Name: Preparação do Synaptic Plasma Membrane e Proteínas de densidade pós-sinápticos Usando um gradiente de sacarose descontínuo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprenda a enriquecer proteínas de membrana sináptica e densidades pós-sinápticas usando gradiente de sacarose descontínuo e ultracentrifugação. Este método estabelecido permite analisar alterações nos níveis de proteínas sinápticas por Western blot.

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Os autores agradecem ao Dr. Mike Ehlers e aos membros de seu laboratório por demonstrarem originalmente o protocolo de fracionamento subcelular de membranas plasmáticas sinápticas. Também agradecemos a Wendy Horsfall pelo manejo das colônias de ratos. Este trabalho foi apoiado por subvenções operacionais do CIHR (AJR e AS).

O protocolo a seguir está de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidado Animal e foi aprovado pela Faculdade de Medicina e do Comitê Animal Care Farmácia da Universidade de Toronto. 1 Prepare Obrigatório Reagentes conforme descrito na Tabela 1 <ol><li> Adicionar protease e da fosfatase (se necessário) os inibidores a todas as soluções de sacarose, tampões e ddH2O para concentrações descritas na Tabela 1. Importante: executar todos os passos a 4 ° C e pré-fresco todos os reagentes e equipamentos antes do início da experiência. Rotular todos os tubos, incluindo tubos de ultracentrífuga, com marcador permanente. </li></ol> 2 Dissecção da região do cérebro adequada <ol><li> Sacrificar o animal por deslocamento cervical ou decapitação. Casa e eutanásia de animais de acordo com as políticas institucionais e governamentais sobre cuidados com os animais. </li><li> Rapidamente remover ªe cérebro do crânio e colocar em um bloco de dissecção gelada. </li><li> Dissecar a região do cérebro apropriado de tecido fresco e vá para a Etapa 3. </li></ol> 3. Tissue homogeneização com Motor Impulsionada Glass-Teflon Homogeneizador <ol><li> Coloque 50-100 mg (de SPM), ou 100-200 mg (por PSD) do tecido dissecado em um tubo de polipropileno de 13 ml rotulados, contendo 4 ml de solução de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES. Transfira a amostra para 15 ml de um tecido de vidro cónico-moinho Teflon / homogeneizador, definir o accionamento do motor para 900 rpm (posição 7) e homogeneizar a amostra com 12 pancadas ao longo de um período de 30 seg. Use um homogeneizador de vidro-Teflon diferente entre as amostras, ou lavar o homogeneizador com água fria destilada entre amostras e seque com um Kimwipe. NOTA: até 4 g de tecido podem ser homogeneizados em 4 ml de solução de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES, no entanto, é aconselhável a utilização de menos tecido para assegurar o fraccionamento adequado. </li><li> Transferir a amostra homogeneizada para trás to o mesmo tubo de 13 ml de polipropileno. Reserva de 100 ul de homogeneizado e armazenar a -80 ° C para posterior quantificação de proteínas e análise de transferência de western da fracção de proteína total. </li></ol> 4. baixa velocidade de centrifugação para remover a Fração Nuclear (Yields sobrenadante S1) <ol><li> Centrifugar o homogenato num rotor de ângulo fixo a 900 xg durante 10 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante (S1) para um novo, rotulado 13 ml tubo e ressuspender o sedimento de fracção nuclear (P1) em 500 mL de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES. NOTA: O (P1) fracção pode ser armazenada a -80 ° C e utilizada para a análise de transferência western da fracção nuclear. </li></ol> 5. enriquecimento da fracção bruta sinaptossomais (Yields Pellet P2) <ol><li> Centrifuga-se o sobrenadante (S1) a 10.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Retirar o sobrenadante (S2) e 500 ul de reserva em um tubo de microcentrífuga para armazenar a -80 ° C para subsequente quant proteínasificação e western blot da fração citosólica da membrana / light. Ressuspender o sedimento fracção sinaptosomal em bruto remanescente (P2) em 1 ml de solução de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES e, em seguida, adicionar uma outra solução de 3 ml de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES. </li><li> Centrifuga-se a 10000 x g durante 15 min a 4 ° C. Retirar o sobrenadante (S2) e de reserva de 500 ul num tubo de microcentrífuga para armazenar a -80 ° C para posterior quantificação de proteínas e análise de Western blot da fracção citosólica membrana / luz. Salve o pellet sinaptosomal bruto lavado (P2 &#39;) no tubo de polipropileno. </li></ol> 6. Lise (hiposmótico Choque) da Fração Crude sinaptossomais <ol><li> Lise do sedimento sinaptosomal bruto (P2 &#39;) no tubo de polipropileno por ressuspensão lo em 1 ml de ddH 2 O. Adicionar mais 3 ml de DDH 2 O, transferir para um homogeneizador de tecido de vidro-Teflon, e homogeneizar à mão com três golpes. NOTA: É importantepara realizar esta etapa o mais rápido possível e rapidamente avançar para o passo 6.2. </li><li> Amostras