Name: gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de BRCA1, BRCA2 e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda a analisar 11 genes de reparação de danos no DNA simultaneamente usando tecnologia baseada em transposase para enriquecimento de gDNA e sequenciamento NGS. Este método rápido supera o sequenciamento Sanger tradicional.

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Agradecemos à Ligue contre le Cancer de Côte d'Or e ao Centre Georges-François Leclerc por seu apoio financeiro. Agradecemos a Philip Bastable pela edição do manuscrito.

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<li>Hernan, I., Borràs, E., de Sousa Dias, M., Gamundi, M. J., Mañé, B., Llort, G., Agúndez, J. A., Blanca, M., Carballo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+genomic+variations+in+BRCA1+and+BRCA2+genes+by+long-range+PCR+and+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">Detection of genomic variations in BRCA1 and BRCA2 genes by long-range PCR and next-generation sequencing.</a> J. Mol. Diagn. 14, 286-293 (2012).</li>
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<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Breast+Cancer+Linkage+Consortium.+Cancer+Risks+in+BRCA2+Mutation+Carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">The Breast Cancer Linkage Consortium. Cancer Risks in BRCA2 Mutation Carriers.</a> J. Natl. Cancer Inst. 91, 1310-1316 (1999).</li>
<li>Levy-Lahad, E., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+risks+among+BRCA1+and+BRCA2+mutation+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer risks among BRCA1 and BRCA2 mutation carriers.</a> Br. J. Cancer. 96 (1), 11-15 (2007).</li>
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<li>Brennan, G. T., Relias, V., Saif, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA+and+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.O.P%22%5BJournal%5D)">BRCA and pancreatic cancer.</a> J.O.P. 14 (4), 325-328 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

O amplo uso de dispositivos e tecnologias NGS tem proporcionado novas oportunidades no estudo de câncer e doenças genéticas. Além de seqüenciamento do genoma inteiro ou RNA sequenciamento, a análise de uma grande quantidade de seqüências gDNA selecionados em vários pacientes ao mesmo tempo oferece grandes perspectivas no diagnóstico. Aqui, desenvolvemos um projeto específico (disponível on demand) usando a tecnologia para estudar Nextera 11 genes completos em 24 pacientes, simultaneamente, com um dispositivo de transfer...

Em 2010, cerca de 1,5 milhões de pessoas (essencialmente mulheres) desenvolveram câncer de mama em todo o mundo. Estima-se que 5 a 10% dos casos eram hereditários. Quase 20 anos atrás, BRCA1 e BRCA2 foram identificados como envolvidos na mama hereditário e câncer de ovário 1. Desde cerca de 15 anos atrás, BRCA1 e BRCA2 regiões codificantes foram sequenciados para determinar a predisposição genética para câncer de mama e ovário. Alterações nos genes BRCA1 e BRCA2 são detectados em 10 a 20% das famílias seleccionadas 2 sugerindo que a análise destas regiões não é suficiente para um rastreio eficaz. Recentemente, a análise de seqüências não-codificantes (íntrons, promotores, 3&#39;UTR) de BRCA1 e BRCA2 destacou que novas mutações / variações poderiam estar ligadas a um maior risco de câncer de mama 3-6. Proteínas BRCA1 e BRCA2 estão envolvidas na reparação de recombinação homóloga (HHR), que é completado por inúmeros parceiros 7. Enquanto as alterações nos genes BRCA1 ou BRCA2 induzir defeitos no reparo do DNA, os outros parceiros também podem afetar o risco de câncer de mama. Esta hipótese parece ter sido validada desde BRIP1 8 e 9 PALB2 têm um impacto comprovado sobre o câncer do colo do útero e de mama, respectivamente. Além disso, dois outros genes &quot;risco moderado&quot; de câncer de mama susceptibilidade, ATM e CHEK2, também podem ser estudados rotineiramente 10. Na sequência destes estudos, decidimos desenvolver um protocolo para analisar 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAP80, e TP53) em 24 pacientes simultaneamente, utilizando uma forma muito fácil e relativamente protocolo rápido com base na tecnologia de transposase, com o enriquecimento e a sequenciação de um dispositivo de transferência médio. Obrigadoa esta técnica, foi sequenciado a partir de genes completos no início do promotor para a extremidade de 3&#39;-UTR, excepto para RAP80, para a qual não foi coberta uma região intrónica de 2500 pb (CHR5: 176,381,588-176,390,180). Isso representa um total de cerca de 1.000.300 bp estudou com 2.734 sondas. Normalmente, as sequências de BRCA1 e BRCA2 exônicos são analisados ​​por sequenciação de Sanger, que precisa de 1,5 meses para pacientes com menos de 20. Com o presente protocolo (Figura 1), ao mesmo tempo, 11 genes completos para mais de 75 pacientes poderia ser analisado.

