o Matrigel, exceto durante e após o revestimento das lamínulas, para evitar que forme um gel prematuramente. 2) Para revestir as lamínulas de vidro ou frascos de cultura com Matrigel, aplique a solução de Matrigel na superfície. Antes de revestir as células, é importante secar completamente a superfície. Para este fim, pode ser útil aspirar Matrigel durante a centrifugação celular imediatamente antes de plaquear as células e dar tempo suficiente para a secagem.</td></tr><tr><td>Meio essencial mínimo (MEM)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Extensor de soro MITO+, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Placas multipoços, Placa de 24 poços tratada com cultura de tecidos</td><td>Falcão BD</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Placas multipoços, Placa de 6 poços tratada com cultura de tecidos</td><td>Falcão BD</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Meio Neurobasal-A (1X), líquido</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Nítrico</td><td>VWR</td><td>bdh 3044</td><td></td></tr><tr><td>NS (Suplemento Neuronal) 21&nbsp;</td><td>preparado em laboratório</td><td></td><td>Fonte: referência 69</td></tr><tr><td>pipetas de Pasteur, 5 &frac34; &rdquo; &nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Use este plugue de algodão 5 &frac34; &rdquo; Pipeta Pasteur para trituração celular. Polir a ponta com fogo de antemão para alisar a superfície de corte e reduzir o diâmetro interno para 50-80% do original. Uma ponta muito pequena interromperá as células e reduzirá a viabilidade celular, mas uma ponta muito grande diminuirá a eficiência da trituração.</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur, 9" &nbsp;</td><td>Cloreto de potássio Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>(KCl), SigmaUltra, &ge; 99,0%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica, 2 ml</td><td>BD falcon</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>pipeta sorológica, 5 ml&nbsp;</td>Pipeta <td>sorológica 357543</td><td></td> <td>falcão BD</td></tr>, <tr><td>pipeta sorológica</td><td>357551</td><td></td><td>falcão BD</td> de</tr><tr><td>10 ml, pipeta sorológica</td><td>357525</td><td></td><td>falcão BD</td> de 25 ml</tr><tr><td>, 50 ml&nbsp;</td><td>BD falcon</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio (NaHCO3, Hidrogenocarbonato de sódio), SigmaUltra, &ge; 99,5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl), SigmaUltra, &ge; 99,5%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH), pellets, 99,998% à base de metais traços</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico heptahidratado (Na2HPO4&bull;( 7H2O)), &ge; 99,99%, Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431478-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose, SigmaUltra, &ge; 99,5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-250G</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa, estéril, 0,2 &micro; m</td> Seringa <td>431219</td><td></td><td>Corning</td></tr><tr><td>, 3 ml</td><td>BD falcon</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina, Holo, plasma bovino</td><td>Calbiochem</td><td>616420</td><td></td></tr><tr><td>Coloração azul de tripano, 0,4%</td> <td>GIBCO-Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Isso é usado para contar células vivas / mortas. Renove uma solução velha de azul de tripano se ela for reutilizada muitas vezes (por exemplo várias vezes por semana durante várias semanas), pois formará precipitados e resultará em leituras errôneas da densidade celular.</td></tr><tr><td>Tripsina, tipo XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005-5G</td><td></td></tr><tr><td>Solução de tripsina-EDTA, 0,25%&nbsp;</td>A solução estoque <td>GIBCO-Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td>é preparada em 50 mg de 5-fluoro-2'-desoxiuridina e 125 mg de uridina em 25 ml de DMEM (8,12 e 20,48 mM, respectivamente).</td></tr><tr><td>REAGENTES - imunocitoquímica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo, anti-MAP2 policlonal de coelho</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5622</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo, coquetel monoclonal anti-GFAP de camundongo</td><td>Merck Millipore</td><td>NE1015</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPAMENTO - tatuagem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS</td><td>Sistemas de Identificação e Marcação de Animais, Inc.</td><td>NEO&#8211; 9</td><td>Este sistema de tatuagem de roedores recém-nascidos é um sistema elétrico que funciona movendo rapidamente agulhas de tatuagem de 1 ou 3 pontos verticalmente na pele. Ative a máquina de tatuagem uma vez por aproximadamente 0,5 segundos, enquanto as pontas das agulhas de tatuagem são mantidas perpendiculares à superfície da pele. Preferimos a tatuagem com três agulhas para maximizar a área tatuada, mas a tatuagem com uma agulha é eficaz em áreas mais estreitas, os dedos dos pés, ou se for necessário um controle mecânico fino, e.g. quando os números são tatuados. Duas rodadas de tatuagem na velocidade mais lenta (definindo "1" de 3 etapas) são normalmente suficientes para produzir uma tatuagem visível e duradoura das almofadas das patas.</td></tr><tr><td>EQUIPAMENTO - sistema de eletroforese de genotipagem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, horizontal, Wide Mini&#8211; Subcélula GT</td><td>BIO&#8211; RAD</td><td>170&#8211; 4405</td><td>Os parâmetros típicos de eletroforese são intensidade do campo elétrico a 6 V / cm e duração de 25 minutos para um gel de 10 cm.</td></tr><tr><td>FluorChem 8800</td><td>ProteinSimple</td><td>FluorChem 8800</td><td></td></tr><tr><td>PCR, MJ Mini Termociclador</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC-1148EDU</td><td>Nossas reações de PCR para o gene Tor1a em &#916; Os camundongos knock-in E-torsinA são os seguintes: 1 ciclo de desnaturação a 94 &#176; C por 3 min, 35 ciclos de desnaturação a 94 &#176; C por 30 seg, recozimento a 58 &#176; C por 30 seg, extensão em 72 &#176; C por 2 min. Isso é seguido pela extensão final em 72 &# 176; C por 10 min e mantendo a 4 &#176;C.</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação, PowerPac Basic</td><td>BIO-RAD</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPAMENTO - cultura</td><td></td><td></td><td></td>de células</tr><tr><td>Contador de células automatizado, Condessa</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10310</td><td>Este contador de células automatizado mede separadamente as densidades de células vivas e mortas (não coradas e coradas por azul de tripano, respectivamente). É importante conhecer a faixa ideal de medições de densidade: o contador que usamos tem a maior precisão na faixa de 1 x 105 a 4 x 106 células/ml. Se os valores de densidade celular medidos estiverem fora da faixa recomendada, ajuste o volume de ressuspensão adequadamente.</td></tr><tr><td>Gabinete de Segurança Biológica, Classe II, Tipo A2</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-400</td><td>Este capuz é usado para todos os procedimentos de cultura de células, exceto para dissecção cerebral.</td></tr><tr><td>CO2 Incubadora, AutoFlow, Camisa de Água com Controle de Umidade</td><td>NUAIRE</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Bancada Limpa Horizontal</td><td>NUAIRE</td><td>NU-201-330</td><td>Esta bancada limpa é usada para dissecção cerebral (etapas 3.1.1 e 3.1.2 de "Dissecção Cerebral e Dissociação Celular)".</td></tr><tr><td>Orbit LS Agitador de Baixa Velocidade</td><td>Labnet</td><td>S2030-LS-B</td><td></td></tr><tr><td>SORVALL RC-6 Plus Centrífuga Supervelocidade</td><td>Fisher</td><td>46910 (centrífuga)/46922 (rotor)</td><td></td></tr></tbody></table>

