Name: Infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas Análise de taxanos em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a realizar infusão na artéria carótida para análise farmacocinética de fármacos em camundongos. Este método utiliza cateter personalizado e bomba automatizada para avaliação precisa da distribuição in vivo.

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Nós gostaríamos de agradecer a Facilidade FCCC Laboratory Animal por seu apoio neste projeto. Agradecemos Wolfe Laboratories, Inc. por sua assistência na análise dos níveis de paclitaxel no plasma e tecidos. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede K01CA120091 para EHB e CA06927 a Fox Chase Cancer Center.

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cancer Center, Animal Care Institucional e Uso do Fox Chase e pelo Biotério, e encontrado para estar em conformidade com as diretrizes institucionais para o tratamento humano dos animais. 1. Preliminar Preparação <ol><li> Preparação do cateter: Preparar um cateter a partir de um curto comprimento de tubagem de polietileno, modificado para formar um diluído, ponta furada (Figura 3A). Faça várias cateteres com antecedência e salvar indefinidamente. <ol><li> Acender um bico de Bunsen, e ajustar para estabelecer uma chama baixa constante. Segure tubulação perto de chama para amolecer polietileno. Quando a tubulação começa a derreter, lentamente puxe as duas pontas para criar uma seção engrossada da tubulação, aproximadamente 0,25 mm de diâmetro externo. </li><li> Corte uma extremidade chanfrada cerca de 0,75 centímetros ao longo seção fina. Isso garante tubulação suficiente para ser fixada na artéria, sem criar uma excessivamente longo cateter. NOTA: Um final longo e fino em the cateter tem uma propensão para entupir. Um excessivamente longo final também pode conter líquido suficiente para mudar significativamente a capacidade de volume de líquido do cateter. </li><li> Embotar a extremidade chanfrada, passando rapidamente através da chama - quando devidamente aquecido, o fim torna-se ligeiramente arredondada e ampliada. Os ganchos de ponta ligeiramente para trás, o que ajuda ancorar o tubo durante a inserção na artéria. </li><li> Corte os 6,0 centímetros tubulação a partir do ponto onde começa a fina. Isso faz com que um cateter muito manejável, que é longo o suficiente para enfiar até a saída do pescoço e para manter e trabalhar com confortavelmente, mas curto o suficiente para impedir que o mouse de roer excesso de tubulação ou exigindo muito volume de infusão extra para limpar salina inicial . </li><li> Prepare uma seringa de aproximadamente 0,2 ml de solução de heparina, coberto com uma agulha embotada. Inserir a agulha na extremidade larga do cateter (Figura 3B). Preencha cateter com heparina, tendo o cuidado de assegurar que não há bolhas ema tubagem. Coloque a seringa com heparina e cateter de lado em uma área estéril. Esterilizar cateteres por irradiação gama, através da colocação do cateter (s) numa placa de Petri, e expondo a 20 Gy de irradiação gama. Se você não tiver acesso a uma fonte de radiação gama, verifique com seu biotério para investigar outros meios de esterilização, tais como gás ou esterilização química. Não autoclave, como o polietileno não pode ser esterilizada pelo calor. </li></ol></li><li> Criação de um chumbo de solução salina (Figura 3B). <ol><li> Prepara-se uma segunda seringa de cerca de 0,5 ml de solução salina estéril, tendo o cuidado de garantir uma linha livre de bolhas. </li><li> Corte um segundo pedaço de tubo, de aproximadamente 15 centímetros, e deslizar para a agulha da seringa embotada. Anexar uma porta de conector para a extremidade livre do tubo. </li><li> Teste que o fluxo de solução salina é desobstruída por bem avançar um pequeno volume de solução salina através da liderança. Utilize este chumbo salina após a inserção do cateter, para verificar o fluxo atravéscateter, e para lavar a linha de sangue. Coloque a seringa salina de lado em uma área estéril. </li></ol></li><li> Antes da cirurgia, esterilizar o material em autoclave, ou, alternativamente, esterilização por gás ou esterilização de contas de vidro. </li><li> Prepare a área cirúrgica esterilizada. <ol><li> Limpe as superfícies de bancada e microscópio com desinfectante etanol como 70% ou dióxido de cloro. Cubra banco e base de