de transferência do homogeneizador de volta na mesma 13 ml tubo de polipropileno e rapidamente ajustar a amostra de volta para HEPES 4 mM com 16 mL de uma solução M HEPES, inverter para misturar. </li><li> Rodar as amostras a 4 ° C durante 30 minutos para assegurar a lise completa. </li></ol> 7 Enriquecimento da Fração sinaptossomais Membrane (P3) <ol><li> Centrifuga-se a 25000 x g durante 20 min a 4 ° C. Retirar o sobrenadante fracção vesicular bruto (S3) e reservar com um tubo de 5 ml para armazenar a -80 ° C para posterior quantificação de proteínas e análise de transferência de western. Ressuspender a fracção de membrana sinaptosomal (P3) em 1 ml de solução de sacarose 0,32 M tamponada com HEPES. </li></ol> 8 Preparação do gradiente de sacarose descontínuo <ol><li> Pipetar exactamente 3,5 ml de solução de sacarose 1,2 M tamponada com HEPES e exactamente 3,0 ml cada de 1,0 M e 0,8 M HEPESolução de sacarose tamponada-S em separado 6 ml encaixar tubos de capitalização. NOTA: Isto é feito a pré-medir os volumes dos buffers que são usados ​​para fazer o gradiente de sacarose. Medição exacta dos volumes é importante para assegurar que os gradientes resultantes irá ser equilibrada por ultracentrifugação. </li><li> Usando uma pipeta Pasteur e bulbo de vidro, transferir 1,2 M HEPES solução de sacarose a 12 ml polialómero tubo ultracentrífuga. Colocar cuidadosamente a solução de sacarose 1,0 M HEPES no topo da solução de sacarose 1,2 M tamponado com HEPES. Por fim, a camada de solução de sacarose 0,8 M HEPES no topo da solução de sacarose 1,0 M tamponado com HEPES. Use uma pipeta Pasteur fresco para cada solução de sacarose e tomar cuidado para não perturbar o gradiente de sacarose. As vibrações de um vórtice banco ou microcentrifuge vai perturbar a integridade do gradiente. </li><li> Utilizando uma pipeta de Pasteur, a camada de fracção de membrana sinaptosomal ressuspenso (P3) na parte superior do gradiente de sacarose descontínuo preparado.Certifique-se de que os gradientes são equilibradas por pesá-las dentro do balde da caçamba móvel rotor. Se os recipientes não estão equilibrados, utilizar uma pipeta de P200 para adicionar cuidadosamente sacarose 0,32 M tamponada com HEPES para o topo do gradiente e equilibrar os baldes de rotor. </li></ol> 9 Fracionamento do Plasma Membrane Synaptic (SPM) <ol><li> Ultracentrífuga num rotor basculante a 150.000 xg durante 2 horas a 4 ° C. Remova cuidadosamente os gradientes de sacarose dos baldes de ultracentrífuga. Usando uma agulha de 18 G e seringa de 1 ml, perfurar o tubo no fundo da solução de sacarose 1,0 M interfase / 1,2 M de HEPES e retirar a camada de membrana de plasma sináptico (SPM). </li><li> Anote o volume que cada amostra SPM ocupa na seringa de 1 ml. Coloque a camada SPM recolhido em 3,5 ml de tubos de ultracentrífuga de parede espessa, adicionar exactamente 2,5 volumes de HEPES 4 mM para ajustar a concentração de sacarose de 1,2 M a 0,32 M. Depois de cada amostra foi ajustared para 0,32 M de sacarose, equilibrar os tubos com solução de sacarose 0,32 M HEPES. </li><li> Ultracentrífuga num rotor de ângulo fixo a 200.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Remova e descarte o sobrenadante. Ressuspender o sedimento de membranas de plasma sináptico (SPM) em 300 ul de solução 50 mM de EDTA HEPES / 2 mM. Armazenar as amostras a -80 ° C até ser utilizado para transferência de western. </li></ol> 10 Preparação da Fração densidade pós-sináptico (PSD) <ol><li> Descongele amostras SPM no gelo. </li><li> Adicione uma solução de 0,54% de Triton X-100 em solução de EDTA a 50 mM de HEPES / 2 mM. </li><li> Em um tubo de poliestireno de 5 ml, 2,7 ml de combinar de Triton X-100 / HEPES / solução de EDTA e 300 ul fracção SPM e girar a amostra durante 15 min a 4 ° C </li><li> Amostras de transferência para 3,5 ml tubos de ultracentrífuga de parede espessa e amostras centrifugar a 32.000 xg por 20 min a 4 ° C. </li><li> Reservamo-nos o sobrenadante (Triton X-100 fração solúvel [TS]) e armazenar a -80; ° C. NOTA: Nesta fase, o pellet representa a fração &quot;PSD-1T&quot;. Um segundo tratamento com detergente vai produzir uma fracção de &quot;PSD-2T&quot;. Se uma fração PSD-1T é desejada, vá para o passo 10.6. <ol><li> Para produzir uma fracção PSD-2T, ressuspender o sedimento em 3 ml de 0,5% de Triton X-100 em 50 mM de HEPES / EDTA a 2 mM. Rodar as amostras durante 15 min a 4 ° C. Centrifugar as amostras a 32.000 xg por 20 min a 4 ° C e vá para a etapa 10.6. </li></ol></li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o pós-sináptica (PSD) sedimento em solução de 50 HEPES / EDTA 2 mM. NOTA: O volume de ressuspensão pode depender do tamanho do pelete; Recomenda-se um volume de 50-75 mL. Porque a fracção PSD é uma fracção insolúvel em detergente, é muitas vezes necessário adicionar 1-2 mL de 0,5% de SDS, para permitir a ressuspensão completa de proteína. Armazenar as amostras a -80 ° C até ser utilizado para transferência de western. </li></ol>

