gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de BRCA1, BRCA2 e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA

O enriquecimento de gDNA para sequenciamento NGS é uma ferramenta fácil e poderosa para o estudo de mutações constitucionais. Neste artigo, apresentamos o procedimento para analisar de forma simples a sequência completa de 11 genes envolvidos no reparo de danos ao DNA.

O objetivo do experimento a seguir é analisar a sequência de 11 genes simultaneamente com um protocolo muito fácil e relativamente rápido baseado na tecnologia baseada em transposase. Isso é conseguido pela ação de uma transposase para obter 300 fragmentos de DNA de pares de bases diretamente ligados a adaptadores. A primeira captura usando sondas específicas, enriquece amostras em regiões de interesse.

Esta etapa é repetida mais uma vez para obter apenas sequências de destino. Em seguida, a amplificação por PCR é realizada com o objetivo de aumentar a quantidade de materiais para sequenciar resultados que mostram variações genéticas em genes com base no alinhamento de sequências e análise de bioinformática. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o sequenciamento de Sanger, é sua grande capacidade de analisar 24 paixões por 11 genes completos em menos de duas semanas.

Demonstrando o procedimento será Sandy, um técnico para o meu laboratório. Para começar, prepare todos os reagentes do kit de enriquecimento de DNA. Quando estiver pronto, adicione aproximadamente 50 nanogramas de DNA genômico em cada poço de uma placa de 96 poços começando adicionando 25 microlitros de tampão TD e, em seguida, cinco microlitros de tampão TDE um.

Para cada poço, defina uma pipeta para 50 microlitros e pipete suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes. Centrifugue brevemente e, em seguida, coloque a placa em um termociclador quando estiver pronto. Vortex a solução ST e adicione 15 microlitros a cada poço contendo amostra.

Defina a pipeta para 65 microlitros e pipete suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes, incube por cinco minutos em temperatura ambiente antes da centrifusão. Em seguida, adicione 52 microlitros de esferas magnéticas de purificação previamente misturadas a cada mistura de poço e incube por 10 minutos em temperatura ambiente antes de centrifugar. Após lavar as esferas com etanol, remova a placa do suporte magnético e adicione 22,5 microlitros de tampão RSB.

Após a mistura, coloque a placa no suporte magnético e incube por dois minutos. Certifique-se de que o sobrenadante pareça completamente claro. Transfira suavemente 20 microlitros do snat para uma nova placa de 96 poços.

Para iniciar a primeira rodada de amplificação por PCR, adicione 20 microlitros de LP PMM e cinco microlitros cada de índice um e índice dois a cada. Misture bem e cubra a placa com um filme adesivo Micros EAL. Após a centrifugação, coloque a placa no Termociclador e execute o programa um.

Depois de purificar e determinar o rendimento da primeira rodada de PCR, comece a primeira hibridização puxando até 12 amostras. Na nova placa de 96 poços, garantindo que o volume final de cada piscina não exceda 40 microlitros completamente, misture a solução NCT uma e adicione 50 microlitros a cada poço. Depois de adicionar 10 microlitros de CSO, misture e feche a placa.

Após a centrifugação, coloque a placa em um termociclador e execute o programa. Dois. Para a primeira lavagem de hibridização, remova a placa do termociclador e da centrífuga. Remova brevemente a tampa adesiva com muito cuidado.

Transfira 100 microlitros de mistura de reação da placa para uma nova placa de poço MIDI 96 e adicione 250 microlitros de solução Vortex SMB de poço. Misture e feche a placa antes de incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Depois de lavar e descartar a supena, adicione 200 microlitros de solução WS dois bem misturados em poços contendo grânulos e misture bem trans transferir todo o volume para uma nova placa de 96 poços.

Feche a placa e coloque em um termociclador. Lance o termociclador a 42 graus Celsius por 30 minutos. Depois de concluído, coloque imediatamente a placa no suporte magnético por dois minutos.

Certifique-se de que o sobrenadante pareça completamente claro. Remova o selo e descarte imediatamente todo o sobrenadante. Remova a placa do suporte magnético.

Adicione 200 microlitros de solução bem misturada Ws três em poços contendo grânulos e misture bem. Depois de lavar e remover o supinato, feche a placa e centrifugue brevemente para puxar o nadante supino residual. Coloque a placa no suporte magnético por dois minutos.

Rejeitar o supinato residual. Em seguida, remova a placa do suporte magnético. Adicione 23 microlitros de mistura previamente preparada.

Após a mistura, feche a placa e deixe por cinco minutos em temperatura ambiente antes de centrifugar. Depois de transferir 21 microlitros de sate para uma nova placa de 96 poços, adicione quatro microlitros de ET, duas soluções a cada um. Bem, misture e sele a placa antes da centrifusão.

Para iniciar a segunda hibridização, remova o filme adesivo e adicione 50 microlitros de NCT, 10 microlitros de CSO e 15 microlitros de água PCR Grade aos 25 microlitros de biblioteca. Após a centrifugação, coloque a placa em um termociclador e execute o programa. Dois. Em uma nova placa de 96 poços misturou 20 microlitros de evolução da etapa anterior.

Com 25 microlitros de T-C-P-M-M e cinco microlitros de PPC selam a placa após a mistura e centrifugação. Em seguida, coloque a placa em um termociclador e execute o programa três no dia seguinte, centrifugue a placa e lave as esferas com etanol. Remova a placa do suporte magnético e adicione 30 microlitros de tampão RSB.

Misture e incube o prato por dois minutos. À temperatura ambiente, coloque a placa de 96 poços no suporte magnético e incube por cinco minutos ou até que o sobrenadante S pareça completamente claro. Transfira suavemente 28 microlitros do snat para uma nova placa de 96 poços.

A etapa final é determinar a qualidade da biblioteca usando um analisador de fragmentos ou QPCR. Durante a corrida, a densidade do cluster deve estar entre 801.000 K por milímetro quadrado. Diferentes imagens correspondem a baixa densidade, alta densidade e densidade perfeita.

Os resultados obtidos com esta tecnologia são muito fáceis de interpretar como mutações pontuais ou indel usando bioinformática. A mudança de base é indicada e a sequência excluída ou inserida é identificada diretamente. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de três dias se for executada corretamente.