microscópio com um pano limpo descartável, absorvente. </li><li> Prepare uma placa cirúrgica cobrindo com duas camadas de papel limpo, absorvente, bem presa com fita adesiva. </li></ol></li><li> Coloque para fora todos os materiais cirúrgicos (como catalogado na lista de materiais) para que sejam facilmente acessíveis. <ol><li> Corte três comprimentos de sutura estéril, 8 centímetros cada, e reserve com outros suprimentos. Coloque um porto onde será facilmente disponível (Figura 3B). </li></ol></li></ol> 2. Cirurgia <ol><li> Preparação do animal <ol><li> Anesthetize rato pela exposição a 2-3% de isoflurano em câmara de anestesia conectado a precisão vaporizador. Retirar rato da câmara, e raspar o cabelo do pescoço / torso superior do rato, e abaixo da orelha direita (local de saída do cateter). Administrar veterinária vaselina pomada oftálmica para os olhos para evitar a secura sob anestesia. Certifique-se de que o animal não despertar durante as preparações cirúrgicas por rato permitindo tempo suficiente na câmara de inalação antes de prep (pelo menos de dois minutos), ou através da administração de isoflurano para rato por meio de um cone de nariz durante a preparação. Retorno do mouse para câmara de anestesia. </li><li> Quando o rato é suficientemente inerte, mover para a área cirúrgica esterilizada, coloque anestesia cone do nariz sobre o nariz ea boca do mouse e desviar o fluxo de isoflurano para nariz cone. Confirme anesthetization adequada por beliscar a pata com uma pinça; quando o mouse não mostra nenhuma reação, prossiga para a próxima etapa. </li><li> Posicione o mouse sobre as suas costas, com a cabeça virada para ainvestigador. Prenda as orelhas, fore-patas traseiras e-patas para placa cirúrgica com fita adesiva ou outro dispositivo de retenção para manter o mouse estável. Limpe a área da incisão com iodopovidona e 70% de etanol. </li></ol></li><li> Isolamento da artéria carótida <ol><li> Faça um 1 centímetro longitudinal cortar um pouco para a direita da linha média do pescoço. Utilize uma pinça para separar o músculo e gordura para expor a traqueia (figura 4A). Localize a artéria carótida, paralela à da traquéia (Figura 4B). </li><li> Com cuidado, use uma pinça para fáscia separado que recobrem a artéria (Figura 4C). Levemente puxar o nervo vago além da carótida, e inserir uma pinça para dentro do espaço entre os dois. Fórceps gentilmente abertos para criar uma lacuna na fascia e, cuidadosamente, afastar o nervo da artéria, a partir da bifurcação da artéria perto da laringe (extremidade anterior), para cima (posterior) na medida do possível (pelo menos 3 mm) ( Figura 4D). </li><li> Limpar qualquer refáscia maining até a artéria é bem isolado (Figura 4E). Adicionar uma gota de salino para a área de cirurgia ocasionalmente para manter o tecido húmido e, assim, menos quebradiço e menos propensos a rasgar aleatoriamente. </li></ol></li><li> Colocação de sutura e preparação para a inserção do cateter de artéria (Figuras 4, 5). <ol><li> Use uma pinça para tirar um fio de sutura de seda sob a artéria. Dê um nó seguro para fechar a artéria tão longe em direção ao anterior quanto possível (Figura 4F). </li><li> Desenhe uma segunda linha sob a artéria. Dê um nó retrátil para fechar temporariamente a artéria tão longe em direção ao posterior possível (Figura 4F). </li><li> Desenhe uma terceira linha sob a artéria. Dê um nó muito solto entre os dois primeiros suturas, a ser usado para fixar rapidamente o cateter após a colocação (Figura 4G). </li><li> Mantenha todas as extremidades das suturas para fora do caminho molhando-os com um pouco de etanol a 70%. </li></ol></li><li&gt; inserção do cateter <ol><li> Com a sutura, pegue o nó mais baixo para puxar a artéria pouco tenso. Nick artéria acima, mas muito perto, a sutura anterior (Figura 4H). Tenha cuidado para não cortar muito profundamente, mas verifique a fenda para garantir que a abertura é desobstruída. </li><li> Remover cateter cheio de heparina de agulha de seringa, tentando evitar a criação de grandes bolsões de ar em cada extremidade. Manipular o cateter para a posição de bisel em um ângulo confortável, geralmente para baixo e ligeiramente para a direita (para destros). </li><li> Enquanto segurando a sutura para manter a artéria restante ligeiramente tenso, insira suavemente cateter na fenda (Figura 4I). Use a pinça para segurar