Name: Imagens em tempo real de axonal Transporte de Quantum Dot marcado BDNF na Primária Neurônios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda a rastrear o transporte axonal retrógrado de BDNF marcado com quantum dots em neurônios hipocampais de ratos usando câmaras microfluídicas e microscopia de fluorescência. Este método permite visualizar em tempo real a dinâmica de fatores neurotróficos.

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Gostaríamos de agradecer a Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit por sua assistência técnica. O estudo foi financiado pelo NIH concessão (PN2 EY016525) e pelo financiamento da Síndrome de Down Research Foundation e Tratamento eo Larry L. Fundação Hillblom.

Os procedimentos cirúrgicos e de animais são realizadas estritamente de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os experimentos que envolvem o uso de animais são aprovados por UCSD Animal Care Institucional e Comitê de Uso. 1. plasmídeo Clonagem, expressão e purificação do mono-biotinilado BDNF (mBtBDNF) NOTA: Construir pré-proBDNFavi e BirA cDNA em vetor pcDNA3.1 e co-expressar em células HEK293FT 10. Purificar mBtBDNF utilizando pérolas de Ni-NTA de acordo com o método previamente publicado de produzir factor de crescimento do nervo monobiotinylated madura e biologicamente activa (mBtNGF) 10. 2 Preparação de microfluídicos Chambers Microfluídicos dispositivo neurônio cultura torna possível isolar fluidicamente axônios de corpos celulares neurônio. Montar câmaras com lamelas recentemente pintadas direito antes de cada dissecção. Câmaras microfluídicos usadosneste protocolo são comercialmente adquirido (ver materiais e tabela do equipamento). Lave à mão e reutilizados câmaras adquiridas comercialmente até 5-6x. <ol><li> Somente lavagem à mão câmaras microfluídicos em 1% Alconox. Lavar três vezes com água Milli-Q durante 30 min cada. Câmaras de lavagem de mão novamente em etanol 70%. </li><li> Coloque para fora câmaras para secar em Parafilm na capela de fluxo laminar. Irradiar e esterilizar ambos os lados das câmaras, durante 20 min sob UV. Loja câmaras esterilizadas numa estéril 15 centímetros prato selado com Parafilm à temperatura ambiente. </li><li> Coloque 24 x 40 mm No. 1 lamínulas de vidro em um recipiente de vidro. Mergulhe as lamelas em ácido clorídrico a 35% durante a noite em um rotador. No dia seguinte, lavar as lamelas três vezes, durante 30 min cada, com água. </li><li> Esterilizar as lamelas, um por um, mergulhando cada lamela em etanol a 100% e ardor sobre um bico de Bunsen. Armazenar lamelas secas numa placa de Petri estéril e mantê-lo à temperatura ambiente até o revestimento. </li><li> Coloque UOt as lamelas em um 15 centímetros prato de cultura. Bata de cada lamela com 0,7 ml de 0,01% de poli-L-lisina (PLL) e incuba-se na capa, à temperatura ambiente. </li><li> Após 1 h, lavar as lamelas três vezes com água estéril. Lamelas secos com vácuo e coloque cada lamela em um prato de cultura 6 centímetros. </li><li> Para montar a câmara de microfluídica, coloque a câmara com o lado microgroove na parte inferior para a lamela PLL revestido com cuidado para não tocar nas estrias. Gentilmente pressionado a câmara com uma ponteira para garantir a câmara foi hermeticamente fechado. </li></ol> 3. Dissecção da Neuronal Cultura e Placa em Chambers <ol><li> Coloque dois hipocampos E17-E18 rato (um cérebro) dissecados em um tubo de 15 ml contendo 2 ml de tampão de dissecção (HBSS, sem cálcio, magnésio não, com 1% pen / strep e HEPES 10 