Name: Lesão tecido isquêmico na Skinfold Câmara do mouse Dorsal: Um Modelo retalho de pele para investigar aguda isquemia persistente (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo de retalho musculocutâneo isquêmico em camundongos usando a câmara dorsal de dobra de pele. Este método permite visualizar a microcirculação por microscopia intravital de fluorescência durante mais de 10 dias.

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Agradecemos Katharina Haberland para edição de imagem. Financiamento: O autor sênior recebeu uma KKF Grant da Technische Universität München a criação de um novo laboratório de pesquisa.

NOTA: Antes da implementação do modelo apresentado, as leis de proteção animal correspondente deve ser consultado e permissão deve ser obtida junto das autoridades locais. Neste trabalho, todos os experimentos foram realizados em conformidade com os princípios orientadores para animais de pesquisa envolvendo e da legislação alemã sobre a protecção dos animais. Os experimentos foram aprovados pelo comitê de cuidados com os animais local. 1. Preparação Animal e elevação cirúrgica da Flap <ol style="margin-left: 40px;"><li> Manter os animais em gaiolas individuais à temperatura ambiente de 22-24 ° C e a uma humidade relativa de 60-65%, com um ciclo de dia e noite de 12 horas. Permitir o livre acesso à água potável ratos e ração padrão de laboratório. Sempre manter condições estéreis durante a cirurgia sobrevivência. </li><li> Anestesiar o rato por via intraperitoneal (ip), a injecção de 0,1 ml de solução salina por 10 g de peso corporal, contendo 90 mg / kg de peso corporal de cloridrato de cetamina e 25 mg /kg de cloridrato de bw dihydroxylidinothiazine. A anestesia é necessário para a preparação dos animais, cirurgia e microscopia subsequente. Confirme anesthetization adequada, verificando a resposta a um estímulo doloroso. Durante o tempo de anestesia, aplique pomada veterinário sobre os olhos para evitar o ressecamento. </li><li> Após a indução da anestesia suficiente, depilar as costas com um barbeador elétrico. A partir de agora, aplicar a depilação creme para a área raspada para remover o cabelo restante. </li><li> Durante o tempo de permanência do creme de depilação de ~ 7-10 min, preparar instrumentos, incluindo fórceps de pele e micro fórceps, tesouras e micro tesouras, material de sutura e uma caneta. Desinfetar e preparar a câmara de titânio, aplicando os parafusos com a porca na base da câmara e pela fixação de espuma auto-adesiva (Fig. 1 AC) em torno da janela de contrapartida da câmara para garantir a estanquidade do sistema de câmara. </li><li> Remova todo o creme de depilação da parte traseira por lavagemlo com água morna. Em seguida, secar e desinfectar a pele com uma solução contendo álcool. </li><li> Posicione o mouse na posição prona e definir a linha média das costas. Segure a pele central e levante-o para criar uma dobra (Fig. 2A). Por trans-iluminação usando qualquer tipo de fonte de luz, decidir onde colocar provisoriamente a armação de titânio (Fig. 2B). Certifique-se de que os ramos distais da artéria torácica lateral (LTA) cranial e artéria ilíaca profunda circunflexo (DCIA) caudal curso através do centro da janela da câmara (Fig. 2B-D). Uma vez que o posicionamento da câmara é feito, ambas as camadas de perfurar a pele na parte inferior da prega de fixação posterior da armação de titânio. Agora retire a armação de titânio, coloque o mouse na posição prona e redefinir a linha média das costas, se necessário. </li><li> Esboço da aba perpendicular à lombada começando na linha média com uma relação entre largura e comprimento de 15 x 11 milímetro para resultar em uma aba lateral e perfundidos com base aleatoriamente. Em seguida, delinear uma área adicional de pele de 2 milímetros estendendo-se para o lado contralateral (Fig. 2C, D). Esta área é captado com os fórceps e depois suturado à armação de titânio, sem interferir com a área aba visível. </li><li> Após a última