Name: Metilnitrosouréia (MNU) induzida Retinal degeneração e regeneração no peixe zebra: características histológicas e funcionais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprenda a induzir degeneração e regeneração retinal em peixe-zebra adulto usando MNU. Este protocolo combina resposta optocinética, histologia e imunohistoquímica para avaliar alterações funcionais e morfológicas da retina ao longo de 30 dias.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos a Monika Kilchenmann, Federica Bisignani e Agathe Duda por sua excelente assistência técnica.

Todos os experimentos aderiu à Declaração de Uso de Animais em Oftálmica e Visão Pesquisa da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO). 1. Os animais <ol><li> Manter o peixe-zebra de tipo selvagem (Danio rerio) da estirpe AB (Oregon) com idades entre 6-12 meses, sob condições padrão em água com uma temperatura de 26,5 ° C e uma 14/10 horas de luz / escuridão de 15. </li><li> Siga as orientações de cuidados de animais das instituições envolvidas para os experimentos com animais após a aprovação pelo Serviço Veterinário Cantonal. </li></ol> 2. MNU Tratamento <ol><li> Prepare a água contendo 150 mg / L de substância seca de N-metil-N -nitrosourea (MNU). CUIDADO! MNU é tóxico; pode causar cancro, danos genéticos hereditários ou dano ao feto. </li><li> Incubar peixe zebra na água contendo o MNU durante 60 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar com peixe-zebra rapidamenteágua fresca e coloque o peixe para um novo tanque de peixes sem MNU. Manter peixes sob condições padrão, desde que desejado para os experimentos. </li></ol> 3. aferição da acuidade visual <ol><li> Inicie o sistema optomotor, escolha &quot;testar&quot; a partir do menu e configurar as opções para &quot;Escada Simples&quot;, &quot;Acuity (Freq)&quot; e &quot;Randomized / separado&quot; 16. </li><li> Instale um recipiente para perfusão com 500 ml de água de cerca de 1 m acima do sistema optomotor. </li><li> Coloque um peixe-zebra na câmara de exame e conecte-o ao frasco de infusão. Coloque a câmara de exame no sistema optomotor. </li><li> Inicie a medição e observar o movimento dos olhos em tempo real na tela do computador. Desse modo, uma resposta positiva (&quot;sim&quot;) é definida como sacadas consecutivas na direção correta, enquanto que uma resposta negativa (&quot;não&quot;) representa os movimentos oculares aleatórios semelhantes aos observados com a estaçãoary grades. Se os olhos da exposição zebrafish três ou mais respostas optocinéticas subseqüentes (Okr), pressione &quot;sim&quot;; se não, pressione &quot;não&quot;. </li><li> Extraia a acuidade visual, que foi calculada pelo software através da determinação do limiar da freqüência espacial do estímulo optocinético, em &quot;Resultados&quot; no menu. </li></ol> 4. Histologia <ol><li> Eutanásia do peixe-zebra com uma sobredosagem de acetato de 3-aminobenzoato metanossulfonato de (200-300 mg / l) e enuclear os olhos. </li><li> Fixar os olhos inteiros em paraformaldeído a 4% (PFA) em tampão fosfato salino (PBS) a 4 ° C durante 12 horas e depois desidratar as amostras numa série de álcoois graduados. </li><li> Encaixe as amostras em parafina, cortadas 5 mm de através da cabeça do nervo óptico (ONH) e montá-los em uma lâmina de vidro. </li><li> Manchar a parafina deparaffized com hemalum durante 4 minutos e mergulhe as lâminas duas vezes em água destilada seguido de 0,2% aci clorídricod e 0,8% de amônia. Manchar as seções com eosina para 3 min após o desenvolvimento da coloração hemalum em água corrente por pelo menos 10 min (H &amp; E). </li><li> Encaixe das lâminas desidratadas em meio de montagem e observar as lâminas ao microscópio óptico. </li></ol> 5. Imunohistoquímica <ol><li> Desoxinucleotidil-transferase terminal dUTP nick marcação terminal (TÚNEL) <ol><li> Incubar as secções desparafinadas com 20 ug / ml de proteinase K à temperatura ambiente, durante 15 min. Lavam-se as secções, três vezes com solução salina tamponada com Tris (TBS) durante 5 minutos cada. </li><li> Incubar as secções com 50 ul mistura reaccional de TÚNEL (solução de etiquetagem 10% e solução de enzima de 90%) numa câmara humidificada a 37 ° C durante 60 min. Lavar três vezes com TBS durante 5 minutos cada. </li><li> Montar as lâminas com meio contendo DAPI montagem e observar as lâminas ao microscópio de fluorescência. </li></ol></li><li> Antígeno Nuclear (PCNA) coloração em proliferação celular <ol><li> Ferver as secções desparafinadas em tampão de recuperação de antigénios (Tris-EDTA + 0,05% de Tween 20, pH 9,0) durante 3 minutos e lavar três vezes com TBS durante 5 minutos cada. Bloquear com 100 ul de solução (TBS + 10% de soro de cabra + 1% de albumina de soro normal de bovino, pH 7,6) à temperatura ambiente de bloqueio durante 1 hr. </li><li> Coram com anticorpos primários anti-PCNA em uma diluição de 1: 200 numa câmara humidificada a 4 ° C durante a noite. Lavar três vezes com TBS + Tween 20 durante 5 minutos cada. </li><li> Terminar a detecção com os anticorpos secundários apropriados de uma diluição de 1: 500 a temperatura ambiente durante 1 hora. </li><li> Montar as lâminas com meio contendo DAPI montagem e observar as lâminas ao microscópio de fluorescência. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+age-related+macular+degeneration%3A+a+review+of+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date.</a> Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).</li>