a sutura anterior e puxe para baixo sobre a artéria cateter (empurrando para cima excessivamente com o cateter pode causar o fim chanfrado para perfurar a artéria). Cuidadosamente libertar o cateter e anterior sutura. </li></ol></li><li> Obtenção de cateter eo início do fluxo de sangue (Figuras 4J, 5B). <ol><li> Fixar o cateter, apertando o nó da sutura meio, perto da entrada do cateter na artéria. Faça um nó triplo apertado, mas não se esqueça de puxar tão apertada como a obstruir o fluxo através do cateter. Além disso fixar o cateter, amarrando-o para baixo com o fio de sutura anterior, a seguir à entrada da artéria. </li><li> Fixar a vantagem de solução salina para o cateter por meio do conector de ficha, novamente tentando evitar a introdução de bolhas de ar na linha. </li><li> Segure as extremidades da sutura posterior e puxe para liberar o nó. Manobra da sutura para baixo da artéria, em relação ao final do cateter (não remova o fio). O sangue deve fluir para o cateter; se não houver fluxo sanguíneo, mexer suavemente cateter para tentar remover a constrição. </li><li> Quando o fluxo parece desobstruída, use o último fio (da sutura posterior) para amarrar um nó adicional, ligeiramente acima da sutura médio. </li></ol></li><li> Temporary vedação de cateter. Lavar o cateter de sangue, em seguida, utilizar uma pinça hemostática para prender a extremidade do cateter perto do conector de ficha. Remover o conector e substituí-la com a ficha de porta para vedar a extremidade do cateter, e remover a pinça hemostática. </li><li> Reposicionamento cateter para sair da parte de trás do pescoço. <ol><li> Com pinças em cada lado, utilizar um par de pinças para segurar o cateter logo abaixo da sutura anterior, e com a outra, pressionar uma dobra para dentro do cateter por isso vai dobrar facilmente para o lado. Repita o procedimento para criar uma segunda dobra. Isto permite que a extremidade livre do cateter a ser puxado para a parte traseira da cabeça do rato, sem forçar a ponta do cateter para ligar lateralmente contra a parede da artéria. </li><li> Ligue o rato sobre o seu lado (esquerdo), mantendo-se o cone de nariz posicionada sobre a boca e nariz, e limpar a área da incisão com etanol a 70% e povidona-iodo. Adicione uma pequena incisão (aproximadamente 4 mm) abaixo e atrás da orelha direita. </li&gt; <li> Use uma pinça para segurar a aba aberta de pele, durante o trabalho da sonda romba oco sob a pele para criar um canal através do mordente, para a cavidade no pescoço. É aconselhável levar a sonda ao redor da glândula salivar, em vez de tentar ir entre a glândula e pele. Use uma pinça para liberar cuidadosamente um espaço para a sonda para sair. </li><li> Passe plugue porta / cateter através de sonda para sair no pescoço. Não puxe muito difícil; certifique-se o cateter não está esmagando ou constrição dos vasos sanguíneos ou órgãos. </li></ol></li><li> Encerramento e recuperação. Administrar analgésico tópico (por exemplo, bupivacaína) à incisão no ombro, e cobrir a ferida com prova de água, fita adesiva cirúrgica. Aplicar um segundo pedaço de fita adesiva para proteger ainda mais o catéter. <ol><li> Administrar analgésico tópico para incisão no peito, e perto ferida com seda ou grampos. </li><li> Retire do mouse da anestesia, e permitir que animal a se recuperar em um ambiente limpo, aquecido espaço (lugar gaiola em cima de uma almofada de aquecimentoou sob uma lâmpada de aquecimento), durante pelo menos 30 min. </li></ol></li></ol> 3. Infusão <ol><li> Preparar alíquotas de 5 mg / ml, solução de paclitaxel / metanol. <ol><li> Medir 50 mg de paclitaxel para um tubo de centrífuga de 15 ml. Adicionar 10 ml de metanol estéril. Tubo Cap. Rodar à mão ou num agitador rotativo à temperatura ambiente até que o pó esteja dissolvido. </li><li> Alíquota de 500 ml de solução em 20 pequeno, congelador tubos de seguros, e armazenar a -20 ° C. </li><li> Aliquota indivíduo Descongelar à temperatura ambiente ou em banho de água a 37 ° C, imediatamente antes da infusão. </li></ol></li><li> Preparar a bomba de infusão (Figura 6). <ol><li> Corte um longo comprimento de tubo de polietileno de cerca de 40 cm. Anexar uma agulha embotada de uma extremidade, e uma porta de conector para o outro. </li><li> Desenha-se droga dentro de uma seringa com um diâmetro interno conhecido (a maioria das bombas programáveis ​​irá