mM. Lavar os tecidos 3x com 5 ml dissecção de tampão de cada vez. Remover o tampão de dissecção, tanto quanto possível, e adicionar 900 ul de di frescotampão ssection. </li><li> Para digerir o tecido, adicionar 100 ul de tripsina 10x (2,5%) no tampão de dissecção para tornar a concentração de trabalho 1x. Colocar o tubo cónico de 37 ° C Banho de água. Após 10 minutos de digestão, adicionar 100 ul de 10 mg / ml de ADNase I a uma concentração final de cerca de 1 mg / ml. </li><li> Usando uma pipeta Pasteur de vidro polido-fogo, triturar suavemente os tecidos pipetando para cima e para baixo 5-10x. Logo após a trituração, extinguir a tripsina com 2 ml de meio (chapeamento Neurobasal com 10% de FBS, 2 mM de GlutaMax, 2% B27). </li><li> Deixar a amostra na capa por 5 minutos para permitir que todos os restos dos tecidos para se estabelecer para o fundo. Remover cuidadosamente 2 mL de sobrenadante para um tubo de 15 ml estéril cónico limpo e centrifugar a 200 xg durante 5 min para sedimentar as células. Ressuspender o sedimento em 50 mídia ul chapeamento </li><li> Contar as células com hemocitômetro. Carga 15-20 ul de suspensão de células (~ 40.000 células) em um compartimento da câmara de microfluidos. Coloque a câmarana incubadora durante 10 minutos para permitir que as células se fixem à lamela. Após 10 min, adicionar mídia mais chapeamento para encher ambos os compartimentos da câmara. </li><li> No segundo dia da dissecção, substituir completamente os meios de chapeamento com meio de manutenção (Neurobasal com GlutaMax 2 mM, 2% B27), tanto no corpo da célula e o compartimento do axónio. Os axônios dos neurônios do hipocampo começa a atravessar as estrias no dia 3 e atingir o compartimento do axônio entre os dias 5-7. Durante este período de tempo, substitua metade da media cultura com meio de manutenção fresco todos os 24 ~ 48 horas. </li></ol> 4. axonal Transporte de QD-BDNF <ol><li> Antes da imagiologia de viver QD-BDNF transporte axonal, esgotar o BDNF, tanto do corpo da célula e os compartimentos de axónios da câmara de microfluidos por enxaguar ambos os compartimentos com o BDNF-livre, livre de soro mídia Neurobasal cada 30 min durante 2 horas. </li><li> Durante a depleção de BDNF, preparar os conjugados QD-BDNF. Misturar 50 nM de mono-biotinilado BDNF dímero com 50 nM QD655 conjugados com estreptavidina em meio Neurobasal e incubar em gelo durante 60 min. </li><li> Retirar mídia no compartimento axonal e adicionar 300 ul QD-BDNF com uma concentração final de 0,25 nM durante 4 horas a 37 ° C. Para minimizar a difusão de QD-BDNF no compartimento do corpo da célula, é muito importante para manter sempre um nível mais elevado de meios no compartimento do corpo de célula do que no compartimento do axónio. Lavar desvinculado QD-BDNF após incubação antes de imagem ao vivo. </li><li> Realizar imagens ao vivo de transporte QD-BDNF usando um microscópio invertido equipado com uma lente objectiva de óleo 100X. Aquecer o escopo e a câmara ambiental a ela ligada a uma temperatura constante (37 ° C) e de CO 2 (5%). Uso de um conjunto de cubos Texas excitação / emissão de vermelho para visualizar o sinal de QD655. </li><li> Adquirir e capturar imagens de lapso de tempo dentro dos axônios média na velocidade de um quadro / segundo para um total de 2 min usando uma câmera CCD. Use microgrooves sem axônios that não têm QD e, portanto, nenhum sinal de controlo para a infiltração. </li><li> Analisar transporte BDNF usando qualquer software de análise de imagem ou NIH ImageJ. </li></ol>