<li>Bhatti, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%2C+pigmentary+retinopathies%2C+and+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neurol.+Neurosci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases.</a> Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6 (5), 403-413 (2006).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368, 1795-1809 (2006).</li>
<li>Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+retinitis+pigmentosa+induced+by+MNU%3B+disease+progression%2C+mechanisms+and+therapeutic+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials.</a> Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).</li>
<li>Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenic+comparative+study+on+rasH2+mice+produced+by+two+breeding+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities.</a> J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).</li>
<li>Morton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Methyl-N-Nitrosourea+%28MNU%29%3A+A+positive+control+chemical+for+p53%2B%2F-+mouse+carcinogenicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies.</a> Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).</li>
<li>Terracini, B., Testa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinogenicity+of+a+single+administration+of+N-nitrosomethylurea%3A+a+comparison+between+newborn+and+5-week-old+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats.</a> 24, 588-598 (1970).</li>
<li>Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-3-independent+photoreceptor+degeneration+by+N-methyl-N-nitrosourea+%28MNU%29+induces+morphological+and+functional+changes+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).</li>
<li>Tappeiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+rod+regeneration+in+a+novel+zebrafish+retinal+degeneration+model+using+N-methyl-N-nitrosourea+%28MNU%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU).</a> PLOS One. 12, (2013).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model visual system.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).</li>
<li>Fleisch, C., Neuhauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Behavior+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Visual Behavior in Zebrafish.</a> Zebrafish. 3, 191-201 (2006).</li>
<li>Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+and+development+of+light+adaptation+processes+in+the+outer+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22InterScience%22%5BJournal%5D)">Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina.</a> InterScience. 288, 653-662 (2006).</li>
<li>Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+for+complex+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model for complex tissue regeneration.</a> Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).</li>
<li>Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+photoreceptor+degeneration+and+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).</li>
<li>Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+acuity+and+contrast+sensitivity+of+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Zool%22%5BJournal%5D)">Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish.</a> Front. Zool. 9 (1), 10(2012).</li>
<li>Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitor+of+phagocytosis%2C+O-phospho-L-serine%2C+suppresses+M%C3%BCller+glia+proliferation+and+cone+cell+regeneration+in+the+light-damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina.</a> Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).</li>
<li>Nelson, C. M., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glia+as+a+source+of+neuronal+progenitor+cells+to+regenerate+the+damaged+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).</li>
<li>Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+adult+and+developing+mouse+spatial+vision+using+a+virtual+optomotor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system.</a> Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45 (12), 4611-4616 (2004).</li>
<li>Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+ontogeny+of+optokinetic+and+vestibulo-ocular+behaviors+in+zebrafish%2C+medaka%2C+and+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish.</a> J. Neurophysiol. 92 (6), 3546-3561 (2004).</li>
<li>Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Inner+Retinal+Neurons+after+Intravitreal+Injection+of+Ouabain+in%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in.</a> Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).</li>
<li>Sherpa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).</li>
<li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+M%C3%BCller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Anteriormente, nosso grupo transferiu o modelo MNU de degeneração de fotorreceptores de roedores para o sistema de peixe-zebra 9. Os eventos que se seguiram foram descritos e acompanhados por até 30 dias. Nesse período, a degeneração morfológica e a regeneração completas da retina ocorreram após o tratamento inicial. Primeiro, a histologia revela uma contagem reduzida de bastonetes a partir do dia 3, com um mínimo no dia 8. Da mesma forma, a coloração TUNEL identifica a apoptose dos fotorreceptores de bastonet...