exigir que o diâmetro do cilindro da seringa, a fim de calcular a velocidade de the bomba de braço). Coloque a agulha da seringa e para carregar o medicamento através da agulha e da tubagem. </li><li> Situar a seringa na bomba de acordo com as instruções do fabricante. Primeiro a bomba para que a droga está fluindo sem problemas fora do conector, e ele está pronto para perfusão. </li></ol></li><li> Anexar mouse para bombear. <ol><li> Segure o mouse estável e usar a pinça hemostática para prender cateter, perto do plugue porta. Remova o plugue e substituir com o conector ligado à seringa e tubos. NOTA: O sangue pode começar a fluir de volta através de tubos. </li><li> Rapidamente administrar uma bomba rápida para limpar o volume do cateter (calculada através da observação empírica o volume de 6 cm de tubo), em seguida passar imediatamente para a razão de infusão desejada. </li></ol></li><li> Continue infusão Paclitaxel para o curso de tempo de três horas. <ol><li> Monitorar tubos ocasionalmente para verificar se há vazamentos nos cruzamentos como este é frequentemente um sinal de um bloqueio no fluxo para o mouse.Assista o mouse para reações esperadas ou inesperadas à infusão (letargia ou hiperatividade, sinais de desconforto). </li><li> Dependendo da duração e da natureza da infusão, o mouse pode não comer ou beber, mas não se esqueça de fornecer o acesso a alimentos e água de acordo com a política estabelecida da instituição. Esteja ciente do potencial para desidratar o mouse através da recolha de grandes quantidades de sangue. </li><li> Continue a manter o warm gaiola com uma almofada de aquecimento ou uma lâmpada, a não ser que o mouse aparece a vontade de ficar longe do calor. Se um animal não é sacrificado dentro de várias horas após a cirurgia, implementar plano de tratamento pós-cirúrgico do animal, incluindo as condições de habitação estéreis e tratamento para dor pós-cirúrgica. </li><li> Manter uma vigilância apertada sobre o mouse, especialmente no primeiro poucos minutos, para garantir que ele não puxe o tubo através hiperatividade, ou irritação da tubulação (que pode ser um sinal de uma inserção pobres). Se o mouse não está sobre-ativo, monito constanteanel pode não ser necessário, mas verifique o mouse rotineiramente para garantir que o animal não se emaranhar na tubulação. Arreios e sistema de corda estão disponíveis comercialmente, mas seu uso está fora do âmbito deste protocolo. </li></ol></li><li> Recolha de amostras. <ol><li> Coletar amostras de sangue em intervalos regulares por sangramentos submandibular ou retro-orbital (Se o seu protocolo não faz uso de modelos de tumores mamários, considere coleta de sangue através de um cateter jugular inserido, ao mesmo tempo que o cateter carótida). Tenha cuidado para não puxar a linha de infusão. Se a coleta por hemorragias retro-orbital, levemente anestesiar o mouse com um anestésico inalatório (por exemplo methoxyflurane) para que um não precisa agarrar pelo pescoço para garantir o mouse. </li><li> Girar o hematócrito no sangue em centrífuga para separar as células do sangue a partir do plasma. Use uma caneta arquivo ou diamante-ponta para marcar tubo em face de separação de fases. Quebre tubo e recolher plasma só, em, tubo congelador-safe pequeno. Guarde-o em -80 ° C até à análise. NOTA: Se uma centrífuga de hematócrito não está disponível, transferir a amostra de sangue em tubo de micro-centrífuga, e giram em uma micro-centrifugadora a alta velocidade para separar as células do sangue a partir do plasma. Recolher o plasma para um segundo tubo, e armazenar a -80 ° C. </li><li> Euthanize rato por asfixia com CO2. Colete tecido (cerca de 20-50 mg) de órgãos de interesse e congelamento de flash em nitrogênio líquido. Armazenar a -80 ° C até análise. </li></ol></li></ol> Análise 4. Amostra Observação: Todas as amostras para este protocolo foram analisados ​​através de um laboratório externo por cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC - MS / MS), que calculou as concentrações de paclitaxel como se segue: <ol><li> Extrair paclitaxel a partir de amostras. Homogeneizar amostra de tecido em ácido acético a 0,1%, 50% de metanol antes da extracção. Extrair o paclitaxel por extracção líquido / líquido, utilizando éter metil terc-butílico (MTBE) fortificado com um padrão analógico interno (docetaxel). Retirar amostras de