<table><tbody><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1001</td><td>Dispositivo de sequenciamento/rendimento médio</td></tr><tr><td>Nextera Kit de enriquecimento</td><td>Illumina</td><td>FC-123-1208</td><td>Tecnologia baseada em transposase</td></tr><tr><td>Cartucho de 300 ciclos</td><td>Contas</td><td>Illumina 15033624</td><td></td></tr><tr><td>AMPure</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Contas de purificação magnéticas</td></tr><tr><td>Suporte magnético</td><td>Alpaqua</td><td>A32782</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços</td><td>Life Technologies</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>Placas MIDI de 96 poços</td><td>Biorad</td><td>AB0859</td><td></td></tr><tr><td>Microseal A</td><td>Biorad</td><td>MSA-5001</td><td>Este selo é necessário apenas para amplificação por PCR. Outros selos padrão podem ser usados durante todo o experimento</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>Fornecido com o dispositivo de sequenciamento Software Experiment Manager Endereço de Internet: http://designstudio.illumina.com/NexteraRc/project/new Ferramenta do site do fabricante</td></tr></tbody></table>

gdna enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para ngs análise de toda a sequência de brca1, brca2 e 9 genes envolvidos na reparação de danos no dna

gDNA Enrichment by a Transposase-based Technology for NGS Analysis of the Whole Sequence of BRCA1, BRCA2, and 9 Genes Involved in DNA Damage Repair

O uso generalizado de Next Generation Sequencing abriu novos caminhos para a pesquisa do câncer e diagnóstico. NGS trará enormes quantidades de novos dados sobre o câncer e, especialmente, genética do câncer. O conhecimento atual e futuras descobertas tornará necessário estudar um grande número de genes que poderiam estar envolvidos em uma predisposição genética para o câncer. Neste sentido, foi desenvolvido um projeto para estudar Nextera 11 genes completos envolvidos no DNA reparação de danos. Este protocolo foi desenvolvido para estudar com segurança 11 genes (ATM, BARD1, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CHEK2, PALB2, RAD50, RAD51C, RAD80 e TP53) do promotor de 3&#39;-UTR em 24 pacientes simultaneamente. Este protocolo, baseado em tecnologia de transposase e gDNA enriquecimento, dá uma grande vantagem em termos de tempo para o diagnóstico graças genética para provar multiplexação. Este protocolo pode ser utilizado com segurança com ADNg sangue.

Os resultados das amostras de CQ A capacidade do presente método para determinar sequências de genes alvo se baseia na qualidade do ADNg (Figura 2A) e a qualidade do passo tagmentation. Se o tagmentation não é suficiente (Figura 2B, painel superior), a sequenciação não será satisfatória. Como mencionado acima, após a purificação tagmentation, o ADNg deve ser tagmented em fragmentos de 150 pb e 1000 pb, com a maioria dos fragmentos de cerca de 300 pb (Fi...

O enriquecimento de gDNA para sequenciamento NGS é uma ferramenta fácil e poderosa para o estudo de mutações constitucionais. Neste artigo, apresentamos o procedimento para analisar de forma simples a sequência completa de 11 genes envolvidos no reparo de danos ao DNA.

gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de BRCA1, BRCA2 e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA

The widespread use of Next Generation Sequencing has opened up new avenues for cancer research and diagnosis. NGS will bring huge amounts of new data on ...