A visão é o sentido mais importante para o ser humano e sua deficiência tem um impacto socio-económico elevado. No mundo desenvolvido, as doenças degenerativas da retina são a principal causa de perda de visão e cegueira entre idosos 1. A causa da maioria das doenças degenerativas da retina é apenas parcialmente compreendida e soluções terapêuticas para recuperar a visão perdida são muito limitadas. Retinite pigmentosa é um exemplo típico de uma doença degenerativa da retina com a perda de fotorreceptores primários 2-3. -nitrosourea N-metil-N (MNU) induz degeneração da retina e é, portanto, amplamente usado em roedores para modelar doenças com fotorreceptores da morte celular primário 4. É um agente de alquilação e leva a tumores benignos e malignos, que geralmente aparecem vários meses após a exposição 5-7. Além disso, isso provoca a morte celular de fotorreceptores específica dentro de um período de observação curto prazo. Deste modo, a perda da camada da retina structure e adelgaçamento da retina significativa foi observada de um modo dependente da concentração. Células da glia da retina foram ativados, mas sem alterações no epitélio pigmentar da retina (EPR) foram encontrados. Retículo endoplasmático (ER) apoptose relacionada ao estresse parece ser a principal via de ação MNU na retina 8. Temos recentemente introduzido MNU como um modelo químico para induzir a degeneração de fotorreceptores no peixe-zebra 9. Entre outras razões, o peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se importante na pesquisa visual por causa das semelhanças de seu sistema visual ao de outros vertebrados 10. A retina externa contém os fotorreceptores, que podem ser agrupados em quatro tipos de cones diferentes, com sensibilidades de pico no ultravioleta, a curto, médio e longo comprimento de onda do espectro visível e uma haste tipo de fotorreceptores. Na camada nuclear interna (INL), os corpos celulares dos bipolares, horizontais e amácrinas interneurônios são encontrados, como o well como a soma das células de células glia de Müller. Na camada plexiforme exterior (OPL), os contactos sinápticos entre os fotorreceptores e a retina interna são formados, enquanto que a camada de células mais próximo da lente é a camada de células ganglionares (CG), que formam os componentes que compreendem longos axónios do nervo óptico e do trato óptico . Contactos sinápticos entre as células ganglionares e as células da camada nuclear interna são formadas na camada plexiforme interna (IPL) 11. O RPE está fora da retina neurossensorial e envolve os segmentos externos dos fotorreceptores com longa microvilosidades apical 12. Além disso, o peixe-zebra é altamente regenerativa e capazes de regenerar cérebro lesionado, a retina, a espinal medula, coração e outros tecidos 13. Quando ocorre lesão da retina, células do INL, que se pensa serem células de Müller, são activadas e têm o potencial para se diferenciar em diferentes tipos de células retinais. Além disso, geram também progenitores da haste, que estão localizados na ONL. Outro modource que abastece a retina de adultos peixe-zebra com novas células é a zona marginal ciliar. Esta fonte é necessária para alcançar uma densidade constante de bastonetes no contínuo crescimento olho zebrafish 14. O modelo MNU pode ser utilizado como uma abordagem de degeneração / regeneração simples e reprodutível para o tecido da retina. Devido a certas semelhanças entre os processos biológicos em peixes-zebra e em seres humanos isso poderia abrir as portas para identificar vias de morte celular envolvidos e no rastreamento de possíveis drogas neuroprotetoras. Com base em um estudo anterior do nosso grupo, que agora ilustram os métodos deste modelo zebrafish induzido por MNU de mento de retina e consequente regeneração incluindo alterações funcionais com acordo laboratório vídeos 9.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Amônia</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>294993</td><td>0,80%</td></tr> <tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem DAPI</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, EUA</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>45260</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>2860</td><td>100%, 96%, 70%</td></tr> <tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Sal de metanossulfonato de etilo 3-aminobenzoato</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>E10521</td><td>Tricaína</td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-coelho Alexa 594</td><td>Life Technologies, Zug, Suíça&nbsp;</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Soro normal de cabra</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>320331</td><td>0,20%</td></tr><tr><td>Kit de detecção de morte celular in situ</td><td>Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Suíça</td><td>11684795910</td><td>Kit TUNEL Solução</td></tr><tr><td>de hemalum de Mayer</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>109249</td><td></td></tr><tr><td>Metilnitrosoureia (MNU)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>N4766</td><td></td></tr><tr><td>Toxic OptoMotry</td><td>CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canadá</td><td>n.a.Paraformaldeído</td><td></td></tr> <tr><td>(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S3004</td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-PCNA&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EUA</td><td>sc-33756</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de vidro Superfrost Plus</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Alemanha</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>Tris tamponado com solução salina (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Peixe-zebra (Danio rerio) AB (Oregon)</td><td>cepa Universidade de Friburgo, Departamento de Biologia</td><td>n.a.Instalação</td> <td>própria para peixes</td></tr></tbody></table>