<ol><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+dynein-microtubule+network+is+required+for+NGF+signaling+through+the+Rap1%2FMAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway.</a> Traffic. 8, 1503-1520 (2007).</li>
<li>Wortzel, I., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERK+Cascade%3A+Distinct+Functions+within+Various+Subcellular+Organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+cancer%22%5BJournal%5D)">The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles.</a> Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).</li>
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<li>Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+over-expression+in+the+forebrain+ameliorates+Huntington%27s+disease+phenotypes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice.</a> Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).</li>
<li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li>
<li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li>
<li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste estudo, descrevemos o desenvolvimento de uma nova técnica para produzir biologicamente activo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que podem ser utilizados para rastrear o transporte axonal de BDNF. Conjugando a proteína a estreptavidina quantum dot, e usando uma câmara de microfluidos, o método permite detectar o transporte axonal de BDNF nos neurónios primários com sensibilidade única molécula, em tempo real e com resolução espacial e temporal. As ferramentas aqui utilizadas fornecer um meio pelo qual a estudar as m...

Os neurônios são as células cujos processos longos e muitas vezes altamente elaborados são fundamentais para estabelecer e manter a estrutura ea função dos circuitos neurais altamente polarizada. O axônio desempenha um papel vital no que transportam cargas de e para as sinapses. As proteínas e organelas sintetizados no soma célula necessita de ser transportado por axónios para chegar ao terminal pré-sináptico para suportar a função neuronal. Do mesmo modo, os sinais recebidos pelo axónios distais devem ser transduzidas e transportado para o soma. Estes processos são essenciais para a sobrevivência neuronal, diferenciação e manutenção. Em que o transporte axonal em neurónios algumas deve ser conduzida através de distâncias mais do que 1000 vezes o diâmetro do corpo da célula, a possibilidade é facilmente imaginado que mesmo pequenos défices pode impactar significativamente a função neuronal e o circuito. Derivado de factor neurotrófico cerebral (BDNF), um membro da família da neurotrofina de factores de crescimento, está presente na maregiões do cérebro, incluindo ny hipocampo, córtex cerebral, e do prosencéfalo basal. BDNF desempenha um papel crucial na formação da memória e cognição, através do apoio da sobrevivência, diferenciação e função de neurónios que participam em circuitos cognitivos. BDNF se liga ao seu receptor, a tirosina-cinase TrkB, no terminal axonal em que activa as vias de sinalização mediadas por TrkB, incluindo a proteína quinase activada por mitógeno / regulada por sinal extracelular da proteína cinase (MAPK / ERK), fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) e fosfolipase C-gama (PLCy). As proteínas que participam nestas vias de sinalização são empacotados em vesículas de endocitose para formar o BDNF / TrkB sinalização endosome 1-6 que são, então, transportado retrogradamente à soma neuronal. A câmara de cultura de microfluidos é uma plataforma muito útil para estudar a biologia axonal, em condições normais, bem como na definição de lesões e doenças 7,8. Por axônios isolandodos corpos celulares, o dispositivo tem permitido um para estudar o transporte especificamente em axônios 8-10. As plataformas microfluídicos baseados PDMS com 450 mM barreiras microgroove utilizados neste estudo foram adquiridos comercialmente (ver tabela de materiais). Para examinar o transporte BDNF, desenvolvemos uma nova tecnologia para produzir monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Tiramos proveito do peptídeo biotina aceitante, AP (também conhecido como AviTag). É uma sequência de 15 aminoácidos que contém um resíduo de lisina, que pode ser especificamente ligado a uma biotina pela Escherichia coli enzima biotina ligase, BirA. Nós fundido a AviTag para o C-terminal do rato pré-proBDNF cDNA por PCR (Figura 1A). A construção foi clonada no vector de expressão de mamífero, pcDNA3.1 Myc-His vector. Nós também clonado o DNA bacteriano BirA na pcDNA3.1 Myc-His vector. Os dois plasmídeos foram co-transfectadas transientemente em células HEK293FT para expressar ambas as proteínas. BirA catalisou a ligadura da biotaem que especificamente a lisina residir no AviTag no C-terminal do BDNF a uma razão de 1: 1 para produzir monobiotinylated monómero BDNF. Biotinilado, BDNF madura com uma massa molecular de ~ 18 kDa foi recuperada e purificada a partir dos meios utilizando Ni-resina (Figura 1C). A biotinilação de FNDC estava completa, conforme avaliado pela incapacidade para detectar o BDNF não modificado por imunotransferência (Figura 1E). Estreptavidina conjugada pontos quânticos, QD 655, foram utilizados para marcar mBtBDNF fazer QD-BDNF. A presença do AviTag não interferir com a actividade do BDNF como o mBtBDNF foi capaz de activar TrkB fosforilada (Figura 1E) e estimular o crescimento de neurites (Figura 1F) até ao ponto de BDNF recombinante humano (rhBDNF). Acms mostrado que QD-BDNF colocalized com TrkB em axónios do hipocampo, indicando que QD-BDNF é bioactivo (Figura 1G). Para estudar o transporte de BDNF, QD-BDNF foi adicionado ao compartimento do axónio distaiculturas de microfluidos contendo rato E18 neurónios do hipocampo (Figura 2A). QD-BDNF transporte retrógrado dentro de axônios foi capturado por em tempo real imagens ao vivo da etiqueta fluorescente vermelha (apoiando vídeos S1, S2). Ao analisar o quimógrafo gerado, QD-BDNF foi observada a ser transportados retrogradamente a uma velocidade de deslocamento de cerca de 1,06 pM / seg (Figura 3A). GFP ou mCherry-BDNF com etiquetas ter sido usado para controlar o movimento axonal de BDNF. As principais desvantagens são que eles não são brilhantes o suficiente para os estudos de moléculas individuais. Além disso, a presença de ambos os movimentos anterógrada e retrógrada BDNF torna difícil avaliar se ou não o BDNF transportado retrogradamente era um complexo de neurotrofina / receptor. Neste vídeo, demonstramos as técnicas utilizadas para examinar o tráfico ao vivo do QD-BDNF em câmaras microfluídicos usando neurônios primários. O ultrabrightness e excelente fotoestabilidade de pontos quânticos makes-se possível realizar de seguimento a longo prazo de transporte BDNF. Estas técnicas podem ser explorados para reforçar estudos de função axonal em AD, HD, e outras desordens neurodegenerativas.

