Name: Rato Fetal Liver Sistema de Cultura de dissecar Funções gene alvo nas fases precoces e tardias da Terminal Eritropoiese (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Aprenda a dissecar funções gênicas nas fases inicial e tardia da eritropoiese terminal usando um sistema de cultura in vitro de fígado fetal de camundongo. Este método permite análise funcional de genes específicos.

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Este estudo foi financiado pelo NIH R00HL102154, e um da American Society of Hematology prêmio estudioso a P Ji.

Os experimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade Northwestern Animal Care Institucional e Comitê de Uso. 1 Preparação de Meio de Cultura <ol><li> Preparar a solução de fibronectina. Adicionar 1 ml de água para um frasco de fibronectina humana (1 mg). Deixar solução em cultura da capa de tecido, durante 30 minutos, sem agitação. Transferir o líquido total a 50 ml de PBS para fazer uma concentração final de 20 ug / ml e suavemente misturar bem. Adicione a solução de fibronectina fresco antes do revestimento da chapa (ver abaixo). </li><li> Prepare 50 ml de Epo meio livre (médio SCF). Combinar os ingredientes listados na Tabela 1. O meio pode ser armazenado a 4 ° C, durante 1 mês, quando feita. </li><li> Preparar 50 ml de Epo contendo meio. Combinar os ingredientes listados na Tabela 2. O meio pode ser armazenado a 4 ° C, durante 1 mês, quando feita. </li></ol&gt; 2. Fibronectina placa revestida <ol><li> Adicionar 1 ml de solução de fibronectina a cada poço de uma placa de 6 poços (ou 0,5 ml a cada poço de uma placa de 12 poços). Deixar a placa de cobertura na cultura de tecidos durante 1 h. </li><li> Lavar os poços duas vezes com água estéril e secar a placa. </li><li> Enrole a placa e guardar na câmara fria a 4 ° C. </li></ol> 3 Purificação de fígado fetal Erythroblasts NOTA: Use fígados fetais de E13 para E15 cronometrado camundongos grávidas (C57BL / 6). E13.5 fígados são preferidas para maximizar o rendimento de progenitores de CFU-E. Para obter as ratas grávidas cronometrados, 6-8 semanas de idade camundongos machos e fêmeas foram colocados em uma gaiola (geralmente um macho com uma ou duas mulheres). Tampões vaginais fêmeas foram verificadas na manhã seguinte para determinar se o acasalamento com sucesso. O primeiro dia de gestação foi no dia seguinte a ficha foi encontrada. <ol><li> Preparação das células totais de fígado fetal <ol><li> Sacrifique o mouse por inalação de CO 2 e deslocamento cervical. Pulverizar o abdômen com álcool 70% para desinfecção. Abra o abdômen com dissecando tesoura para remover o útero. Lavar o útero em PBS 1x. </li><li> Dissecar os fetos em condições estéreis, utilizando uma capa de cultura de tecidos e ferramentas autoclavados e lave em 1x PBS. </li><li> Dissecar os fígados fetais dos fetos. Segure o corpo do feto com um fórceps, retire com cuidado o fígado fetal (na cor rosa) de distância do corpo com outro fórceps. Limpe o fígado fetal com a pinça para remover os tecidos fibróticos associados. Coloque todos os fígados fetais frescos em 1x PBS contendo 10% de soro fetal bovino. </li><li> Mecanicamente perturbar fígados fetais pipetando para cima e para baixo. </li><li> Filtra-se a suspensão de células através de um coador de células 40 pm em um tubo de 50 ml. Agregar as células a 800 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de PBS com FBS a 10% (cerca de 8 E13.5 fígados fetaispor ml). </li></ol></li><li> Purificação de Ter119 Erythroblasts negativos <ol><li> Bloquear as células com IgG de rato (0,2 mg / ml) em gelo durante 15 min. </li><li> Sem lavagem ou centrifugação, adicionar anticorpo anti-Ter119 biotinilado para a suspensão de células (1 ug / ml). Incubar durante 15 min em gelo. </li><li> Lavar com PBS 1x com 10% de FBS (1:10) e centrifugar a 800 xg durante 5 min. Ressuspender as células em 1 ml de PBS com 10% de FBS. </li><li> Adicionar 75 ul de estreptavidina conjugada com partículas magnéticas e incuba-se durante 10 minutos em gelo. </li><li> Adicionar o volume para 2,5 ml com PBS contendo 10% de FBS. Transferência da suspensão de células em 5 ml de um tubo de polipropileno de fundo redondo. </li><li> Inserir o tubo de um aparelho de triagem celular magnética e incubar durante 10 min. Células positivas Ter119 vai anexar ao lado do tubo. Os eritroblastos negativos Ter119 solta permanece na suspensão. </li><li> Despeje a suspensão de células em 5 ml de um novo tubo de polipropileno redondo inferior. </li><li><html> Repita os passos 3.2.6 e 3.2.7 para remover as células positivas para Ter119 residual. </li><li> Agregar as células a 800 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 ml de PBS contendo 10% de FBS e contagem de células viáveis ​​com azul de tripano. </li></ol></li></ol> 4. Transdução com vírus Encoding cDNA ou shRNA <ol><li> Placa as células fetais de fígado negativos Ter119 purificada a 3-5 x 10 5 / po de uma fibronectina revestido de 12 poços (ajustar o número de células se utilizando uma placa diferente). </li><li> Adicionar polibreno a uma concentração final de 10 ug / ml para facilitar a transdução virai. Rotação infectar as células com lentivírus ou retrovírus, o ADNc que codifica ou shRNA, a 800 xg durante 1-1,5 h a 37 ° C. </li></ol> 5. Cultura das transduzidas Ter119 Negative mouse fígado fetal Erythroblasts <ol><li> Para testar as funções dos genes na fase precoce da eritropoiese do terminal (Figura 1 as linhas a tracejado).&quot;&gt; </ol.><ol><li><ol. li=""> Cultura das células transduzidas em meio isento de Epo (SCF) médio durante 12 horas para permitir a expressão dos genes e manutenção do estado de progenitor transduzidas. </ol.></li><li> Centrifuga-se as células a 800 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 1 ml de Epo contendo o meio em cada poço de uma placa de 12 poços. </li><li> Depois da cultura durante 24 ou 48 horas, a colheita das células para outros ensaios. </li></ol></li><li> Teste as funções dos genes na fase final da eritropoiese de terminal (Figura 1 linhas sólidas). <ol><li> Cultura das células transduzidas imediatamente Epo contendo meio. </li><li> Depois da cultura durante 24 ou 48 horas, a colheita das células para os outros ensaios. </li></ol></li></ol> 6 A coloração das células cultivadas de fígado fetal para Análise Citometria de Fluxo <ol><li> Lave e ressuspender as células em 1x PBS. Colheita de 2 x 10 5 células em cultura para análise por citometria de fluxo. </li><li> Incubaras células com anticorpos fluoróforos, durante 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. Para testar a diferenciação, utilizar APC anti-CD71 conjugado e conjugado com PE anti-Ter119. Para testar a enucleação, utilizar Hoechst 33342 mancha para além dos outros anticorpos. </li><li> Lavar as células com PBS 1x. Ressuspender as células em 0,5 ml de PBS contendo 1% de FBS e o iodeto de propídio (PI) (1 ug / ml) para corar as células mortas e as excluir análise. </li><li> Fluxo de Conduta análise cytrometric. Analise as células de controle de cores coradas e não coradas primeiro single para o ajuste e compensação do citômetro de fluxo. </li></ol>

