Preparação do Synaptic Plasma Membrane e Proteínas de densidade pós-sinápticos Usando um gradiente de sacarose descontínuo
3 de setembro de 2014
Este artigo fornece detalhes sobre o enriquecimento de proteínas associadas com a membrana de plasma sináptico por ultracentrifugação num gradiente de sacarose descontínuo. A elaboração definitiva de proteínas de densidade pós-sináptica é também descrito. Preparações de proteínas são adequados para western blot ou análise 2D DIGE.
O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o fracionamento subcelular do tecido cerebral usando um gradiente de sacarose descontínuo para enriquecer proteínas das membranas sinápticas e pós-densidades sinápticas. Isso é feito primeiro homogeneizando o tecido cerebral com um homogeneizador motorizador. Em seguida, há uma série de etapas de centrifugação para preparar extratos brutos de proteína de membrana.
Os extratos de membrana são então colocados em camadas em um gradiente de sacarose descontínuo para ultracentrifugação. A etapa final é coletar as proteínas do gradiente. Em última análise, os resultados podem mostrar mudanças nos níveis de proteínas sinápticas por meio da análise de Western blot.
Esta é uma técnica bem estabelecida que tem sido usada por neurocientistas há mais de 40 anos. Nós o usamos em nosso laboratório para entender como a composição proteica da sinapse muda quando perturbamos diferentes sistemas de neurotransmissores. A principal vantagem dessa técnica sobre outros métodos, como gradientes por chamada ou gradientes contínuos de sacarose, é que os gradientes descontínuos de sacarose são mais fáceis de construir manualmente.
Este protocolo faz uso de um homogeneizador de Teflon de vidro acionado por motor, sempre substitua o pilão entre as amostras e enxágue e seque. O homogeneizador primeiro, carregue o tecido dissecado em um tubo de 13 mililitros com quatro mililitros de solução de sacarose tamponada com HEPA 0,32 molar. Em seguida, transfira o tecido para um homogeneizador de vidro limpo.
Ajuste o motor para 900 RPM e homogeneize a amostra com 12 golpes em 30 segundos, usando menos de quatro gramas de tecido garante um bom fracionamento, transfira a amostra de volta para o tubo e armazene uma alíquota de 100 microlitros a 80 graus Celsius negativos para análise de proteína. Em seguida, separar o material nuclear centrifugando o homogenato a 900 G durante 10 minutos. A quatro graus Celsius, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 15 mililitros.
O sobrenadante contém a fração bruta da membrana. Agora, para enriquecer para a centrífuga de sinaptossomo bruto, o sobrenadante a 10.000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante. O pellet contém a fração bruta de sinaptossomo Resus.
Suspenda-o em um mililitro de solução de sacarose 0,32 molar. Em seguida, em mais três mililitros de solução para a suspensão, centrifugue a fração bruta por 15 minutos A 10.000 G a quatro graus Celsius, remova o sobrenadante. Agora pique rapidamente o pellet, ressuspenda o pellet em um mililitro de água pura.
Em seguida, adicione mais três mililitros de água rapidamente. Transfira isso para o homogeneizador. Aplique três movimentos com a mão e transfira-o de volta para o tubo de 13 mililitros.
Ajuste rapidamente a amostra de volta para quatro HEAs milimolares com uma adição de 16 microlitros de HEAs de um molar e misture-a por inversão. Agora coloque a amostra em um rotador a quatro graus Celsius por meia hora. Para garantir a lise da amostra, termine o fracionamento peletizando a fração P lisada de dois primos.
Centrifugar a 25 000 G durante 20 minutos a quatro graus Celsius, retirar o sobrenadante, ressuspender o sedimento num mililitro de solução de sacarose. Este contém as membranas epissómicas sinapsis enriquecidas. Primeiro, pré-meça os tampões para fazer um gradiente de sacarose descontínuo.
Carregue três tubos da seguinte maneira, um com exatamente 3,5 mililitros de solução de sacarose tamponada com 1,2 molar. Outro com exatamente três mililitros de solução molar 1,0 e o terceiro com três mililitros de solução molar 0,8. Em seguida, com uma pipeta de vidro, transfira a solução de sacarose molar 1,2 molar para um tubo de ultracentrífuga de polímero de 12 mililitros.