metilnitrosouréia (mnu) induzida retinal degeneração e regeneração no peixe zebra: características histológicas e funcionais

Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics

Doenças degenerativas da retina, por exemplo, retinite pigmentosa, do que resulta uma conta de fotorreceptores danos para a maioria da perda de visão no mundo industrial. Os modelos animais são de importância fundamental para o estudo dessas doenças. A este respeito, a toxina específica de fotorreceptores N-metil-N -nitrosourea (MNU) tem sido amplamente utilizado em roedores para induzir farmacologicamente a degeneração retiniana. Anteriormente, nós estabelecemos um modelo de degeneração da retina induzida pelo MNU no peixe-zebra, um outro sistema modelo popular na pesquisa visual. A diferença fascinante para os mamíferos é a neurogênese persistente na retina do peixe-zebra adulto e sua regeneração após lesão. Para quantificar esta observação nós empregamos medidas de acuidade visual no peixe-zebra adulto. Desse modo, o reflexo optocinético foi usado para acompanhar as mudanças funcionais em peixes não anestesiado. Isto foi complementado com histologia, assim como staini imunohistoquímicang para a apoptose (TUNEL) e proliferação (PCNA) para correlacionar as alterações morfológicas em desenvolvimento. Em resumo, a apoptose de fotorreceptores ocorre três dias após o tratamento MNU, que é seguida por uma redução acentuada das células na camada nuclear externa (ONL). Depois disso, a proliferação de células na camada nuclear interna (INL) e ONL é observada. Aqui, nós revelamos que não é apenas uma histológica completa, mas também a regeneração funcional ocorre ao longo de um curso de tempo de 30 dias. Agora vamos ilustrar os métodos para quantificar e acompanhar mento de retina do peixe-zebra e regeneração usando MNU em um formato de vídeo.