O objetivo do experimento a seguir é analisar a sequência de 11 genes simultaneamente com um protocolo muito fácil e relativamente rápido baseado na tecnologia baseada em transposase. Isso é conseguido pela ação de uma transposase para obter 300 fragmentos de DNA de pares de bases diretamente ligados a adaptadores. A primeira captura usando sondas específicas, enriquece amostras em regiões de interesse.Esta etapa é repetida mais uma vez para obter apenas sequências de destino. Em seguida, a amplificação por PCR é realizada com o objetivo de aumentar a quantidade de materiais para sequenciar resultados que mostram variações genéticas em genes com base no alinhamento de sequências e análise de bioinformática. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o sequenciamento de Sanger, é sua grande capacidade de analisar 24 paixões por 11 genes completos em menos de duas semanas.Demonstrando o procedimento será Sandy, um técnico para o meu laboratório. Para começar, prepare todos os reagentes do kit de enriquecimento de DNA. Quando estiver pronto, adicione aproximadamente 50 nanogramas de DNA genômico em cada poço de uma placa de 96 poços começando adicionando 25 microlitros de tampão TD e, em seguida, cinco microlitros de tampão TDE um.Para cada poço, defina uma pipeta para 50 microlitros e pipete suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes. Centrifugue brevemente e, em seguida, coloque a placa em um termociclador quando estiver pronto. Vortex a solução ST e adicione 15 microlitros a cada poço contendo amostra.Defina a pipeta para 65 microlitros e pipete suavemente todo o volume para cima e para baixo 10 vezes, incube por cinco minutos em temperatura ambiente antes da centrifusão. Em seguida, adicione 52 microlitros de esferas magnéticas de purificação previamente misturadas a cada mistura de poço e incube por 10 minutos em temperatura ambiente antes de centrifugar. Após lavar as esferas com etanol, remova a placa do suporte magnético e adicione 22,5 microlitros de tampão RSB.Após a mistura, coloque a placa no suporte magnético e incube por dois minutos. Certifique-se de que o sobrenadante pareça completamente claro. Transfira suavemente 20 microlitros do snat para uma nova placa de 96 poços.Para iniciar a primeira rodada de amplificação por PCR, adicione 20 microlitros de LP PMM e cinco microlitros cada de índice um e índice dois a cada. Misture bem e cubra a placa com um filme adesivo Micros EAL. Após a centrifugação, coloque a placa no Termociclador e execute o programa um.Depois de purificar e determinar o rendimento da primeira rodada de PCR, comece a primeira hibridização puxando até 12 amostras. Na nova placa de 96 poços, garantindo que o volume final de cada piscina não exceda 40 microlitros completamente, misture a solução NCT uma e adicione 50 microlitros a cada poço. Depois de adicionar 10 microlitros de CSO, misture e feche a placa.Após a centrifugação, coloque a placa em um termociclador e execute o programa. Dois. Para a primeira lavagem de hibridização, remova a placa do termociclador e da centrífuga. Remova brevemente a tampa adesiva com muito cuidado.Transfira 100 microlitros de mistura de reação da placa para uma nova placa de poço MIDI 96 e adicione 250 microlitros de solução Vortex SMB de poço. Misture e feche a placa antes de incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Depois de lavar e descartar a supena, adicione 200 microlitros de solução WS dois bem misturados em poços contendo grânulos e misture bem trans transferir todo o volume para uma nova placa de 96 poços.Feche a placa e coloque em um termociclador. Lance o termociclador a 42 graus Celsius por 30 minutos. Depois de concluído, coloque imediatamente a placa no suporte magnético por dois minutos.Certifique-se de que o sobrenadante pareça completamente claro. Remova o selo e descarte imediatamente todo o sobrenadante. Remova a placa do suporte magnético.Adicione 200 microlitros de solução bem misturada Ws três em poços contendo grânulos e misture bem. Depois de lavar e remover o supinato, feche a placa e centrifugue brevemente para puxar o nadante supino residual. Coloque a placa no suporte magnético por dois minutos.Rejeitar o supinato residual. Em seguida, remova a placa do suporte magnético. Adicione 23 microlitros de mistura previamente preparada.Após a mistura, feche a placa e deixe por cinco minutos em temperatura ambiente antes de centrifugar. Depois de transferir 21 microlitros de sate para uma nova placa de 96 poços, adicione quatro microlitros de ET, duas soluções a cada um. Bem, misture e sele a placa antes da centrifusão.Para iniciar a segunda hibridização, remova o filme adesivo e adicione 50 microlitros de NCT, 10 microlitros de CSO e 15 microlitros de água PCR Grade aos 25 microlitros de biblioteca. Após a centrifugação, coloque a placa em um termociclador e execute o programa. Dois. Em uma nova placa de 96 poços misturou 20 microlitros de evolução da etapa anterior.Com 25 microlitros de T-C-P-M-M e cinco microlitros de PPC selam a placa após a mistura e centrifugação. Em seguida, coloque a placa em um termociclador e execute o programa três no dia seguinte, centrifugue a placa e lave as esferas com etanol. Remova a placa do suporte magnético e adicione 30 microlitros de tampão RSB.Misture e incube o prato por dois minutos. À temperatura ambiente, coloque a placa de 96 poços no suporte magnético e incube por cinco minutos ou até que o sobrenadante S pareça completamente claro. Transfira suavemente 28 microlitros do snat para uma nova placa de 96 poços.A etapa final é determinar a qualidade da biblioteca usando um analisador de fragmentos ou QPCR. Durante a corrida, a densidade do cluster deve estar entre 801.000 K por milímetro quadrado. Diferentes imagens correspondem a baixa densidade, alta densidade e densidade perfeita.Os resultados obtidos com esta tecnologia são muito fáceis de interpretar como mutações pontuais ou indel usando bioinformática. A mudança de base é indicada e a sequência excluída ou inserida é identificada diretamente. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de três dias se for executada corretamente.