Com uma nova pipeta, coloque cuidadosamente a solução molar 1,0 na solução molar 1,2. Não perturbe a solução molar de 1,2 nem introduza bolhas com a pipeta. Use a mesma técnica para colocar a solução molar de 0,8 por cima.
Tome cuidado. Pequenas vibrações de um vórtice de bancada ou microcentrífuga são suficientes para perturbar a integridade do gradiente. É importante construir os gradientes com cuidado e eficiência.
Se demorar muito ou se o gradiente for exposto à vibração, você não conseguirá recuperar as membranas sinápticas nas etapas posteriores. Agora, com outra pipeta pastor, coloque a fração de membrana epissomal sinap enriquecida no topo do gradiente preparado. Equilibre com precisão o gradiente em uma ultracentrífuga em um rotor de caçamba oscilante.
Em seguida, gire-o a 150.000 G por duas horas a quatro graus Celsius. Tenha muito cuidado ao remover o gradiente do balde após a centrifugação, deve haver faixas claras de solução de sacarose. Com frações de proteína em cada interface e um pellet, as frações não devem ser difusas.
Usando uma agulha de calibre 18 e uma seringa de um mililitro, perfure a parte mais baixa da interface molar de 1,2 e retire a faixa branca de proteína, que contém as membranas plasmáticas sinápticas. Registre o volume dessa camada. Transfira a camada para um tubo de ultracentrífuga de parede de 3,5 mililitros de espessura.
Adicione exatamente 2,5 volumes de quatro HEAs milimolares. Em seguida, prepare um tubo balanceador com solução de sacarose tamponada com HEAs 0,32 molar em um rotor de ângulo fixo, ultracentrifugue a amostra a 200.000 G por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o Sene e ressuspenda o sedimento da membrana plasmática sináptica.
Em 300 microlitros de 50 HEAs milimolares dois milimolares EDTA solução. A fração de densidade pós-sináptica ou fração PSD agora pode ser coletada pelo uso posterior das mesmas técnicas. As etapas estão claramente descritas no protocolo de texto.
Um western blot foi executado com uma proteína total, a membrana plasmática sináptica e as primeiras frações de proteína de densidade pós-sináptica. A fração PSD foi submetida a apenas um tratamento com detergente, e o tecido era de estriado de camundongo. Proteínas pré-sinápticas, como o transportador de dopamina, são enriquecidas na fração SPM, mas são eliminadas na etapa de detergente subsequente para enriquecimento de PSD.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter todas as amostras no gelo e incluir inibidores de protease e fosfatase após este procedimento. Outros métodos, como análise de sangue ocidental ou eletroforese em gel bidimensional, podem ser realizados. Então você pode responder a perguntas como como o tratamento medicamentoso afeta os níveis de receptores na sinapse.
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Visão Geral
Este artigo detalha o enriquecimento de proteínas associadas à membrana plasmática sináptica por ultracentrifugação em um gradiente descontínuo de sacarose. O procedimento demonstra a fracionamento subcelular de tecido cerebral para enriquecer proteínas de membranas sinápticas e densidades pós-sinápticas.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Análise de Proteínas
Contexto
- Compreender os níveis de proteínas sinápticas é fundamental para a pesquisa em neurociência.
- As membranas sinápticas e as densidades pós-sinápticas desempenham papéis-chave na comunicação neuronal.
- A ultracentrifugação é uma técnica padrão para enriquecimento de proteínas.
- O Western blot e o DIGE 2D são métodos comuns para análise de proteínas.
Objetivo do Estudo
- Enriquecer proteínas provenientes de membranas sinápticas e densidades pós-sinápticas.
- Preparar extratos proteicos adequados para análises posteriores.
- Demonstrar a eficácia de um gradiente descontínuo de sacarose no enriquecimento de proteínas.
Métodos Utilizados
- Homogeneização de tecido cerebral utilizando um homogeneizador mecânico.
- Série de etapas de centrifugação para preparar extratos brutos de proteínas de membrana.
- Aplicação dos extratos de membrana sobre um gradiente descontínuo de sacarose.