A acuidade visual: O set-up experimental [freqüência espacial: 0.042 círculos / grau (c / d); Contraste: 100%; A velocidade de flutuação: 20 graus / segundo (d / src); volta luminância de luz: 152 cd / m 2] Este estudo permitiu a avaliação OKR de peixe-zebra adulto. A duração média da medição VA foi de cerca de 5 - 10 minutos para cada peixe-zebra, que toleraram bem o procedimento. A acuidade visual antes da exposição MNU era 0,577 ± 0,014 ciclos / grau (c / d). Figura 1</...

Aqui demonstramos quantificação de mento de retina e de regeneração e seu impacto na função visual usando N-metil-N -nitrosourea no peixe-zebra adulto. Perda da acuidade visual e um decréscimo no número de fotorreceptores foram seguidos por proliferação na camada nuclear interna. Regeneração morfológica e funcional completa ocorreu 30 dias após o tratamento inicial.

Metilnitrosouréia (MNU) induzida Retinal degeneração e regeneração no peixe zebra: características histológicas e funcionais

Retinal degenerative diseases, e.g. retinitis pigmentosa, with resulting photoreceptor damage account for the majority of vision loss in the industrial ...

O objetivo geral deste procedimento é induzir a degeneração da retina e a subsequente regeneração no peixe-zebra adulto usando n metil e nitro ueaa. Isso é feito primeiro incubando o peixe-zebra do tipo selvagem em água contendo N metil N uréia nitrosa, ou MNU. A próxima função visual é quantificada medindo a resposta optocinética ou OKR e calculando a acuidade visual em diferentes momentos.Após o tratamento, os peixes-zebra são sacrificados e os olhos são nucleados para exames histológicos usando coloração h e e para observar alterações morfológicas no tecido retiniano. Finalmente, as alterações celulares são visualizadas na retina com coloração específica para morte e proliferação celular. Em última análise, a medição da acuidade visual e a quantificação das alterações morfológicas e celulares são usadas para visualizar o D e a regeneração da retina.A principal vantagem deste modelo farmacológico é que ele é simples e rápido de usar e induz degeneração e regeneração regional confiável em peixes-zebra adultos Para realizar o tratamento com NM, metil, n, nitrosoureia ou MNU, comece preparando água contendo 150 miligramas por litro de MNU seco. Proceda com cautela ao trabalhar com n

methylnitrosourea-mnu-induced-retinal-degeneration-regeneration

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Vários protocolos de danos provocados pela luz têm sido descritas para fotorreceptores danos e, consequentemente, induzir uma resposta de regeneração da retina adulta em peixes-zebra. Este protocolo descreve um método melhorado, que pode ser utilizada em animais e pigmentados que danifica a grande maioria dos fotorreceptores cone e da haste ao longo de toda a retina.

A Light Novel danos Paradigma para uso em estudos de regeneração da retina em Zebrafish Adulto

Porque muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas são estudadas no peixe adulto, em vez de o embrião / larvas, foi desenvolvido um ensaio quantitativo regenerativa linha lateral, que pode ser aplicada aos modelos de doenças de peixes-zebra adultos. O ensaio envolveu a resolução neuromasto 1) e 2) os níveis de células de cabelo individuais.