gdna-enrichment-transposase-based-technology-for-ngs-analysis-whole

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Biologia

Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

Um método de identificação de condutores desconhecidos da carcinogénese, utilizando uma abordagem imparcial é descrito. O método utiliza...

Identificação de<em&gt; A Bela Adormecida</em&gt; Inserções de transposões em tumores sólidos utilizando Linker mediada por PCR

Um sistema integrado para sequenciamento direcionado de próxima geração de amostras oncológicas é descrito. Este sistema multiplataforma é otimizado para biópsias tumorais de baixa qualidade e baixa quantidade, acomoda baixas entradas de DNA, inclui controles multivariantes bem caracterizados e apresenta um novo chamador de variante que é informado por medidas quantitativas de controle de qualidade pré-analítica.

Integração de Wet and Processes bancada secos Otimiza alvejado Seqüenciamento Next-geração de baixa qualidade e biópsias de tumores de baixa quantidade

Apresentamos um plano estratégico e protocolo para identificar variantes genéticas não codificantes que afetam a ligação ao DNA do fator de transcrição (TF). Um protocolo experimental detalhado é fornecido para ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) e análise de ensaio de precipitação de afinidade de DNA (DAPA) da ligação ao DNA TF dependente do genótipo.

Triagem para Funcional não-codificante variantes genéticas Usando eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA) e DNA afinidade Precipitation Assay (DAPA)

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho de um gene CRISPR/Cas9-baseado edição sistema de reparação de mutações pontuais em células de mamíferos. Aqui, usamos uma abordagem combinatória para gene edição com uma estratégia detalhada de follow-on experimental para medir indel formação no local de destino — em essência, analisando o mutagenesis local.

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Este manuscrito descreve uma técnica para a detecção de mutações de baixa frequência em ctDNA, ER-Seq Este método é diferenciado pela sua utilização exclusiva de correção de erros de bi-direcional, um filtro de fundo especial e eficiente aquisição molecular.

Deteção de mutações raras no CtDNA usando a próxima geração de sequenciamento

Pessoas com mutações BRCA1 têm maior risco de desenvolver câncer, o que garante uma avaliação precisa da função das variantes BRCA1. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base de citosina mediados pelo CRISPR que permitem a conversão de C:G para T:A direcionada em células vivas.

Avaliação funcional das variantes BRCA1 usando editores de base mediados pelo CRISPR

Este artigo introduz passos essenciais de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina. Esses protocolos são comumente usados para estudar processos celulares relacionados ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA.

Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease

Apresentado aqui é o endonuclease sgRNA/CAS9 e o protocolo de sequenciamento de próxima geração que pode ser usado para identificar as mutações associadas ao reparo de quebra de fios duplos perto do promotor CD4.

Usando o sequenciamento da próxima geração para identificar mutações associadas ao reparo de uma quebra de fio dupla induzida pelo CAS9 perto do promotor cd4

Este vídeo demonstra de 2 cores montar toda hibridização in situ, um método pelo qual o padrão de expressão espacial e temporal de 2 genes diferentes podem ser visualizados em embriões de galinha jovens. Este método foi originalmente introduzido por David Wilkinson, Henrique Domingos, Phil e David Ingham Ish-Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Aprenda a analisar 11 genes de reparação de danos no DNA simultaneamente usando tecnologia baseada em transposase para enriquecimento de gDNA e sequenciamento NGS. Este método rápido supera o sequenciamento Sanger tradicional.

gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de BRCA1, BRCA2 e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA (Vídeo) | JoVE Journal

gDNA Enriquecimento por uma tecnologia baseada em transposase para NGS Análise de toda a sequência de BRCA1, BRCA2 e 9 genes envolvidos na reparação de danos no DNA

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