rápido genotipagem dos animais seguido por estabelecer culturas primárias de neurônios do cérebro

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

A análise de alta resolução da morfologia e função de neurónios de mamífero, muitas vezes requer a genotipagem de cada animal seguindo-se a análise de culturas primárias de neurónios. Nós descrevemos um conjunto de procedimentos para: rotulando camundongos recém-nascidos para ser genotipados, genotipagem rápida, e estabelecendo culturas de baixa densidade de neurônios do cérebro desses ratos. Ratinhos individuais são marcadas por tatuagem, o que permite a identificação de longo prazo duradoura na idade adulta. A genotipagem por o protocolo descrito é rápido e eficaz, e permite a extracção automática de ácido nucleico com uma boa fiabilidade. Isso é útil em circunstâncias em que o tempo suficiente para a genotipagem convencional não está disponível, por exemplo, em ratos que sofrem de letalidade neonatal. Culturas neuronais primárias são gerados em baixa densidade, que permite experimentos com imagens em alta resolução espacial. Este método de cultura requer a preparação de camadas alimentadoras gliais antes de plaqueamento neuronal. O protocolo é aplicado em sua totalidade para um modelo do rato da distonia distúrbio do movimento DYT1 (AE-torsinA knock-nos ratos), e as culturas neuronais são preparados a partir do hipocampo, córtex cerebral e estriado destes ratos. Este protocolo pode ser aplicado aos ratos com outras mutações genéticas, bem como de outras espécies animais. Além disso, os componentes individuais do protocolo pode ser utilizado para sub-projectos isolados. Assim, este protocolo terá amplas aplicações, não só no campo da neurociência, mas também em outros campos das ciências biológicas e médicas.