marcação, inciso do retalho. Ao fazê-lo, tanto o LTA transecção e DCIA e elevar a aba (Fig. 2E). Não há necessidade para a coagulação ou a ligadura dos vasos seccionados. </li><li> Coloque o parafuso da câmara através das perfurações da pele feitas anteriormente (Fig. 2F) e fixar a dobra cutânea tanto anteriormente quanto posteriormente dentro do quadro da câmara do retalho elevado para a parte traseira do quadro usando os buracos de armação da câmara e um 5-0 suturas interrompidas (Fig. 2G). </li><li> Suturar os membros verticais da aleta traseira para a pele circundante por meio de 5-0 interrompidas ( <strong&gt; fig. 2H, I). </li><li> Extirpar uma área de hemi-circular de pele de lateral para a pequena tira de pele de 2 mm, isto é, no outro lado da aba de observar vasculatura da aba. Isto permite vista directa através da janela de observação da câmara que tem uma superfície de 90 mm, 2. </li><li> Remover o tecido areolar frouxo gelatinoso do músculo estriado utilizando instrumentos de microcirurgia e lente de ampliação óptica ou microscópio a fim de melhorar a qualidade da imagem durante a microscopia. Tente não danificar os vasos dentro das camadas do tecido muscular. </li><li> Finalmente, vedar a câmara através da montagem do homólogo do quadro que tenha sido previamente dotado com tiras auto-aderente de espuma anteriormente, cranialmente e posteriormente, borrifar a aba com bisbenzimida tópica e solução salina (Fig. 2J). Depois disso, aplique a janela de observação com uma tampa de vidro usando um anel de pressão. Tente não prender quaisquer bolhas de ar sob o vidro (Fig. 2 K, L). A pele vai aderir ao vidro da tampa por forças de adesão. </li></ol> 2. Intravital epifluorescência Microscopia <ol style="margin-left: 40px;"><li> Espere 24 horas após o preparo cirúrgico para a primeira análise microscópica de qualidade óptica ideal. Esta análise representa a linha de base de microscopia e é repetido nos dias 3, 5, 7 e 10 após a cirurgia. Cada tempo, anestesiar o rato, tal como descrito na etapa 1.2. Colocar o animal em posição de decúbito lateral sobre um portador de acrílico feito sob medida. Dessa forma, as camadas do tecido muscular do retalho aderindo ao vidro da tampa estão enfrentando up-alas. </li><li> Injetar 0,05 ml de 5% dextrano verde fluorescente (peso molecular 150.000) e 0,05 ml de 1% de corante altamente fluorescente família Rhodamine em uma veia da cauda ou do plexo venoso retro-bulbar. O dextrano verde fluorescente mancha as componentes não celulares do sangue, se aplicado por via intravenosa (iv). O fluorescente rodamina manchas leucócitos e plaquetas, que pode ser distinguished de outros componentes celulares e não celulares. Finalmente, bisbenzimida manchas componentes nucleares que emitem fluorescência mais ou menos de acordo com o estado de condensação. </li><li> Subsequentemente, colocar o rato sob o microscópio. Certifique-se o microscópio inclui um sistema de LED - combinações de feixe de LED para 470 e 425 nm, 365 nm e 490, e 540 e 580 nm, bem como os conjuntos de filtros correspondentes (62 HE PBF / GFP / HcRed, faixa de 1: 350-390 nm comprimento de onda de excitação, dividir 395 nm / 402-448 nm; faixa 2: 460-488 nm, 495 nm dividida / 500-557 nm; faixa 3: 567-602 nm, 610 nm dividida / 615 nm para 20 Rhodamine infinito, alcance. : 540-552 nm, 560 nm dividida, emissão 575-640 nm). </li><li> Grave as fotos e filmes-retratos usando uma câmera de vídeo de carga acoplada dispositivo e salvá-los em um disco rígido de computador para análise posterior off-line. </li><li> Use diferentes objectivos (2.5X, NA (abertura numérica) = 0,06 para vistas panorâmicas da câmara; 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) para as gravações das regiões de interesse. </li><li> Virtualmente, pode dividir a superfície da aba que é visível através da janela da câmara em três áreas da mesma altura, ou seja, uma extremidade proximal, uma central e uma zona distal mais afastada do fluxo vascular (Fig. 