<ol><li>Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+stem+cell+to+red+cell%3A+regulation+of+erythropoiesis+at+multiple+levels+by+multiple+proteins%2C+RNAs%2C+and+chromatin+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications.</a> Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).</li>
<li>Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+cells+red%3A+signal+transduction+mediated+by+erythropoietin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin.</a> Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).</li>
<li>Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha4beta1+integrin+and+erythropoietin+mediate+temporally+distinct+steps+in+erythropoiesis%3A+integrins+in+red+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development.</a> The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).</li>
<li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+by+erythropoietin+of+viability+and+maturation+of+murine+erythroid+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells.</a> Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).</li>
<li>Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+2+is+required+for+chromatin+condensation+and+subsequent+enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts.</a> Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).</li>
<li>Dumitriu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox6+cell-autonomously+stimulates+erythroid+cell+survival%2C+proliferation%2C+and+terminal+maturation+and+is+thereby+an+important+enhancer+of+definitive+erythropoiesis+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development.</a> Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).</li>
<li>Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+hematopoietic+stem+cell+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods.</a> Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).</li>
<li>Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+characterization+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell characterization and isolation.</a> Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).</li>
<li>Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+control+of+terminal+erythropoiesis+via+physical+interactions+among+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+research%22%5BJournal%5D)">Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells.</a> Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).</li>
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<li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells%3A+functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li>
<li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a%28-%2F-%295b%28-%2F-%29+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li>
<li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).</li>
<li>Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cytokine+signaling+molecules+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+hematopoietic+cells%3A+functional+analysis+of+signaling+molecules+by+retrovirus-mediated+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression.</a> Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).</li>
<li>Patel, V. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibronectin+matrix+is+required+for+differentiation+of+murine+erythroleukemia+cells+into+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes.</a> The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).</li>
<li>Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin-induced+suppression+of+erythropoiesis%3A+the+role+of+erythropoietin+and+a+heme+synthesis+stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor.</a> Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).</li>
<li>Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+hematology%22%5BJournal%5D)">New insights into erythropoiesis.</a> Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Aqui apresentamos um sistema único para analisar cronologicamente rato fetal eritropoiese terminal de fígado. Através da aplicação de diferentes condições de cultivo, dissecamos sucesso eritropoiese terminais em fases precoces e tardias. Isto é particularmente importante para determinar os mecanismos de genes com funções múltiplas. Por exemplo, GTPases Rac desempenham papéis importantes em diferentes estágios de eritropoiese terminal. Inibição de Rac GTPases na fase inicial de diferenciação e proliferação celular influê...