<table><tbody><tr><td>Polimerase de DNA pfx de platina</td><td>Invitrogen</td><td>11708021</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0274</td><td></td></tr><tr><td>BamHI&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0054</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT células</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-mídia de alta glicose</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>D-biotina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect;</td><td>Fermentas</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Resinas Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td></td></tr><tr><td>Inibidores de protease coquetel</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; Kit de coloração de prata S8820</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>G-Biosciences</td><td>786-30</td><td></td></tr><tr><td>BDNF humano recombinante</td><td>Genentech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidic chambers</td><td>Xona</td><td>SND450</td><td></td></tr><tr><td>24 x 40 mm No. 1 lamínulas de vidro&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393-060</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina&nbsp;</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27&nbsp; &nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>QD655-estreptavidina conjugados</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; </td><td></td>Q10121MP</tr><tr><td>anticorpo anti-Avi GenScript</td><td></td><td>A00674</td><td></td></tr><tr><td>esferas de estreptavidina-agarose&nbsp;</td><td>Tecnologia da Vida</td><td>&nbsp; SA100-04</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>HRP-estreptavidina&nbsp;</td><td>Anticorpo</td> anti-pTrkB <td>Thermo Scientific N100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>um presente generoso do Dr. M. Chao do</td> anticorpo anti-TrkB da NYU <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Science</td><td>610101</td><td></td></tr></tbody></table>

imagens em tempo real de axonal transporte de quantum dot marcado bdnf na primária neurônios

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF desempenha um papel importante em vários aspectos da sobrevivência neuronal, diferenciação e função. Défices funcionais e estruturais no axônios são cada vez mais vistos como uma característica precoce de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD) e a doença de Huntington (DH). Como ainda é pouco claro o mecanismo (s) pelo qual é induzida lesão axonal. Nós relataram o desenvolvimento de uma nova técnica para produzir biologicamente activo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que pode ser utilizado para rastrear o transporte axonal de BDNF. Quantum dot marcado BDNF (QD-BDNF) foi produzido pela conjugação de ponto quântico 655 a mBtBDNF. Um dispositivo de microfluidos foi usada para isolar axónios de corpos celulares de neurónios. A adição de QD-BDNF ao compartimento axonal permitiu imagens ao vivo de transporte BDNF nos axônios. Nós demonstramos que QD-BDNF movido essencialmente exclusivamente retrogradamente, com muito poucas pausas, a uma velocidade de deslocamento de cerca de 1,06 pM / seg. Este sistema pode ser utilizado para me investigarcanismos de função axonal interrompido no AD ou HD, bem como outras doenças degenerativas.

Produção e Purificação de BDNF Mono-biotinilado Biologicamente Activo O vector de expressão de BDNF fundida com uma sequência de AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) foi criado de acordo com um protocolo previamente publicado 10. A massa molecular da proteína de fusão de comprimento completo foi previsto para ser ~ 32 kDa ( <a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" target="_blank">http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html</a> ) Monobiotinylated BDNF maduro com uma massa molecular esti...

O transporte axonal de BDNF, um factor neurotrófico, é crítico para a sobrevivência e função de várias populações neuronais. Algumas desordens degenerativas são marcadas pela ruptura da estrutura e função axonal. Nós demonstramos as técnicas utilizadas para examinar o tráfico ao vivo do QD-BDNF em câmaras microfluídicos usando neurônios primários.

Imagens em tempo real de axonal Transporte de Quantum Dot marcado BDNF na Primária Neurônios

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

O objetivo geral deste procedimento é rastrear o transporte axonal retrógrado do fator neurotrófico derivado do cérebro ou BDNF por imagens ao vivo. Isso é feito primeiro montando câmaras microfluídicas em lamínulas revestidas de polilisina. Na segunda etapa, os neurônios do hipocampo E 18 dissociados de ratos são dissecados e plaqueados no compartimento do corpo celular da câmara microfluídica.Em seguida, os neurônios são cultivados para permitir a extensão dos axônios através dos micro sulcos para o compartimento axonal da câmara. Na etapa final, o ponto quântico marcado como BDNF é adicionado ao compartimento do axônio. Em última análise, a microscopia de fluorescência pode ser usada para avaliar o movimento do BDNF dentro dos axônios do neurônio do hipocampo.A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a marcação B-D-F-E-G-I-P ou BDFM cherry, é que a marcação do BDF com ponto quântico permite a imagem de luz de um único dímero BDF dentro dos axônios, demonstrando que o procedimento será, deve ser. Desenhe um ponto de postagem dos meus três esquerdos, comece lavando à mão as câmaras microfluídicas em 1% aox, seguido por três enxágues de 30 minutos em água

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Imagens de células vivas é de utilidade particular quando se estuda a dinâmica do tráfico organela. Aqui nós descrevemos um protocolo para geração de imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso em neurônios cultivados com grande campo de microscopia de fluorescência. Este protocolo é flexível e pode ser adaptado para outras organelas imagem, tais como mitocôndrias, endossomos, e peroxissomos.

Imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso na Primária Cultivadas neurônios do hipocampo

Este protocolo discute a dissecção ao vivo...

Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar

Fonte: Winkle, C. C., et al. Utilizando metodologias combinadas para definir o papel da entrega da membrana plasmática durante a ramificação do axônio e a morfogênese neuronal. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra uma técnica de imagem ao vivo usando microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) para observar a ramificação axonal em tempo real em neurônios corticais. Vídeos de lapso de tempo capturam os efeitos do tratamento com netrin-1, uma molécula de sinalização que induz...

Imagem in vitro em tempo real da ramificação axonal em neurônios corticais de camundongos

Aqui, nós descrevemos o método que nós empregamos à imagem filopódia dendríticas altamente motile em uma preparação viva do cérebro larval da Drosophila , e o protocolo que nós desenvolvemos para quantificar conjuntos de dados da imagem latente do lapso de tempo 3D para avaliações quantitativas do dendrito dinâmica no desenvolvimento de neurônios.

Tempo-lapso de imagem ao vivo e quantificação da dinâmica da filial dendrítica rápida no desenvolvimento de neurônios de Drosophila

BDNF recombinante contendo uma sequência de Avi (BDNFAvi) é produzido em células HEK293 de forma econômica e é purificado por cromatografia de afinidade. BDNFavi é então diretamente mono-biotiningado com a enzima BirA em um tubo. BDNFavi e BDNFavi mono-biotiniladas mantêm sua atividade biológica quando comparadas com bdnf disponíveis comercialmente.

Um protocolo aprimorado para purificar e diretamente mono-biocombinado recombinante BDNF em um tubo para estudos de tráfico celular em neurônios

Descrevemos métodos de fotoativação de fluorescência para analisar o transporte axonal de neurofilamentos em axônios mieliados únicos de nervos periféricos de camundongos transgênicos que expressam uma proteína de neurofilamento fotoativavel.

Imagem e Análise do Transporte de Neurofilamento em Nervo Tibial de Camundongo Excised

Aqui, apresentamos um método para investigar morfogênese neurita em explantes de retina de camundongos pós-natal por microscopia confocal de lapso de tempo. Descrevemos uma abordagem para rotulagem e aquisição esparsa de tipos de células da retina e seus processos finos usando vetores de vírus associados a adeno recombinantes que expressam proteínas fluorescentes direcionadas à membrana de forma dependente de Cre.

Imagem de lapso de tempo da arborização neuronal usando rotulagem de vírus associado adeno esparsa de populações de células de retina geneticamente direcionadas

Usando camundongos fluorescentes transgênicos, protocolos detalhados são descritos para avaliar o transporte in vivo axonal de endosários e mitocôndrias dentro de axônios motores e sensoriais do nervo ciático intacto em animais vivos.

Expansão do Kit de Ferramentas para Imagens In Vivo do Transporte Axonal

Aqui, demonstramos como combinar a transfecção de neurônios primários de roedores do hipocampo com imagens confocais de células vivas para analisar os efeitos patológicos induzidos por proteínas no transporte axonal e identificar vias mecanicistas que medeiam esses efeitos.

Usando imagens de células vivas para medir os efeitos de proteínas patológicas no transporte axonal em neurônios primários do hipocampo

O artigo descreve a otimização dos parâmetros de aquisição da microscopia de fluorescência para visualizar o transporte axonal de cargas marcadas endógenas com resolução de neurônio único em um nematóide vivo.

Otimizando a visualização do transporte axonal de carga endógena por microscopia de fluorescência em Caenorhabditis elegans vivos

Aprenda a rastrear o transporte axonal retrógrado de BDNF marcado com quantum dots em neurônios hipocampais de ratos usando câmaras microfluídicas e microscopia de fluorescência. Este método permite visualizar em tempo real a dinâmica de fatores neurotróficos.

Imagens em tempo real de axonal Transporte de Quantum Dot marcado BDNF na Primária Neurônios

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