3F). Para aquisição de imagem, proceda da seguinte maneira em cada momento de observação: <ol><li> Digitalize a imagem do tecido por imagem dentro da janela da câmara de proximal para distal com o objetivo de 5X. </li><li> Em cada área do retalho, selecione arteríolas de segunda ou terceira ordem e seus acompanhantes vênulas com padrões de ramificação facilmente identificáveis. Usando o objectivo 5X, 10X, 20X ou, fazer impressões dos feixes arteriolovenular, a fim de re-localizar facilmente os pacotes ao longo de todo o período de observação. </li><li> Com o objetivo de 20X e 50X o objetivo, mais registro 5-6 campos capilares e &quot;apoptótica&quot;campos por área do retalho, respectivamente. Todas as imagens gravadas com a 10X e 20X objetivos usar a luz azul (dextrano fluorescente) ea luz verde (rodamina) filtro, enquanto que as imagens gravadas com o 5X e 50X uso objetivo luz azul (dextran fluorescentes) e luz branca (Bisbenzamida) filtro, respectivamente . </li></ol></li></ol> 3. Análise dos dados registrados NOTA: Com a utilização de um sistema de análise de imagem assistida por computador quantificar todos os parâmetros gravados fora de linha 29 como se segue. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Medição da área de não-perfundido, respectivamente tecido necrótico (mm 2). <ol><li> Use a imagem completa câmara digitalizados janela gravado com o objetivo de 5X (de 2.6.1) eo dextrano fluorescente para medir o tecido não-perfundidos respectivamente necrosado. Use a função &quot;AreaBo&quot; para medir a área não-perfundidos escuro: Beira da área não-perfusão e calcular a área em mm 2 por meio da área de algoritmos de medição do software. </li></ol></li><li> A medição do diâmetro microvascular em arteríolas, capilares e vénulas (um). <ol><li> Carga de vídeo ou fotos dos AV-feixes gravadas ou os campos capilares para o software. Para melhores resultados, use as fotos ou vídeos com a maior ampliação onde as fronteiras definitivas do navio são claramente visíveis. </li><li> Use a função &quot;DiamPe&quot; do software para certificar-se as medições são realizadas perpendicular à parede do vaso. Para fazê-lo marcar dois pontos sobre a parede do vaso e com o terceiro marca clique o diâmetro perpendicular do navio. O software irá executar a medição im. </li><li> Repita as medições sobre as mesmas para todas as gravações de vasos no mesmo local. Medir múltiplos capilares para acumular diâmetro médio. </li></ol></li><li> Análise de células do sangue (RBC) velocidade vermelho nas arteríolas, capilares umand vénulas (mm / seg). <ol><li> Para arteriolar células do sangue (RBC) velocidade vermelho (mm / s) medições de usar a função &quot;VeloLSD&quot; do software e escolher os mesmos vasos na janela dextrano fluorescente para que os diâmetros foram medidos. </li><li> Analise-o com o sistema de análise de imagem assistida por computador, utilizando o método do deslocamento de linha, que está na base da medição do deslocamento (mm) de um padrão individual intravascular nível de cinza ao longo do tempo (seg). </li></ol></li><li> Quantificação do fluxo volumétrico em vasos (pl / seg). <ol><li> Calcular o fluxo volumétrico do sangue (pl / seg) em arteríolas, vénulas e capilares a partir da área de corte transversal do navio e da velocidade de RBC (π * r 2) de acordo com a equação de Gross e Aroesty, isto é, Q = V * r * 2 π , assumindo uma forma cilíndrica vaso 30. </li></ol></li><li> A medição da densidade capilar funcional de capilares RBC-perfundidos (perfusão nutritivo: cm / cm <sup&gt; 2). <ol><li> Coloque um campo capilar fluorescente gravado com ampliação de 20x objetivo para o software. Use a função &quot;DensLA&quot; para medir a densidade capilar funcional de microvasos RBC-perfundidos. </li><li> Trace os capilares perfundidos com o cursor e marcar os vasos perfundidos. Não marcar não-perfundidos capilares arteríolas ou vênulas. O software irá medir a densidade capilar funcional dos capilares perfundidos em cm / cm 