Eritropoiese é o processo de diferenciação de células-tronco hematopoiéticas multipotentes para amadurecer eritrócitos. Este processo gradual inclui a formação de unidades formadoras empenhados explosão eritróide (UFB-ES), os que se dividem rapidamente unidades formadoras de colônias eritróides (UFC-ES), e morfologicamente eritroblastos reconhecíveis 1,2. Eritropoiese Terminal a partir de células progenitoras CFU-E envolve sequencial estágios independentes 2,3-dependente e eritropoietina. Na fase inicial da eritropoiese terminal, eritropoietina (Epo) se liga ao seu receptor na superfície da célula e induz uma série de vias de sinalização a jusante que previnem a apoptose celular e promovem a divisão celular rápida e de 1,4 a expressão do gene. No final da fase de eritropoiese terminal, eritroblastos submeter saída do terminal ciclo celular, condensação de cromatina e núcleo, e extrusão dos núcleos altamente condensadas 5. Nossa compreensão do terminal deeritropoiese tem melhorado muito nas últimas décadas, que é em grande parte devido ao sucesso do uso de vários in vitro e in vivo de mouse 6-9. Entre estes modelos, a cultura in vitro de rato fetal eritroblastos fígado proporciona muitas vantagens, incluindo a facilidade de purificação de células, proliferação e diferenciação rápida, e um mímico mais perto da eritropoiese humano 10,11. Neste sistema, um grande número de células progenitoras eritróides a partir de fígados de rato fetais pode ser facilmente isolado por purificação a única etapa de Ter119 (um marcador para as células eritróides maduras) eritroblastos negativos. Durante a cultura de dois dias dos eritroblastos, a diferenciação destas células podem ser monitorizados por uma análise de citometria de fluxo com base na expressão de superfície do receptor de transferrina (CD71) e o antigénio Ter119 12. Além disso, a enucleação dos eritroblastos de diferenciação terminal pode ser detectada por uma máquina de ADN (Hoechst 33342) 13. Além disso, as células progenitoras purificadas, pode ser geneticamente modificada por expressão de ADNc exógeno ou pequenas hairpin RNAs (shRNAs) para os genes de interesse, o que facilita os estudos mecanicistas das funções de expressão do gene na eritropoiese 11,13,14. Por outro lado, a rápida taxa de crescimento celular podem ser uma espada de dois gumes, uma vez que é difícil de caracterizar as funções de genes em diferentes fases da eritropoiese terminal. Na maioria dos casos, é difícil determinar se a funções de genes específicos na fase precoce da eritropoiese terminal de desde pelo tempo que o ADNc ou shRNAs expressa, as células já passou da fase precoce. Para resolver este problema, foi desenvolvido um sistema único para dissecar os estágios iniciais e tardios da eritropoiese terminal. Para a fase inicial da eritropoiese terminal, geneticamente modificados Ter119 eritroblastos negativas foram cultivadas em meio livre de Epo, mas que contém o factor de células estaminais (SCF), IL-6 e FLT3ligante para manter seu status progenitor e permitir que os cDNAs transduzidas ou shRNA a expressão 13. As células foram mudadas para meio contendo EPO depois de 12 horas para induzir a proliferação e diferenciação celular. Desta forma, quando as células se diferenciaram, os cDNAs foram transduzidas ou shRNAs já expressa. Para o estágio tardio da eritropoiese terminal, Ter119 eritroblastos negativas foram cultivadas em meio contendo EPO, imediatamente após a transdução. Portanto, pode-se analisar as funções dos genes de interesse na fase tardia da eritropoiese terminal. Em resumo, uma ampla aplicação deste sistema ajudaria funções dos genes dissecar em diferentes estágios de eritropoiese terminal.