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<li>Otera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+targeting+signal+receptor+Pex5p+interacts+with+cargoes+and+import+machinery+components+in+a+spatiotemporally+differentiated+manner%3A+conserved+Pex5p+WXXXF%2FY+motifs+are+critical+for+matrix+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import.</a> Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).</li>
<li>Goubaeva, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondrial+connexin+43+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).</li>
<li>Lamers, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+S-100B%2C+neuron-specific+enolase+%28NSE%29%2C+myelin+basic+protein+%28MBP%29+and+glial+fibrillary+acidic+protein+%28GFAP%29+in+cerebrospinal+fluid+%28CSF%29+and+blood+of+neurological+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients.</a> Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).</li>
<li>Arunachalam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Munc18-1+is+critical+for+plasma+membrane+localization+of+syntaxin1+but+not+of+SNAP-25+in+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells.</a> Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).</li>
<li>Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+bassoon+among+ribbon+synapses+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina.</a> Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Existem várias etapas do procedimento que são fundamentais para um bom resultado. No passo 3, é importante que um grau consistente de homogeneização é obtido para cada amostra. Quando homogeneizar o tecido com o homogeneizador accionado por motor, uma velocidade constante é utilizado não só para a rotação do pilão, mas também com o número de acidentes vasculares cerebrais. O tempo de incubação durante o choque osmótico deve ser mais preciso, uma vez que a homogeneização prolongada ou de incubação na solução hipotónica i...