2. Repita os passos para os outros campos capilares gravados. </li></ol></li><li> A medição da tortuosidade dos microvasos (remodelamento microvascular), os primeiros sinais de angiogênese, como raiz e broto-formação e microvasos recém-formados. <ol><li> Carregar vídeos gravados ou quadros de campos capilares fluorescentes no software. Identificar vasos gyrose e usar a função &quot;TorqIx&quot; do software. Trace o fluxo do vaso definitivo com o curso e terminam com um clique direito. O software irádesenhar uma linha reta para a forma direta e vai colocá-lo em relação com o caminho traçado. NOTA: Esteja atento aos sinais da angiogênese, como brotos, brotos e capilares recém-formados, que normalmente emanam perpendicularmente dos capilares pré-existentes. Medir a densidade destes vasos recém-formados, tal como descrito na etapa 3.5. </li></ol></li><li> Identificação das características de morte celular por apoptose, tais como a condensação nuclear, fragmentação e / ou marginalização (células / mm 2). <ol><li> Coloque vídeos Bisbenzamida-gravados (objetiva 50X) para o software. Use a função &quot;DenseNA&quot;. Marque células em apoptose de acordo com as características mencionadas, tais como a condensação nuclear, fragmentação e marginalização com um clique esquerdo. </li><li> Depois de marcar todas as células característicos de todo o vídeo, clique em &quot;N / A&quot; no software, que contará automaticamente todas as células marcadas e dividi-lo em toda a área. O resultado será apoptóticacélulas / mm 2. </li></ol></li><li> Análise de aderência de leucócitos ao endotélio vascular representando a inflamação. Adesão intermitente de leucócitos (leucócitos rolando; adesão &lt;30 sec: número de rolos mm superfície endotelial / 2) e firme adesão de leucócitos (leucócitos degola; adesão&gt; 30 seg: número de etiquetas / mm 2 de superfície endotelial). <ol><li> Analisar a resposta inflamatória através da contagem do número de leucócitos Rodamina que aderiram ao revestimento endotelial das vénulas pós-capilares por um período de tempo de ≥30 seg (&quot;adesivos&quot;) e os leucócitos que aderem de forma intermitente marcado (&lt;30 seg, &quot;rolos&quot;) . Venular a adesão de leucócitos é expresso em células por mm2 da superfície endotelial. </li></ol></li><li> A medição dos níveis de cinza intravasculares e intersticiais, como parâmetro de vazamento microvascular (macromolecular extravasamento E = E1 / E2). <ol><li> Avaliar macromolecular leakage como um parâmetro de permeabilidade microvascular após uma injecção intravenosa de um dextrano fluorescente. Densitometricamente determinar vários níveis de cinzento do tecido directamente adjacente à parede do vaso capilar (E1), bem como no plasma isento de células marginal do recipiente (E2). Em seguida, calcular o extravasamento macromolecular (E) é a relação de E1 / E2 31. </li></ol></li></ol> 4. Cuidados Pós-Operatórios <ol style="margin-left: 40px;"><li> Retorne o animal em uma gaiola separada para evitar a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Monitorar os animais diariamente para o sangramento, local e sinais sistêmicos de infecção ea posição da câmara. </li><li> Avaliar o estado geral do animal, observando a atividade motora, o peso corporal, os sinais de dor, tolerância ao vestir e auto-mutilação. </li><li> Manter a ratinhos um por gaiola para evitar mutuai manipulação da câmara. A qualquer sinal de dor, aplicar buprenorfina numa dose de 0,05-0,1 mg / kg de peso corporal, por via subcutânea, em intervalos de 8 h. </li></ol> 5. Eutanásia e explantes da Câmara Skinfold <ol style="margin-left: 40px;"><li> No dia 10, sacrificar os animais utilizando uma dose letal de uma droga anestésica (150 mg / kg de pentobarbital). </li><li> Retire a câmara e provar o tecido aba para ensaios de proteína de imunohistoquímica e molecular. Tecidos de amostra para histologia convencional (formol) e ensaios de proteína quantificáveis ​​(nitrogênio líquido ou gelo seco). </li></ol>

