Preparação do Synaptic Plasma Membrane e Proteínas de densidade pós-sinápticos Usando um gradiente de sacarose descontínuo
September 3rd, 2014
Este artigo fornece detalhes sobre o enriquecimento de proteínas associadas com a membrana de plasma sináptico por ultracentrifugação num gradiente de sacarose descontínuo. A elaboração definitiva de proteínas de densidade pós-sináptica é também descrito. Preparações de proteínas são adequados para western blot ou análise 2D DIGE.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o fracionamento subcelular do tecido cerebral usando um gradiente de sacarose descontínuo para enriquecer proteínas das membranas sinápticas e pós-densidades sinápticas. Isso é feito primeiro homogeneizando o tecido cerebral com um homogeneizador motorizador. Em seguida, há uma série de etapas de centrifugação para preparar extratos brutos de proteína de membrana.
Os extratos de membrana são então colocados em camadas em um gradiente de sacarose descontínuo para ultracentrifugação. A etapa final é coletar as proteínas do gradiente. Em última análise, os resultados podem mostrar mudanças nos níveis de proteínas sinápticas por meio da análise de Western blot.
Esta é uma técnica bem estabelecida que tem sido usada por neurocientistas há mais de 40 anos. Nós o usamos em nosso laboratório para entender como a composição proteica da sinapse muda quando perturbamos diferentes sistemas de neurotransmissores. A principal vantagem dessa técnica sobre outros métodos, como gradientes por chamada ou gradientes contínuos de sacarose, é que os gradientes descontínuos de sacarose são mais fáceis de construir manualmente.
Este protocolo faz uso de um homogeneizador de Teflon de vidro acionado por motor, sempre substitua o pilão entre as amostras e enxágue e seque. O homogeneizador primeiro, carregue o tecido dissecado em um tubo de 13 mililitros com quatro mililitros de solução de sacarose tamponada com HEPA 0,32 molar. Em seguida, transfira o tecido para um homogeneizador de vidro limpo.
Ajuste o motor para 900 RPM e homogeneize a amostra com 12 golpes em 30 segundos, usando menos de quatro gramas de tecido garante um bom fracionamento, transfira a amostra de volta para o tubo e armazene uma alíquota de 100 microlitros a 80 graus Celsius negativos para análise de proteína. Em seguida, separar o material nuclear centrifugando o homogenato a 900 G durante 10 minutos. A quatro graus Celsius, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 15 mililitros.
O sobrenadante contém a fração bruta da membrana. Agora, para enriquecer para a centrífuga de sinaptossomo bruto, o sobrenadante a 10.000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante. O pellet contém a fração bruta de sinaptossomo Resus.
Suspenda-o em um mililitro de solução de sacarose 0,32 molar. Em seguida, em mais três mililitros de solução para a suspensão, centrifugue a fração bruta por 15 minutos A 10.000 G a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante. Agora pique rapidamente o pellet, ressuspenda o pellet em um mililitro de água pura.
Em seguida, adicione mais três mililitros de água rapidamente. Transfira isso para o homogeneizador. Aplique três movimentos com a mão e transfira-o de volta para o tubo de 13 mililitros.
Ajuste rapidamente a amostra de volta para quatro HEAs milimolares com uma adição de 16 microlitros de HEAs de um molar e misture-a por inversão. Agora coloque a amostra em um rotador a quatro graus Celsius por meia hora. Para garantir a lise da amostra, termine o fracionamento peletizando a fração P lisada de dois primos.
Centrifugar a 25 000 G durante 20 minutos a quatro graus Celsius, retirar o sobrenadante, ressuspender o sedimento num mililitro de solução de sacarose. Este contém as membranas epissómicas sinapsis enriquecidas. Primeiro, pré-meça os tampões para fazer um gradiente de sacarose descontínuo.
Carregue três tubos da seguinte maneira, um com exatamente 3,5 mililitros de solução de sacarose tamponada com 1,2 molar. Outro com exatamente três mililitros de solução molar 1,0 e o terceiro com três mililitros de solução molar 0,8. Em seguida, com uma pipeta de vidro, transfira a solução de sacarose molar 1,2 molar para um tubo de ultracentrífuga de polímero de 12 mililitros.
Com uma nova pipeta, coloque cuidadosamente a solução molar 1,0 na solução molar 1,2. Não perturbe a solução molar de 1,2 nem introduza bolhas com a pipeta. Use a mesma técnica para colocar a solução molar de 0,8 por cima.
Tome cuidado. Pequenas vibrações de um vórtice de bancada ou microcentrífuga são suficientes para perturbar a integridade do gradiente. É importante construir os gradientes com cuidado e eficiência.
Se demorar muito ou se o gradiente for exposto à vibração, você não conseguirá recuperar as membranas sinápticas nas etapas posteriores. Agora, com outra pipeta pastor, coloque a fração de membrana epissomal sinap enriquecida no topo do gradiente preparado. Equilibre com precisão o gradiente em uma ultracentrífuga em um rotor de caçamba oscilante.
Em seguida, gire-o a 150.000 G por duas horas a quatro graus Celsius. Tenha muito cuidado ao remover o gradiente do balde após a centrifugação, deve haver faixas claras de solução de sacarose. Com frações de proteína em cada interface e um pellet, as frações não devem ser difusas.
Usando uma agulha de calibre 18 e uma seringa de um mililitro, perfure a parte mais baixa da interface molar de 1,2 e retire a faixa branca de proteína, que contém as membranas plasmáticas sinápticas. Registre o volume dessa camada. Transfira a camada para um tubo de ultracentrífuga de parede de 3,5 mililitros de espessura.