Os neurônios se comunicam através de sinapses, ea qualidade desta comunicação é regulado, em grande medida por alterações na composição das proteínas na sinapse. Em particular, as proteínas localizadas na densidade pós-sináptica participar na comunicação neuronal por receptores de neurotransmissores intimamente andaime com os seus sistemas de transdução de sinal 1. Além disso, alterações na duração da força de eficácia sináptica são controladas por meio da adição ou remoção de receptores na densidade pós-sináptica 1-6. Portanto, o isolamento e quantificação de proteínas sinápticas é uma técnica útil e necessário para obter insights sobre os caminhos que os neurônios respondem a estímulos e alterar eficácia sináptica 7. Este artigo descreve uma técnica comum para isolar proteínas sinápticas de tecido cerebral dos roedores por ultracentrifugação em gradiente de sacarose descontínuo. A fracção de membrana de plasma sináptico podem ser enriquecidas e isoladas com base ema sua densidade em sacarose, que tenha sido determinada empiricamente para ser semelhante a 1,2 M de sacarose. Dependendo da causa biológica, fracções subcelulares podem ser separados por gradientes contínuos ou descontínuos de Percoll ou sacarose ou. Gradientes contínuos permitem a separação de proteínas em várias fracções; isto pode ser particularmente útil para demonstrar a co-localização de proteínas no interior de uma dada fracção 8. No entanto, a preparação de gradientes contínuos é mais trabalhoso e não é necessária para muitas aplicações. Gradientes descontínuos são comparativamente mais fáceis de preparar e pode ser usada para separar proteínas em algumas fracções, geralmente definidos. Gradientes descontínuos que são compostos por três camadas de aumento de sacarose molaridade têm sido amplamente utilizados para isolar as proteínas associadas com a membrana de plasma sináptico (SPM). Esta fracção de membrana de plasma sináptico pode ser ainda processado para a fractio densidade pós-sináptican (PSD) por tratamento com detergente e isolamento da fracção insolúvel em detergente. Quando este processo foi descrito pela primeira vez na década de 1960 9,10, microscopia eletrônica foi utilizada para demonstrar as organelas e membranas que cerca definem a membrana plasmática sináptica e frações de densidade pós-sináptica 9-14. Estes estudos demonstraram a inclusão de membranas pré-e pós-sinápticos e vesículas sinápticas em fracção do SPM; após tratamento com detergente principalmente o elétron-denso, densidade pós-sináptica eram visíveis. No processo, um choque hipotónico é usado para comprimir fora os processos sinápticas do corpo da célula 10. Esta etapa leva vantagem de o facto de que as mitocôndrias são mais resistentes a choque osmótico e permanecem intactos, de modo que eles e sedimentam na parte inferior do gradiente de sacarose (Figura 1). Usando a mesma técnica de enriquecimento, as frações de SPM e PSD foram os primeiros bioquimicamentedefinido por electroforese em gel de poliacrilamida e sequenciação dos principais componentes proteicos 15-17. Análise de mancha ocidental Subsequentemente foi usado para detectar e quantificar os níveis de proteínas sinápticas e ainda definir estas fracções (Figura 2). Nós temos usado essa técnica em nossos laboratórios para quantificar mudanças nos níveis sinápticos do transportador de dopamina que ocorrem quando o locus SLC6A3 é duplicada em camundongos 18. Também tenho usado essa técnica em receptores NMDA camundongos deficientes para descobrir reduções específicas de sinapse em proteínas que fazem parte da DISC1 interactome 19. É evidente a partir da análise de Western blot que fracções SPM contêm proteínas de membrana de vesícula sináptica, marcadores endossoma, proteínas mitocondriais, enzimas associadas à membrana sintéticas e moléculas de transdução de sinal, bem como componentes integrais da densidade pós-sináptica e as membranas de plasma sinápticas 20-23. Efracções PSD ven pode ter contaminação com proteínas mitocondriais abundantes e pode ser necessário realizar um segundo gradiente de sedimentação ou de passos de purificação adicionais para removê-los 13. Recentemente, a espectrometria de massa quantitativo tem fornecido uma lista de mais de 100 proteínas na densidade pós-sináptica por si só, bem como uma indicação da abundância relativa destes componentes 24,25.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES, pH 7.4</td><td>BioShop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioBasic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>BioShop</td><td>PMS123.5</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>BioShop</td><td>APR600.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>BioShop</td><td>LEU001.1</td><td></td></tr><tr><td>Pepestatina</td><td>BioShop</td><td>PEP605.5</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidina</td><td>BioShop</td><td>BEN601.25</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de sódio</td><td>BioShop</td><td>SFL001.100</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfato de sódio</td><td>BioShop</td><td>SPP310.100</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato de sódio</td><td>BioShop</td><td>SOV664.10</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>BioShop</td><td>GYP001.10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>TRX506.500</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 &frac12; &rdquo; agulha</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 1 cc</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Vidro Homogeneizador de Teflon Kontes Duall 23</td><td>VWR</td><td>KT885450-0023</td><td></td></tr><tr><td>IKA Modelo RW 16 agitador básico</td><td>IKA Works</td><td>2572100</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SM-24 rotor de ângulo fixo</td><td>ThermoScientific</td><td>29017</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus centrífuga</td><td>ThermoScientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polialômero de parede fina (13,2 ml)</td>Balde oscilante com rotor <td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti</td> Ultracentrífuga de piso <td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L-80</td> Tubos de policarbonato de parede espessa <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3,5 ml)</td>Rotor <td></td><td></td> de ângulo fixo Beckman Coulter 349622 <td></td></tr><tr><td>TLA-100.3</td><td>Ultracentrífuga de mesa Beckman Coulter</td><td>349481</td><td></td></tr><tr><td>Beckman TL-100</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação do synaptic plasma membrane e proteínas de densidade pós-sinápticos usando um gradiente de sacarose descontínuo