Como exemplo da aplicação deste protocolo, os resultados representativos são mostrados para a rotulagem de camundongos por tatuagem, genotipagem de confiança sob várias condições experimentais, e estabelecendo culturas neuronais primárias em camadas alimentadoras gliais. Tatuagem Crias recém-nascidas foram marcadas nas almofadas das patas utilizando um sistema de tatuagem ('recém-nascido' na Figura 1). Os rótulos permaneceu clara...

Nós descrevemos os procedimentos de rotulagem e genotipagem de ratos recém-nascidos e gerando culturas neuronais primárias a partir deles. A genotipagem é rápido, eficiente e fiável e permite a extracção de ácido nucleico automatizado. Isto é especialmente útil para os ratos neonatally letais e suas culturas que exigem a conclusão prévia de genotipagem.

Rápido genotipagem dos animais Seguido por Estabelecer culturas primárias de neurônios do cérebro

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

O objetivo geral deste procedimento é genotipar camundongos recém-nascidos e gerar culturas neuronais de baixa densidade em uma camada alimentadora glial. Isso é feito primeiro genotipando rapidamente camundongos recém-nascidos usando as pontas da cauda na segunda etapa. No mesmo dia, os cérebros são dissecados e cultivados como camadas alimentadoras gliais.Então, depois de algumas semanas, outro grupo de camundongos recém-nascidos é rapidamente genotipado e células neuronais são geradas a partir do cérebro do animal para cultura nas camadas de alimentação glial precedidas. Em última análise, este método pode ser usado para genotipagem rápida e confiável, bem como para a geração de neurônios saudáveis e células gliais. Existem duas vantagens principais deste protocolo.Uma é que podemos cultivar neurônios saudáveis em uma densidade muito baixa para experimentos de imagem, colocando-os em uma camada glial fetal. A segunda vantagem é que os camundongos recém-nascidos podem ser genotipados em várias horas, permitindo a correspondência dos genótipos dos neurônios e da camada glial fetal. Eu sou ko um assistente de pesquisa no laboratório Harta.Vou demonstrar os procedimentos para genotipagem e culturas. Comece adicionando 200 microlitros de solução de extração de DNA a cada tubo de PCR contendo uma amostra. Coloque a tira de tubo em um termociclador de PCR e inicie a extração de DNA quando a extração terminar.Remova a tira de tubo do termociclador e inverta os tubos cinco vezes. Em seguida, transfira quatro microlitros de extrato de DNA de cada amostra para um tubo não utilizado em uma tira de oito tubos e misture a amostra com 10 microlitros de dois XPCR prontos. Misture dois, dois microlitros de primers diretos e reversos mistos e quatro microlitros de água livre de nuclease.Para cada amostra, coloque as amostras em um termociclador e inicie o programa de ciclagem térmica. Quando o programa estiver concluído, carregue 20 microlitros de cada amostra amplificada ou marcador de peso molecular diretamente no poço apropriado de um gel aros. Em seguida, execute o gel e adquira imagens fluorescentes das bandas sob luz ultravioleta.Para detectar os produtos de DNA amplificados, comece removendo as regiões de interesse de cada hemisfério do cérebro e, em seguida, transfira os tecidos cerebrais para um tubo de 15 mililitros. Deixe o tecido assentar no fundo do tubo e, em seguida, substitua a solução do topo das fatias por cinco a 10 mililitros de gelo frio. Hank com ou sem soro fetal bovino como indicado anteriormente, aspirando completamente toda a solução.Após a quarta lavagem, use uma seringa de três mililitros para coar dois mililitros de tryin recém-preparado contendo solução de digestão através de uma seringa de 0,2 micrômetro. Filtre diretamente no tubo que contém os tecidos cerebrais e deixe a tripsina prosseguir à temperatura ambiente. Após 13 minutos, neutralize a reação aspirando primeiro a maior parte da solução de tripsina e, em seguida, adicionando sete a 10 mililitros de solução gelada com soro fetal bovino.Em seguida, enxágue os tecidos em solução de Hank com ou sem soro fetal bovino, conforme demonstrado. Em seguida, filtre dois mililitros de solução de dissociação nos tecidos cerebrais. Em seguida, dissocie mecanicamente as células com um trier suave 10 a 20 vezes usando um PEs polido com fogo plugado de algodão em sua pipeta.Continue a tentadora até que os pedaços de tecido visíveis desapareçam. Aguarde três minutos para que os pequenos pedaços se acalmem e, em seguida, use a pipeta de PEs para transferir cerca de 1,5 mililitros da solução para um tubo