Adicione exatamente 2,5 volumes de quatro HEAs milimolares. Em seguida, prepare um tubo balanceador com solução de sacarose tamponada com HEAs 0,32 molar em um rotor de ângulo fixo, ultracentrifugue a amostra a 200.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o Sene e ressuspenda o sedimento da membrana plasmática sináptica.
Em 300 microlitros de 50 HEAs milimolares dois milimolares EDTA solução. A fração de densidade pós-sináptica ou fração PSD agora pode ser coletada pelo uso posterior das mesmas técnicas. As etapas estão claramente descritas no protocolo de texto.
Um western blot foi executado com uma proteína total, a membrana plasmática sináptica e as primeiras frações de proteína de densidade pós-sináptica. A fração PSD foi submetida a apenas um tratamento com detergente, e o tecido era de estriado de camundongo. Proteínas pré-sinápticas, como o transportador de dopamina, são enriquecidas na fração SPM, mas são eliminadas na etapa de detergente subsequente para enriquecimento de PSD.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todas as amostras no gelo e incluir inibidores de protease e fosfatase após este procedimento. Outros métodos, como análise de sangue ocidental ou eletroforese em gel bidimensional, podem ser realizados. Então você pode responder a perguntas como como o tratamento medicamentoso afeta os níveis de receptores na sinapse.
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Visão Geral
Este artigo detalha o enriquecimento de proteínas associadas à membrana plasmática sináptica por ultracentrifugação em um gradiente descontínuo de sacarose. O procedimento demonstra o fracionamento subcelular de tecido cerebral para enriquecimento de proteínas de membranas sinápticas e densidades pós-sinápticas.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Análise de Proteínas
Fundamentos
- Compreender os níveis de proteínas sinápticas é crucial para a pesquisa em neurociência.
- Membranas sinápticas e densidades pós-sinápticas desempenham papéis-chave na comunicação neuronal.
- A ultracentrifugação é uma técnica padrão para o enriquecimento de proteínas.
- Western blotting e 2D DIGE são métodos comuns para análise de proteínas.
Objetivo do Estudo
- Enriquecer proteínas de membranas sinápticas e densidades pós-sinápticas.
- Preparar extratos de proteínas adequados para análises adicionais.
- Demonstrar a eficácia de um gradiente descontínuo de sacarose no enriquecimento de proteínas.
Métodos Utilizados
- Homogeneização do tecido cerebral usando um homogeneizador motorizado.
- Série de etapas de centrifugação para preparar extratos de proteínas de membrana brutas.
- Camadas de extratos de membrana em um gradiente descontínuo de sacarose.
- Ultracentrifugação para coletar proteínas do gradiente.
Principais Resultados
- Enriquecimento bem-sucedido de proteínas da membrana plasmática sináptica.
- Preparação de proteínas da densidade pós-sináptica para análise.
- Os resultados podem indicar mudanças nos níveis de proteínas sinápticas.
- Adequado para análise de Western blot e 2D DIGE.
Conclusões
- O método efetivamente enriquece proteínas de membranas sinápticas.
- Fornece uma base para estudar a dinâmica das proteínas sinápticas.
- Pode ser aplicado a várias questões de pesquisa em neurociência.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Synaptic protein quantification enables mechanistic de-risking in CNS target validation by linking molecular changes to functional phenotypes. This subcellular fractionation method supports predictive confidence in early discovery by isolating disease-relevant synaptic compartments. It provides a disease-relevant system for assessing target engagement and pathway modulation in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantification of synaptic plasma membrane and postsynaptic density protein trafficking.
- Operational Value: Provides a standardized approach to isolate synaptic compartments for target de-risking.
- Predictive Value: Supports biomarker alignment by measuring changes in presynaptic and postsynaptic protein levels following pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated synaptic protein fractions for use in phenotypic screening assays to evaluate compound effects on synaptic integrity.
- Operational Value: Generates reproducible, quantitative protein outputs suitable for assay standardization and high-content analysis.
- Scalability: The discontinuous sucrose gradient method allows batch processing of samples for consistent screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant system modeling by isolating synaptic proteins from specific brain regions, such as striatum, to study neuropsychiatric targets.
- Operational Value: Supports translational biomarker development by providing quantifiable synaptic protein readouts correlated with functional outcomes.
- Risk Mitigation: Facilitates preclinical continuity by linking target modulation to measurable changes in synaptic protein composition.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative synaptic protein data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating synaptic compartments affected by neurotransmitter system perturbations.
- Screening: Enables assay readiness through production of enriched synaptic plasma membrane and PSD fractions suitable for Western blot or 2D DIGE analysis.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (protein band intensity) that allow comparison of synaptic protein levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by enabling assessment of synaptic protein changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for synaptic protein isolation across multiple CNS projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct measurement of synaptic protein trafficking.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via a well-established discontinuous sucrose gradient protocol with defined centrifugation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative synaptic protein data that de-risks CNS target progression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets based on measurable effects on synaptic protein composition and synaptic function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in subcellular fractionation, ultracentrifugation, and synaptic biology to ensure proper gradient formation and fraction collection.
- Dependent on access to ultracentrifuge with swinging bucket and fixed angle rotors, and capability to maintain samples at 4°C throughout processing.
- Necessitates cross-team standardization of gradient preparation, tissue homogenization, and protease/phosphatase inhibitor use to ensure reproducibility across sites.
- Requires adaptation considerations when applying to different brain regions or disease models due to variations in synaptic protein expression and tissue yield.
- Practical limitations include the need for fresh or properly stored tissue and careful handling to prevent gradient disruption from vibration or delays during setup.