Um ensaio para a lateral de Regeneração de Linha em Zebrafish Adulto

O rim adulto do peixe-zebra é um excelente sistema para os estudos de regeneração e de doenças renais. Um aspecto essencial dessa pesquisa é a avaliação da estrutura e função de néfrons. Este protocolo descreve várias metodologias que podem ser implementadas para avaliar a composição de néfrons túbulo e avaliar a reabsorção renal.

Análise de Composição Nephron e função no rim adulto Zebrafish

Para ajudar a avaliar os mecanismos moleculares subjacentes à regeneração hepática impulsionada pela via biliar do peixe-zebra, estabelecemos um modelo de lesão hepática no qual os hepatócitos que expressam nitroredutase são geneticamente ablacionados após o tratamento com metronidazol.  Neste protocolo, descrevemos como manipular, monitorar e analisar habilmente a ablação de hepatócitos e a regeneração hepática conduzida por vias biliares.

Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

A exposição a teratógenos podem causar defeitos de nascimento. Os peixes-zebra são úteis para a determinação do potencial teratogénico de produtos químicos. Nós demonstrar a utilidade de peixe-zebra, expondo embriões para vários teores de nitritos e também em diferentes tempos de exposição. Mostramos que os nitritos podem ser tóxicos e causar graves defeitos do desenvolvimento.

Peixe-zebra como um modelo para avaliar o potencial teratogênico de nitrito

O peixe-zebra é um popular modelo animal para estudar os mecanismos da degeneração/regeneração da retina em vertebrados. Este protocolo descreve um método para induzir lesões localizadas perturbar a retina exterior com danos mínimos à retina interna. Posteriormente, acompanhamos na vivo a morfologia da retina e a resposta de glia Müller em toda a regeneração da retina.

Ativação de células da Müller Glia em um modelo de regeneração no Zebrafish e degeneração retiniana induzida por Laser

Este protocolo descreve a metodologia para abolar geneticamente o epitélio pigmento da retina (RPE) usando um modelo transgênico de zebrafish. A adaptação do protocolo para incorporar a modulação da via de sinalização usando compostos farmacológicos é extensivamente detalhada. Uma plataforma MATLAB para quantificar a regeneração de RPE com base na pigmentação foi desenvolvida e é apresentada e discutida.

Ablação Mediada por Nitroreductase/Metronidazole e uma Plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudar a regeneração do Pigmento Retinal de Zebrafish Epithelium

Lesão renal aguda (IRA) em seres humanos é um problema clínico comum causado por danos às células epiteliais que compõem néfrons nos rins, e AKI está associada com altas taxas de mortalidade de 50-70% 1. Após a destruição das células epiteliais, néfrons têm uma capacidade limitada de regeneração, embora os mecanismos e as limitações que orientam este fenômeno ainda são pouco compreendidas. Neste artigo de vídeo, descrevemos nossa técnica de ablação a laser alvo de células renais dos néfrons nos...

Ablação a laser da Pronephros Zebrafish para estudo da regeneração epitelial renal

Um modelo atraente para estudar a diferenciação das células-tronco dentro de um animal vivo é o platelminto planária. Regeneração é estudado por experimentos amputação simples que são facilmente realizados em um laboratório básico e são passíveis de (farmacológicos e...

Farmacológica e funcional Ensaios genética para manipular Regeneração da planária Dugesia japonica</em

Um método para condicionalmente knockdown expressão de uma proteína alvo na retina zebrafish adulto é descrito, que envolve a injeção intravítrea injeção morpholinos antisense e electroporating-los na retina. A proteína resultante é derrubado por vários dias, o que permite testar o papel da proteína na regeneração ou retina intacta.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Aprenda a induzir degeneração e regeneração retinal em peixe-zebra adulto usando MNU. Este protocolo combina resposta optocinética, histologia e imunohistoquímica para avaliar alterações funcionais e morfológicas da retina ao longo de 30 dias.

Metilnitrosouréia (MNU) induzida Retinal degeneração e regeneração no peixe zebra: características histológicas e funcionais

Explorar mais vídeos