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</ol>

A fim de diminuir complicações isquêmicas e, assim, melhorar o resultado clínico, é necessário um conhecimento mais detalhado dos processos fisiopatológicos em tecido aba criticamente perfundido. O desenvolvimento de novos modelos animais que imitam isquemia aguda persistente, por conseguinte, é obrigatória. Consequentemente, fomos capazes de desenvolver um modelo facilmente reprodutível e fiável que permita a avaliação morfológica em tempo real, dinâmica e funcional repetitiva de vários parâmetros do músculo e da vascu...

Cobertura de material de tendão, osso e implante exposto em cirurgia reconstrutiva depende da utilização de abas. Uma aba é um bloco de tecido que é transferido no seu pedículo vascular que garante influxo arterial e retorno venoso. Apesar da perícia e da ampla disponibilidade de uma variedade de abas sejam transferidos, complicações induzidas por isquemia que variam de desagregação da ferida para a perda de tecido total ainda são encontrados. Considerando o tratamento conservador e cicatrização por segunda intenção pode ser esperada após necrose do tecido menor, necrose significativa geralmente requer revisão cirúrgica, incluindo desbridamento, condicionamento de feridas e reconstrução secundária. Isso aumenta a morbidade, prolonga a internação e, conseqüentemente, leva ao aumento dos custos de cuidados de saúde. As abas com um padrão indefinido de vasculatura ou áreas perfundidos aleatoriamente na zona distal mais afastada do influxo arterial são particularmente propensas a danos isquémico. Acco<html> rdingly, numerosos estudos experimentais e clínicos têm avaliado o desenvolvimento de necrose em ambos, retalhos de padrão axial (fornecimento de sangue definido) e retalhos de padrão aleatório (fornecimento de sangue indefinido) 3/1. As principais conclusões são comumente baseado na avaliação macroscópica do tamanho da área de necrose. A fim de avaliar as causas e os mecanismos da necrose tissular em mais pormenor, vários estudos concentraram-se na análise da microcirculação. Diferentes técnicas têm sido usadas para medir a perfusão tecidual, incluindo a análise da tensão de oxigênio nos tecidos utilizando eletrodos polarográficas 05/04, bem como a medição do fluxo de sangue utilizando dopplerfluxometria a laser 6-7, corante difusão 8, e microesferas 10/09. Estas técnicas, no entanto, só permitem a medição de parâmetros indiretos de perfusão tecidual e não permitir qualquer análise morfológica dos processos microhemodynamic dentro de uma área individual de interesse de um retalho. t &quot;&gt; Sandison é conhecida por ser a primeira que tenha usado uma câmara transparente prolongada para estudos in vivo, o que ele realizados em coelhos 11 Em 1943 -. cerca de 20 anos mais tarde - Algire foi o primeiro a se adaptar uma câmara, de modo transparente para ser aplicável em camundongos, a fim de estudar o comportamento de micro-implantes de células tumorais 12. Devido ao fato de que os ratos são os chamados animais de pele solta e depois de alguns aperfeiçoamentos técnicos ao longo dos anos seguintes, Lehr e colegas de trabalho foram capazes de adaptar tais uma câmara de dobras cutâneas dorsal desenvolver uma câmara de titânio menor e mais leve. Esta câmara permitiu a avaliação em microscopia de fluorescência intravital, uma técnica que permite a visualização direta e repetitiva de uma série de características morfológicas e da microcirculação e suas mudanças ao longo do tempo, em diferentes condições fisiológicas e fisiopatológicas, tais como a lesão de isquemia-reperfusão 13. Na investigação de perfusion de pele, músculo e osso abas em condições normais e patológicas duas tendências ocorreu: Em primeiro lugar, os modelos aba &quot;aguda&quot; que não usam a câmara prega dorsal, como a aba lateral pediculado no camundongo 14, o retalho ilha da pele com base lateralmente no hamster 15 e do retalho pediculado composto em ratos 16. Em segundo lugar, o modelo flap &quot;crônica&quot;, onde a combinação de um retalho com dobras cutâneas dorsal licenças de câmara microcirculação repetitivo análises ao longo de vários dias, com a microscopia de fluorescência intravital. É constituída por uma aba musculocutaneous perfundido aleatoriamente, que está integrado na câmara de dobra cutânea do rato 17. Sua relação largura-comprimento foi escolhido que uma situação de isquemia aguda persistente consistentemente resulta em ~ 50% necrose tecidual aba 10 a 14 dias após a elevação do retalho. Esta medida reprodutível de necrose do tecido permite uma avaliação mais aprofundada de ambos, de proteção (ou seja, o desenvolvimento de less necrose) e factores prejudiciais (isto é, o desenvolvimento de mais de necrose) no fisiopatologia aba. Durante os últimos anos, várias publicações experimentais que demonstrem o efeito do pré-diferente, os procedimentos pós-condicionado, incluindo a administração de substâncias de tecido de proteção 18-24 e aplicação local de estressores fisiológicos, tais como calor e ondas de choque 25 26 peri e, têm surgido. As análises quantitativas de necrose, morfologia microvascular e parâmetros da microcirculação pode ainda ser correlacionada com as análises de imuno-histoquímica e testes de proteína. Proteínas e moléculas diferentes, incluindo o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), sintases de óxido nítrico (NOS), factor nuclear kappa B (NF-kB) e proteínas de choque térmico (HSP-32: heme oxigenase-1 (HO-1) e HSP- 70) tem mostrado desempenhar um papel na protecção dos tecidos. Com base neste modelo aba câmara, duas modificações têm sido desenvolvidos na order para analisar a neovascularização ea microcirculação da pele durante o enxerto cura 27 e desenvolvimentos angiogênicos em um retalho pediculado com padrão axial perfusão 28. Nós apresentamos um modelo reprodutível e confiável, que inclui uma aba musculocutaneous isquemicamente desafiado na câmara de rato de dobras cutâneas. Este modelo permite a visualização e quantificação da microcirculação e hemodinâmica por microscopia de epi-fluorescência intravital.