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Técnicas de fraccionamento subcelular neuronais permitir a quantificação de proteínas, que são objecto de tráfico de e para a sinapse. Tal como foi inicialmente descrito, no final dos anos 1960, as proteínas associadas à membrana plasmática sináptica pode ser isolado por ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose. Uma vez que as membranas sinápticas são isolados, o complexo macromolecular conhecido como a densidade pós-sináptica pode ser subsequentemente isolado devido à sua insolubilidade em detergente. As técnicas utilizadas para isolar membrana plasmática sináptica e proteínas de densidade pós-sináptica permanecer essencialmente o mesmo depois de 40 anos, e são amplamente utilizados em pesquisas de neurociência atual. Este artigo fornece detalhes sobre o fraccionamento de proteínas associadas com a membrana plasmática sináptica e pós-sináptica de densidade utilizando um gradiente de sacarose descontínuo. Resultantes preparações de proteínas são adequados para western blot ou análise 2D DIGE.

A preparação do gradiente de densidade de sacarose deve resultar em uma separação clara entre as três soluções molares de sacarose (0,8, 1,0 e 1,2 M de sacarose). Ver Figura 3A para um exemplo do gradiente é adicionado antes da amostra de proteína. Se o gradiente é preparado com muita antecedência, ou se ele é preparado em uma superfície de bancada com a vibração de outro equipamento, o gradiente será comprometida e separação adequada não será alcançado. Se uma separação clara entre as três soluções não...