cônico de 15 mililitros contendo três mililitros de solução Hank gelada com soro fetal bovino gire pelos tubos por 13 minutos a 185 Gs e quatro graus Celsius. Em seguida, aspirar cuidadosamente o sobrenadante com a mesma pipeta de pasteur.Ressuspenda suavemente o pellet em um mililitro de meio de revestimento pré-aquecido. Em seguida, adicione aproximadamente quatro mililitros de meio de revestimento pré-aquecido. Transferir a suspensão celular para um balão de cultura T 25 não revestido e colocar o balão numa incubadora de cultura de células.Em um dia in vitro, enxágue as células duas vezes com cinco mililitros de meio de revestimento gelado, um inclinando suavemente o frasco várias vezes em um movimento giratório de seis a nove dias in vitro coloque 100 microlitros de material de revestimento com proteínas da matriz extracelular em lamínulas de vidro em uma placa de cultura de células e coloque a placa na incubadora de cultura de células. No dia seguinte, lave o frasco aspirando toda a solução dentro do frasco e adicionando aproximadamente 13 mililitros de solução gelada. Em seguida, aspire a solução completamente.Em seguida, filtre quatro mililitros de uma solução de tripsina EDTA mais DNA diretamente nas células e permita que as células se dissociem do frasco de cultura de células em uma incubadora de 37 graus Celsius. Após 13 minutos, neutralize a reação com dois mililitros de soro bovino 100% fetal gelado e use uma pipeta de cinco a 10 mililitros para transferir a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, lave as células adicionando aproximadamente quatro mililitros de solução gelada com centrifugação de soro bovino fetal e, em seguida, suspenda novamente o pellet em um mililitro de meio de revestimento pré-aquecido. Um.Agora aspire completamente o material de revestimento da tampa, das lamelas e coloque aproximadamente 50 microlitros das células gliais ressuspensas nas lamínulas. Para estabelecer a camada de alimentação glial, incube as células gliais por 20 a 60 minutos a 37 graus Celsius e, em seguida, adicione um mililitro de meio de revestimento pré-aquecido, um para cada lamínula enquanto o meio de revestimento é adicionado. É útil usar outra pipeta para pressionar a periferia da lamínula para que a lamínula não flutue no meio.Depois da cultura da noite para o dia. Substitua o meio por um mililitro de meio de revestimento pré-aquecido fresco, um em dois a três dias. In vitro, adicione 10 microlitros de inibidor mitótico a cada cultura da camada alimentadora para inibir a replicação do DNA e a proliferação das células gliais em sete a nove dias.In vitro, substituir o meio de cultura por um meio de revestimento pré-aquecido dois. Em seguida, coloque suavemente aproximadamente 50 a 100 microlitros de células neuronais de camundongo em meio de revestimento pré-aquecido dois em cada camada de alimentação glial. Nesta imagem, o gene tour one a foi amplificado a partir do DNA genômico, isolado dos clipes da cauda de recém-nascidos, de filhotes heterozigotos e homozigotos do modelo de distonia knockin DYT one.Bandas separadas para o tipo selvagem e alelos mutantes são claramente visíveis. Nesta figura, dois campos representativos de uma cultura neuronal do hipocampo de camundongos são mostrados. Eles foram gerados a partir da região do hipocampo CA três, CA uma região hipocampal de camundongos do tipo selvagem.14 dias após o plaqueamento em uma camada glial pré-estabelecida de Ca três, Ca uma camada de alimentação glial hipocampal de camundongos do tipo selvagem nas imagens de contraste de interferência diferencial, sinais de boa saúde, como uma margem clara de processos neuronais estendidos do corpo celular neuronal e uma camada relativamente uniforme de células gliais podem ser observados. Coloração imunoquímica adicional para o mapa de marcadores neuronais. Dois, identificar os neurônios e seus processos em cada campo também pode ser observado.Usando este protocolo, uma genotipagem em uma rodada de cultura pode ser concluída em 67 horas. Este protocolo é especialmente útil para cultivar neurônios de camundongos geneticamente modificados que podem morrer vários dias após o nascimento.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Na eletroporação utero é um método valioso para transfecting células progenitoras neuronal in vivo. Dependendo da colocação dos eletrodos e do ponto no tempo de desenvolvimento de eletroporação, certos subgrupos de células corticais podem ser alvo. Células-alvo podem então ser analisados ​​in vivo ou in vitro para efeitos da alteração genética.