<table><tbody><tr><td>C57Bl/6 ratos, 6-8 w, 20-22 g</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Creme de depilação</td><td>Balea</td><td></td><td>Qualquer creme de depilação</td></tr><tr><td>Câmara de titânio</td><td>Irola</td><td>160001</td><td>Halteblech M</td></tr><tr><td>Estrutura</td><td></td><td></td> de montagem de plexiglass feita à medida <td>Estrutura para proteger a câmara para evitar o movimento da câmara devido à respiração do animal.</td></tr><tr><td>Parafuso de cabeça de queijo com fenda</td><td>Parafusos e Mais</td><td>842210</td><td>DIN84 M2x10</td></tr><tr><td>Parafusos de porca cheia hexagonal</td><td>e Mais</td><td>93422</td><td>DIN934 M2</td></tr><tr><td>Anel elástico</td><td>Schaefer-Peters</td><td>472212</td><td>DIN472 J12x1,0</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>Volab</td><td></td><td>Vidro de cobertura feito sob medida, 11,8 mm de diâmetro.</td></tr><tr><td>Espuma de fixação</td><td>tesamoll</td><td>05559-100</td><td>tesamoll Perfil padrão I-Profile</td></tr><tr><td>Cloridrato de cetamina</td><td>Parke Davis</td><td></td><td>Ketavet&reg;</td></tr><tr><td>Cloridrato de dihidroxilidinotiazina</td><td>Bayer</td><td></td><td>Rompun&reg;</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Essex Pharma</td><td></td><td>Temgesic&reg;</td></tr><tr><td>Solução salina 0,9%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Álcool</td><td></td><td></td><td></td>de desinfecção</tr><tr><td>Vicryl 5-0</td><td>Ethicon</td><td>V 490 H</td><td></td></tr><tr><td>Ethilon 5-0</td><td>Ethicon</td><td>EH 7823 H</td><td></td></tr><tr><td>Seringas</td><td></td><td></td><td></td>de 1 ml</tr><tr><td>Marcador cirúrgico cutâneo com régua flexível</td><td>Roxo cirúrgico</td><td>PS3151</td><td>Qualquer marcador cirúrgico cutâneo e régua flexível</td></tr><tr>Tesoura <td></td><td></td><td></td><td>pontiaguda</td></tr><tr><td>Micro-Tesoura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td></td><td></td><td></td>normal</tr><tr><td>2 grampos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td></td><td></td><td></td>anatômico fino</tr><tr><td>Micro-fórceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chave de fenda hexagonal</td><td>wiha</td><td>1018</td><td></td></tr><tr><td>Chave</td> <td>de fendawiha</td><td>685</td><td></td></tr><tr><td>Alicate de anel de retenção</td><td>Knipex</td><td>4411J1</td><td>12-25 mm</td></tr><tr><td>Cortador de fio</td><td>Knipex</td><td>70 02 160</td><td>O cortador de fio é usado para cortar parafusos curtos; 160 mm</td></tr><tr><td>Luz de iluminação trans</td><td>IKEA</td><td>501.632.02</td><td>Luz LED Jansj&ouml;; qualquer luz&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>intravital</td><td>Zeiss</td><td>490035-0001-000</td><td>Scope.A1.000 Sistema</td></tr><tr><td>Zeiss</td><td>423052-9501-000</td><td>Colibri.2</td><td></td></tr><tr><td>do diodo emissor de luz do módulo 365nm</td><td>Zeiss</td><td>423052-9011-000</td><td></td></tr><tr><td>do diodo emissor de luz do módulo 470nm</td><td>Zeiss</td><td>423052-9052-000</td><td></td>do diodo emissor de luz dos vidros</tr> da ampliação <tr><td></td><td></td><td>423052-9121-000</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de filtros 62 62 HE BFP + GFP + HcRed</td><td>Zeiss</td><td>489062-9901-000</td><td>Faixa 1: comprimento de onda de excitação de 350-390 nm, divisão de 395 nm / 402-448 nm; faixa 2: 460-488 nm, divisão de 495 nm / 500-557 nm; faixa 3: 567-602 nm, divisão de 610 nm / 615 nm ao infinito.</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros 20 Rodamina</td><td>Zeiss</td><td>485020-0000-000</td><td>540-552 nm, divisão 560 nm, emissão 575-640 nm</td></tr><tr><td>2,5X objetiva NA=0,06</td><td>Zeiss</td><td>421020-9900-000</td><td>A-Plan 2,5X/0,06</td></tr><tr><td>5X objetiva NA=0,16</td><td>Zeiss</td><td>420330-9901-000</td><td>EC Plan-Neofluar 5X/0,16 M27</td></tr><tr><td>10X objetiva NA=0,30</td><td>Zeiss</td><td>420340-9901-000</td><td>EC Plan-Neofluar 10X/0,30 M27</td></tr><tr><td>Objetiva 20X NA=0,50</td><td>Zeiss</td><td>420350-9900-000</td><td>EC Plan-Neofluar 20X/0,50 M27</td></tr><tr><td>Objetiva 50X NA=0,55</td><td>Zeiss</td><td>422472-9960-000</td><td>LD Epiplan-Neofluar 50X/0,55 DIC 27</td></tr><tr><td>Software de imagem ZEN</td><td>Zeiss</td><td></td><td>ZenPro 2012</td></tr><tr><td>CapImage</td><td>Dr. Zeintl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína isotiocianato-dextrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45946</td><td></td></tr><tr><td>bisBenzimida H 33342 tricloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>Nocivo se ingerido; causa queimaduras graves na pele e danos aos olhos, pode causar irritação respiratória.</td></tr><tr><td>Cloreto de rodamina 6G</td><td>Invitrogen</td><td>R634</td><td>Nocivo por ingestão; pode causar defeitos genéticos; pode causar câncer; pode prejudicar a fertilidade ou o feto.</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Merial</td><td></td><td>Narcoren&reg;</td></tr></tbody></table>

lesão tecido isquêmico na skinfold câmara do mouse dorsal: um modelo retalho de pele para investigar aguda isquemia persistente

Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia

Apesar de profunda experiência e técnicas cirúrgicas avançadas, complicações induzidas por isquemia que variam de quebra ferida à extensa necrose dos tecidos ainda estão ocorrendo, particularmente na cirurgia de retalho reconstrutiva. Vários modelos experimentais de aba ter sido desenvolvido para analisar mecanismos e causas subjacentes e para investigar as estratégias de tratamento para prevenir complicações isquémicas. O fator limitante de a maioria dos modelos é a possibilidade de falta direta e repetidamente visualizar a arquitetura microvascular e hemodinâmica. O objetivo do protocolo é apresentar um modelo de rato bem estabelecida filiar esses elementos que faltam antes mencionados. Mais difícil et ai. Desenvolveram um modelo de uma aba musculocutaneous com um padrão aleatório de perfusão que sofre de isquemia e os resultados persistente aguda em ~ 50% de necrose depois de 10 dias se mantido não tratado. Com o auxílio de microscopia de epi-fluorescência intravital, este modelo de câmara permite a visualização repetitiva demorfologia e hemodinâmica em diferentes regiões de interesse ao longo do tempo. Processos associados, tais como apoptose, inflamação, o vazamento microvascular e angiogênese pode ser investigado e correlacionados com ensaios de proteína imuno-histoquímica e molecular. Até o momento, o modelo provou viabilidade e reprodutibilidade em vários estudos experimentais publicados que investigam o efeito do pré, peri e pós-condicionamento de tecido isquemicamente desafiado.

Necrose O principal desfecho deste modelo - a necrose do tecido seguinte elevação do retalho (ou seja, a indução de isquemia aguda persistente) - é repetidamente medido e ilustrado macroscopicamente como mostrado na Figura 3 ao longo de um período de 10 dias. Demarcação final de área de necrose geralmente ocorre entre os dias 5 e 7 após a cirurgia e é caracterizada por uma franja vermelho, isto é, zona de vasodilatação e remodelação microva...

A janela da câmara de dobras cutâneas dorsal murino apresentado visualiza uma zona de isquemia aguda persistente de um retalho musculocutâneo. Intravital epi-fluorescência licenças de microscopia para avaliação direta e repetitiva da microcirculação e quantificação de hemodinâmica. Morfológica e resultados hemodinâmicos podem ainda ser correlacionados com análises histológicas e moleculares.

Lesão tecido isquêmico na Skinfold Câmara do mouse Dorsal: Um Modelo retalho de pele para investigar aguda isquemia persistente

Despite profound expertise and advanced surgical techniques, ischemia-induced complications ranging from wound breakdown to extensive tissue necrosis are ...

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer um modelo reprodutível e confiável de um retalho musculocutâneo isquêmico na câmara de dobras cutâneas de camundongos. Isso é feito preparando primeiro a câmara de dobras cutâneas e as costas do camundongo. Em seguida, um retalho é elevado e perfundido aleatoriamente para que desenvolva necrose.Em seguida, o retalho é inserido na câmara de dobras cutâneas de titânio. Finalmente, a câmara da janela é selada com uma lamínula para garantir a estanqueidade da câmara. Em última análise, a microcirculação é visualizada através da janela da câmara por microscopia de fluorescência intravital durante um período de 10 dias ou mais.A principal vantagem deste modelo de camundongo sobre os métodos existentes é que ele permite a observação em tempo real das alterações microcirculatórias e morfológicas da microvasculatura do tecido musculocutâneo usando microscopia de fluorescência intravital durante um período de aproximadamente duas semanas. Entre outras coisas, o modelo permite o exame de procedimentos de condicionamento para eventualmente melhorar a sobrevivência do tecido. Depois de anestesiar um mouse, de acordo com o protocolo de texto, use

ischemic-tissue-injury-dorsal-skinfold-chamber-mouse-skin-flap-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O trauma cirúrgico induz uma resposta inflamatória. As citocinas e ligandos endógenos são conhecidos para modular o tamanho do enfarte do miocárdio após isquemia e reperfusão. Apresentamos um modelo modificado fechado de tórax murino de isquemia e reperfusão utilizando pesos pendurados para minimizar os efeitos de toracotomia.