<table><tbody><tr><td>Meio Dulbecco's Modificado da IscoveIMDM (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>GEMINI Bioproduto</td><td>700-102P</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Penicilina-Estreptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Hyclone</td><td>SH30034.01</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L)</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>14-8001-80</td><td></td></tr><tr><td>Interleucina-6 Recombinante de Camundongo (IL-6)&nbsp;</td><td>GEMINI Bio-produto</td><td>300-327P</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>354008</tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>STEMCELL TECH</td><td>9300</td><td>10% de estoque em IMDM</td></tr><tr><td>Eritropoietina (Epo)</td> <td>PROCRIT</td><td>NOC 59676-303-00</td><td>3.000 U / ml de estoque</td></tr><tr><td>Partículas de estreptavidina mais</td><td>BD Pharmingen</td><td>557812</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>STEMCELL TECH</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de fundo redondo de polipropileno, 5 ml</td><td>FALCON</td><td></td><td></td>352063</tr></tbody></table>

rato fetal liver sistema de cultura de dissecar funções gene alvo nas fases precoces e tardias da terminal eritropoiese

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Eritropoiese envolve um processo dinâmico que começa com unidades formadoras empenhados explosão eritróide (UFB-ES) seguido de divisão rápida erythroid unidades formadoras de colônia (UFC-Es). Depois de CFU-Es, as células são morfologicamente reconhecíveis e geralmente denominado eritroblastos terminais. Um dos desafios para o estudo da eritropoiese terminal é a falta de abordagens experimentais para dissecar as funções dos genes de uma forma cronológica. Neste protocolo, descrevemos uma estratégia única para determinar as funções dos genes nas fases precoces e tardias da eritropoiese terminal. Neste sistema, rato fetal Ter119 fígado (marcador de células eritróides maduras) eritroblastos negativos foram purificados e transduzidas com expressão exógena de cDNAs ou pequenas hairpin RNAs (shRNAs) para os genes de interesse. As células foram posteriormente cultivadas em outras que a eritropoietina (Epo) para manter a sua fase progenitoras, durante 12 horas, permitindo que os cDNAs exógenos ou shRNAs um meio contendo factores de crescimentopara expressar. As células foram mudadas para meio de EPO depois de 12 horas para induzir a diferenciação e proliferação celular, enquanto os materiais genéticos exógenos, já foram expressos. Este protocolo facilita a análise de funções de genes na fase inicial da eritropoiese terminal. Para estudar tarde fase terminal eritropoiese, as células foram cultivadas em meio imediatamente após a transdução de Epo. Desta forma, as células já foram diferenciadas para a fase tardia da eritropoiese terminal quando os materiais genéticos transduzidas foram expressos. Recomendamos a aplicação geral desta estratégia que ajudaria a entender as funções dos genes detalhadas em diferentes estágios de eritropoiese terminal.

A Figura 1 descreve as estratégias experimentais. O protocolo consiste em duas condições independentes para alvejar as funções das moléculas sinalizadoras nas fases precoce e tardia da eritropoiese terminal. Ter119 eritroblastos de fígado fetal negativos foram purificados a partir do rato E13.5 feto. A análise por citometria de fluxo de células eritróides fetais de fígado antes e após purificação demonstrado que a purificação foi eficiente (Figuras 2A e 2B). Para a fase...

Nós apresentamos um rato fetal sistema de cultura in vitro de eritroblastos fígado que disseca os estágios iniciais e tardios da eritropoiese terminal. Este sistema facilita a análise funcional de genes específicos em diferentes estágios de desenvolvimento.