- Ultracentrifugação para coletar as proteínas do gradiente.
Resultados Principais
- Enriquecimento bem-sucedido de proteínas da membrana plasmática sináptica.
- Preparação de proteínas da densidade pós-sináptica para análise.
- Os resultados podem indicar alterações nos níveis de proteínas sinápticas.
- Adequado para análise por Western blot e DIGE 2D.
Conclusões
- O método enriquece efetivamente proteínas provenientes de membranas sinápticas.
- Fornece uma base para o estudo da dinâmica de proteínas sinápticas.
- Pode ser aplicado a diversas questões de pesquisa em neurociência.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação de proteínas sinápticas permite a desativação mecanicista em validação de alvos no SNC, vinculando alterações moleculares a fenótipos funcionais. Este método de fracionamento subcelular sustenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, isolando compartimentos sinápticos relevantes à doença. Ele fornece um sistema relevante à doença para avaliar o engajamento de alvos e a modulação de vias em modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da quantificação do tráfego de proteínas da membrana plasmática sináptica e da densidade pós-sináptica.
- Valor Operacional: Oferece uma abordagem padronizada para o isolamento de compartimentos sinápticos com finalidade de desvio de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia o alinhamento de biomarcadores ao medir alterações nos níveis de proteínas pré-sinápticas e pós-sinápticas após modulação da via.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara frações de proteínas sinápticas validadas para uso em ensaios de triagem fenotípica destinados a avaliar os efeitos de compostos sobre a integridade sináptica.
- Valor Operacional: Gera saídas proteicas quantitativas e reprodutíveis, adequadas para padronização de ensaios e análise de alto conteúdo.
- Escalabilidade: O método de gradiente descontínuo de sacarose permite o processamento em lote de amostras para prontidão consistente em triagens.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Permite a modelagem de sistemas relevantes para doenças mediante o isolamento de proteínas sinápticas de regiões cerebrais específicas, como o estriado, para estudar alvos neuropsiquiátricos.
- Valor Operacional: Apoia o desenvolvimento de biomarcadores translacionais ao fornecer leituras quantificáveis de proteínas sinápticas correlacionadas com desfechos funcionais.
- Mitigação de Riscos: Facilita a continuidade pré-clínica ao vincular a modulação do alvo a alterações mensuráveis na composição de proteínas sinápticas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica, fornecendo dados quantitativos sobre proteínas sinápticas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao isolar compartimentos sinápticos afetados por perturbações no sistema de neurotransmissores.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios mediante a produção de frações enriquecidas de membrana plasmática sináptica e de PSD adequadas para análise por Western blot ou DIGE bidimensional.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes (intensidade de bandas proteicas) que permitem comparar níveis de proteínas sinápticas entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à continuidade pré-clínica ao possibilitar a avaliação de alterações em proteínas sinápticas em modelos de doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o isolamento de proteínas sinápticas em diversos projetos do SNC e classes de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio da medição direta do tráfego de proteínas sinápticas.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e padronização por meio de um protocolo bem estabelecido de gradiente descontínuo de sacarose com etapas definidas de centrifugação.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao fornecer dados precoces e quantitativos sobre proteínas sinápticas que reduzem os riscos na progressão de alvos do SNC.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos do SNC com base em efeitos mensuráveis na composição de proteínas sinápticas e na função sináptica.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em fracionamento subcelular, ultracentrifugação e biologia sináptica para garantir a formação adequada do gradiente e a coleta das frações.
- Depende do acesso a ultracentrífuga com rotor de balde oscilante e rotor de ângulo fixo, e capacidade de manter as amostras a 4°C durante todo o processamento.
- Necessita padronização entre equipes no preparo do gradiente, homogeneização do tecido e uso de inibidores de protease/fosfatase para assegurar reprodutibilidade entre diferentes locais.
- Requer considerações de adaptação ao ser aplicado a diferentes regiões cerebrais ou modelos de doenças, devido a variações na expressão de proteínas sinápticas e no rendimento do tecido.
- As limitações práticas incluem a necessidade de tecido fresco ou adequadamente armazenado e manipulação cuidadosa para evitar a ruptura do gradiente por vibrações ou atrasos durante a montagem.