Este artigo fornece detalhes sobre o enriquecimento de proteínas associadas com a membrana de plasma sináptico por ultracentrifugação num gradiente de sacarose descontínuo. A elaboração definitiva de proteínas de densidade pós-sináptica é também descrito. Preparações de proteínas são adequados para western blot ou análise 2D DIGE.

Preparação do Synaptic Plasma Membrane e Proteínas de densidade pós-sinápticos Usando um gradiente de sacarose descontínuo

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar o fracionamento subcelular do tecido cerebral usando um gradiente de sacarose descontínuo para enriquecer proteínas das membranas sinápticas e pós-densidades sinápticas. Isso é feito primeiro homogeneizando o tecido cerebral com um homogeneizador motorizador. Em seguida, há uma série de etapas de centrifugação para preparar extratos brutos de proteína de membrana.Os extratos de membrana são então colocados em camadas em um gradiente de sacarose descontínuo para ultracentrifugação. A etapa final é coletar as proteínas do gradiente. Em última análise, os resultados podem mostrar mudanças nos níveis de proteínas sinápticas por meio da análise de Western blot.Esta é uma técnica bem estabelecida que tem sido usada por neurocientistas há mais de 40 anos. Nós o usamos em nosso laboratório para entender como a composição proteica da sinapse muda quando perturbamos diferentes sistemas de neurotransmissores. A principal vantagem dessa técnica sobre outros métodos, como gradientes por chamada ou gradientes contínuos de sacarose, é que os gradientes descontínuos de sacarose são mais fáceis de construir manualmente.Este protocolo faz uso de um ho

preparation-synaptic-plasma-membrane-postsynaptic-density-proteins

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um método para preparar traducionalmente ativa, synaptoneurosomes intacta (SNs) de córtex cerebral de rato é descrito. O método utiliza um gradiente de densidade descontínua Percoll-sacarose permitindo a preparação rápida de ativos SNs.

Preparação de Synaptoneurosomes de rato Cortex usando um gradiente de densidade Percoll descontínuo Sacarose-

Técnicas de microscopia de luz acopladas a ensaios bioquímicos elucidam o envolvimento da exocitose mediada por SNARE na ramificação do axônio dependente de netrina. Essa combinação de técnicas permite a identificação de mecanismos moleculares que controlam a ramificação do axônio e a mudança da forma celular.

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Este protocolo descreve um método fácil de extrair e fracionar transcritos de tecidos vegetais com base no número de ribossomos ligados. Permite uma estimativa global da atividade de tradução e a determinação do status translacional de mRNAs específicos.

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A identificação de moléculas e vias que controlam a plasticidade sináptica e a memória ainda é um grande desafio na neurociência. Aqui, é descrito um fluxo de trabalho abordando a quantificação relativa de proteínas sinápticas supostamente envolvidas na reorganização molecular das sinapses durante a aprendizagem e consolidação da memória em um paradigma de aprendizagem auditiva.

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Regulamento translacional desempenha um papel importante no controle da abundância de proteína. Aqui, descrevemos um método de alta produtividade para análise quantitativa de tradução em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae.

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Correção rápida in Vivo e isolamento de complexos translacionais de células eucarióticas

Este protocolo descreve como gerar um perfil de polissomo sem usar fabricantes automatizados de gradientes ou sistemas de fracionamento de gradiente.

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Fracionamento subcelular para o isolamento de componentes sinápticos do cérebro murino

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Um método aprimorado para isolar locais de contato mitocondrial

Aprenda a enriquecer proteínas de membrana sináptica e densidades pós-sinápticas usando gradiente de sacarose descontínuo e ultracentrifugação. Este método estabelecido permite analisar alterações nos níveis de proteínas sinápticas por Western blot.

Preparação do Synaptic Plasma Membrane e Proteínas de densidade pós-sinápticos Usando um gradiente de sacarose descontínuo

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