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

O protocolo descreve um sistema de modelo eficiente e reprodutível para estudar vírus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) a latência e reactivação. O ensaio emprega homogéneos culturas de neurónios simpáticos e permite a dissecção molecular do vírus de neurónios-interacções usando uma variedade de ferramentas, incluindo a interferência de RNA e de expressão de proteínas recombinantes.

Um sistema de cultura primária Neuron para o Estudo da Herpes Simplex Virus latência e reativação

Um método de rastreio neurónios ligados sinapticamente é descrito. Usamos TVA especificidade de uma célula de montante para investigar se uma população de células de interesse recebe entrada sináptica de tipos de células geneticamente definidos.

Rastreamento de viral geneticamente definido Neural dos circuitos

O vídeo demonstra uma técnica para cultivar astrócitos primários do córtex de ratos. O córtex é mecanicamente dissociado para obter uma suspensão homogênea de células gliais, que é então plaqueada em placas revestidas com polipeptídeos para promover a proliferação seletiva de astrócitos. Posteriormente, os astrócitos são dissociados enzimaticamente das placas e transferidos para meios frescos, permitindo a cultura de astrócitos puros.

Gerando uma cultura primária de astrócitos a partir de um cérebro de filhote de rato

Um protocolo para gerar um sistema de co-cultura consistindo de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), neurônios corticais primários e astrócitos é descrito. Este sistema de co-cultura permite a detecção da formação de contatos e circuitos sinápticos entre novos neurônios derivados de iPSC e neurônios corticais pré-existentes que expressam channelrhodopsina-2.

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

As causas da degeneração dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo durante a doença de Parkinson não são totalmente compreendidas. Os sistemas de cultura celular fornecem uma ferramenta essencial para o estudo das propriedades neurofisiológicas desses neurônios. Aqui apresentamos um protocolo otimizado, que pode ser utilizado para modelagem in vitro da neurodegeneração.

Isolamento, cultura e Long-Term Manutenção da Primária mesencefálico Dopaminergic neurônios dos cérebros de roedores Embryonic

Nós modificar e implementar um protocolo publicado anteriormente descrevendo a diferenciação rápida, reprodutível e eficiente dos humanos pluripotentes induzidas (células-tronco hiPSCs) em neurônios corticais excitatórios 12. Especificamente, nossa modificação permite o controle da densidade de células neuronais e uso em matrizes de micro-eléctrodos para medir as propriedades eletrofisiológicas no nível da rede.

Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

Aqui apresentamos um protocolo para a geração espontânea de neuroesferas enriquecidas em células progenitoras neurais de neurônios chapeados de alta densidade. Durante a mesma experiência, quando os neurônios são chapeados em uma densidade mais baixa, o protocolo igualmente conduz às culturas preliminares prolongadas do neurônio de rato.

Geração de neuroesferas do hipocampal preliminar misturado e dos neurônios corticais isolados de E14-E16 embrião do rato de Sprague Dawley

Este protocolo apresenta uma maneira única de gerar culturas de células do sistema nervoso central a partir de cérebros embrionários de camundongos do dia 17 para pesquisa em neuro(imuno)logia. Este modelo pode ser analisado usando várias técnicas experimentais, incluindo RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria de fluxo.

Estabelecendo culturas mistas de células neuronais e gliais de cérebros embrionários de camundongos para estudar infecção e imunidade inata

Este protocolo descreve uma co-cultura microglia-neuronal estabelecida a partir de células neuronais primárias isoladas de embriões de camundongos nos dias embrionários 15-16 e microglia primária gerada a partir dos cérebros de camundongos neonatais nos dias pós-natais 1-2.

Geração e co-cultura de microglia primária murina e neurônios corticais

Aprenda a genotipagem rápida de camundongos recém-nascidos e o estabelecimento de culturas primárias de neurônios cerebrais. Este método eficiente utiliza camadas alimentadoras de glia para pesquisa em neurociência.

Rápido genotipagem dos animais Seguido por Estabelecer culturas primárias de neurônios do cérebro

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