Rato Fetal Liver Sistema de Cultura de dissecar Funções gene alvo nas fases precoces e tardias da Terminal Eritropoiese

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

O objetivo geral do experimento a seguir é dissecar a função do gene em diferentes estágios da eritropoiese terminal usando um sistema de cultura hepática fetal de camundongo in vitro. Isso é conseguido purificando primeiro TER um 19 eritroblastos hepáticos fetais de camundongos embrionários do dia 13,5 Como segunda etapa, os eritroblastos purificados são transduzidos com vírus que codificam CD NA ou SHRNA do gene de interesse para estudar o ganho ou perda de função do gene, respectivamente. Finalmente, as células TER 19 negativas transduzidas são cultivadas sob uma das duas condições diferentes para dissecar a função do gene nos estágios inicial e tardio da eritropoiese terminal.Em última análise, as diferentes cinéticas da diferenciação e da enucleação das células transduzidas podem ser avaliadas por análise por citometria de fluxo. Portanto, esse método pode fornecer informações sobre a ose atrial de camundongos. Também pode ser aplicado a outros sistemas hepo HESIs, como linfo, ose e miose.Para purificar os eritroblastos do fígado fetal, comece desinfetando o abdômen de um camundongo prenhe E 13 a E 15 sacrificado com 70% de etanol. Em seguida, abra o abdômen com uma tesoura de

mouse-fetal-liver-culture-system-to-dissect-target-gene-functions-at

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método de citometria de fluxo para a identificação e análise molecular da diferenciação estágio específico progenitores eritróides murino e precursores, diretamente na medula recém-colhidas do mouse óssea, baço ou o fígado fetal. O ensaio baseia-se na superfície celular marcadores CD71, Ter119 e tamanho da célula.

Identificação e Análise de Progenitores rato Eritróides usando o CD71/TER119 Assay citometria de fluxo-

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

O presente protocolo descreve um novo método para a identificação de uma população de enuclear eritroblastos ortocromaticos pelo fluxo de imagem multi-espectral citometria, proporcionando uma visualização do processo de enucleação dos eritroblastos.

Identificação de um Murino eritroblasto subpopulação enriquecido em enucleação Eventos da Multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo

O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

Enquanto os macrófagos infiltrativos são continuamente recrutados para tecidos adultos a partir de precursores circulantes, os macrófagos residentes semeiam seu tecido durante o desenvolvimento, onde são mantidos sem mais entrada de progenitores. Os progenitores para macrófagos residentes foram identificados recentemente. Aqui, apresentamos métodos para o mapeamento do destino genético dos progenitores de macrófagos residentes.

Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

Aqui apresentamos nosso protocolo para produzir induzido eritroide progenitores (iEPs) de fibroblastos adulto de rato usando orientada por factor de transcrição direta linhagem reprogramação (DLR).

Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

Traduzir a purificação da afinidade do Ribossoma (armadilha) permite a isolação rápida e eficiente do tipo de pilha-específico que traduz o mRNA. Aqui, Nós demonstramos um método que combine a injeção hidrodinâmico da cauda-veia em um modelo do rato do repovoamento do fígado e da armadilha para examinar o perfil da expressão de repovoamento hepatocytes.

Perfil de expressão gênica específica do tipo de célula no fígado do mouse

Aqui, descrevemos um novo método citométrico de fluxo para isolamento prospectivo de progenitores eritróides de unidade formadora de explosão precoce (BFU-e) e eritróides de unidade formadora de colônias (UFC-e) diretamente da medula óssea e do baço frescos de camundongos. Este protocolo, desenvolvido com base em dados transcriptômicos de célula única, é o primeiro a isolar todos os progenitores eritróides do tecido com alta pureza.

Identificação e Isolamento de Progenitores Eritróides da Unidade Formadora de Explosão e da Unidade Formadora de Colônias de Tecido de Camundongo por Citometria de Fluxo

A modelagem da eritropoiese oferece uma chance valiosa de compreender o significado biológico dos atores nesse processo e avaliar novas abordagens terapêuticas que podem aliviar os defeitos de diferenciação. Aqui, descrevemos um método simples e confiável para diferenciar eficientemente células-tronco hematopoiéticas CD34+ e células progenitoras ex vivo.

Um pipeline abrangente para avaliar a eficiência da eritropoiese humana in vitro e ex vivo

Durante o processo de infecção, um passo fundamental é a adesão de patógenos com células do hospedeiro. Na maioria dos casos esta etapa de adesão ocorre na presença de estresse mecânico gerado pelo fluxo de líquido. Descrevemos uma técnica que apresenta tensão de cisalhamento como um parâmetro importante no estudo da adesão bacteriana.

Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

Aprenda a dissecar funções gênicas nas fases inicial e tardia da eritropoiese terminal usando um sistema de cultura in vitro de fígado fetal de camundongo. Este método permite análise funcional de genes específicos.

Rato Fetal Liver Sistema de Cultura de dissecar Funções gene alvo nas fases precoces e tardias da Terminal Eritropoiese

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