Um modelo fechado de tórax murino de isquemia do miocárdio e reperfusão

Transferência de tecido livre é amplamente utilizado em cirurgia reconstrutiva para restaurar a forma ea função após ressecção oncológica e trauma. Pré-Condicionamento este tecido antes da cirurgia pode melhorar o resultado. Este artigo descreve...

In situ transversal reto abdominal miocutâneo: um modelo de rato de miocutâneo Isquemia Traumatismo por Reperfusão

Descrevemos modelos de lesão renal por isquemia e reperfusão induzida moderada e grave em que os ratos submetidos a clampeamento do pedículo renal unilateral seguido de nefrectomia contralateral simultânea ou tardia, respectivamente. Estes modelos consistentemente dar origem a uma disfunção renal e fibrose pós-lesão, mas a gravidade da lesão e sobrevivência dependem de fundo, idade e equipamento cirúrgico mouse.

Isquemia-reperfusão modelo de lesão renal aguda e Pós Lesão fibrose em camundongos

O rato, devido ao seu tamanho, disponibilidade e de comportamento e dócil, tem sido utilizada como um modelo de pesquisa durante muitos anos. O objetivo deste protocolo é para utilizar o rato como modelo isquêmico cura de feridas cutâneas de fornecer informações valiosas sobre a fisiopatologia das feridas crônicas.

Demonstração da Wound modelo de pele de rato Isquêmico

A indução cirúrgica de isquemia de membros posteriores no camundongo é útil para examinar a angiogênese, no entanto, isso está comprometido em certas linhagens de camundongos que exibem necrose tecidual induzida por isquemia acentuada. São descritos métodos para induzir isquemia subaguda de membros usando constritores ameróides para contornar esse problema por meio da indução de oclusão arterial gradual.

Métodos para aguda e subaguda Murino dos membros posteriores Isquemia

Este protocolo descreve a indução de um modelo de isquemia-reperfusão (IR) em pele de orelha de rato usando íman de fixação. Usando um modelo de imagens intravital custom-built, estudamos nas respostas inflamatórias in vivo pós-reperfusão. A lógica por trás do desenvolvimento desta técnica é ampliar a compreensão de como leucócitos responder a uma lesão IR pele.

Induzindo a lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de rato por Intravital Multiphoton imagem de respostas imunes

Para investigar a fisiopatologia do AVC, é criado um modelo do rato de isquémia-reperfusão cerebral. Nós distalmente ligate da artéria cerebral média direita e artéria carótida comum direita e restaurar o fluxo sanguíneo após 10 ou 40 min de isquemia.

Modelo de Mouse de dois vasos oclusão de isquémia-reperfusão Cerebral

Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio in vitro do risco usando fibroblastos preliminares e para um ensaio in vivo da cicatrização da ferida da pele nos ratos. Ambos os ensaios são métodos diretos para avaliar in vitro e in vivo a cicatrização de feridas.

Ensaio de migração de riscos e câmara de dobras cutâneas dorsal para análise in vitro e in vivo da cicatrização de feridas

Este artigo demonstra um modelo para estudar o remodelamento cardíaco após o cryoinjúria miocárdico nos ratos.

Um modelo Crioferimento para estudar infarto do miocárdio no mouse

Aqui, descrevemos um modelo animal pré-clínico para estudar a fisiopatologia da lesão isquemia-reperfusão em microcirurgia reconstrutiva. Este modelo de retalho de pele livre baseado nos vasos epigátricos caudais superficiais no rato também pode permitir a avaliação de diferentes terapias e compostos para neutralizar danos relacionados à isquemia-reperfusão.

Um modelo pré-clínico do rato para o estudo da lesão da Isquemia-reperfusion na microcirurgia reconstrutiva

Este protocolo descreve a coleta, sutura e monitorização de retalhos fasciocutâneos em ratos que permitem boa visualização e manipulação do fluxo sanguíneo através dos vasos epigástricos superficiais inferiores por meio de pinçamento e ligadura dos vasos femorais. Isso é fundamental para estudos envolvendo pré-condicionamento isquêmico.

Retalho axial da artéria epigástrica superficial inferior para estudo dos efeitos do pré-condicionamento isquêmico em modelo de ratos

Aprenda a estabelecer um modelo de retalho musculocutâneo isquêmico em camundongos usando a câmara dorsal de dobra de pele. Este método permite visualizar a microcirculação por microscopia intravital de fluorescência durante mais de 10 dias.

Lesão tecido isquêmico na Skinfold Câmara do mouse Dorsal: Um Modelo retalho de pele para investigar aguda isquemia persistente

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