MTBE e secos. Ressuspender em 50% de acetonitrilo, uma solução de ácido acético a 0,1%. </li><li> Prepare padrões de calibração. Adicionar uma concentração conhecida de paclitaxel a matriz de C57BL / 6 apropriar-se para se obter uma gama definitiva de normas (de 1 a 20.000 ng / ml para as amostras de plasma, a partir de 0,1 a 5.000 ng / mL para amostras de tecidos). Extrair as normas em duplicado, utilizando o mesmo método que para as amostras de estudo acima. Medir pico paclitaxel em amostras por HPLC / MS / MS utilizando ionização por electropulverização. </li><li> Calcular a concentração, utilizando o rácio de paclitaxel a área do padrão interno. Use padrões de calibração para criar uma curva padrão, e as amostras de estudo interpolados por encaixe na curva. Normalizar a concentração de amostras de estudo pelo peso inicial de amostra antes da homogeneização. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Infusão da artéria carótida é uma técnica importante neste estudo de farmacocinética de paclitaxel. Perfusão da artéria carótida é um método para distribuir rapidamente drogas em todo o sistema circulatório 14. A infusão hr 3 é um mímico mais perto de administração clínica de drogas, como taxanos do que injeções em bolus. A cirurgia pode ser realizada de forma fiável por um único indivíduo, o tempo de cirurgia é relativamente curto, e as taxas de sucesso são&gt; 75%. Após as amostras são coletadas, elas devem...

A infusão da droga através da carótida pode ser realizada de forma fiável e reprodutível pelo equipamento e técnica de optimização. O procedimento não é complicado, embora exija um bom controle e atenção aos detalhes. Superior cuidado e habilidade são necessários para isolar a artéria carótida e inserir o cateter, o qual pode, geralmente, ser adquirido através da prática. Cirurgia por um técnico experiente não deve exceder uma hora. Após a cirurgia bem sucedida, o rato deve aparecer normal e saudável (embora o rato pode reagir com a infusão da droga real), e fármaco (s) podem ser administrados em uma dosagem uniforme e contínua controlada. As amostras de sangue devem ser tomadas a partir de um site que não seja da artéria carótida; sangramentos retro-orbital provou fácil de coletar e satisfatória para análise das concentrações de drogas. Cateteres de tamanho e forma ideal são um trunfo inestimável para a execução de uma infusão de sucesso 11. Encontramos o cateteres disponíveis commercially muitas vezes a ser muito grande e / ou muito flexível para permitir um acesso conveniente para a artéria carótida do rato. Ele provou preferível cateteres de moda do tubo de polietileno usado para conectar o mouse para a infusão de seringa. Assim, todos os tubos, conectores e agulhas de dimensões eram consistentes, que simplificados conjunto de infusão. Usando esta técnica, não é necessário empurrar a ponta do cateter na artéria além do ponto onde ainda é visível, e o fluxo sanguíneo para a artéria carótida não é restaurado até depois de o cateter é inicialmente fixado. Isto reduz os riscos de punção da artéria ou de ter o cateter empurrado para fora pela alta pressão do fluxo sanguíneo. O projeto cateter aqui não incorpora uma &quot;colisão&quot; para segurá-la no lugar, garantindo assim o cateter bem com suturas e fita cirúrgica é uma prioridade. Infusões pode ser preferível para as injecções de bolus iv comuns, como um imitador de melhor administração clínica demedicamentos, tais como taxanos 3, 12, 13. A técnica aqui descrita foi desenvolvida originalmente para permitir a infusão em modelos de rato, em que o acesso à veia jugular ou femoral foi impedida por crescimento do tumor mamário e / ou vascularização excessiva da área de inserção. Este método pode muitas vezes ser adequado, mesmo em camundongos livres de tumor: apesar de isolar e cateterização da carótida é um pouco mais invasivo, descobrimos que é preferível a jugular, pois a propensão da parede jugular para rasgar resultou em inserções mais falhou e falhas para completar o curso de tempo de 3 horas. Embora os resultados aqui apresentados são de C57BL / 6J (in-educado casa) ratos, temos utilizado essa técnica para infundir com sucesso paclitaxel em várias linhagens de camundongos, incluindo FVB e mistos estirpes, a seguir a farmacocinética em modelos de ratos manipulados transgenicamente para regular as funções de transportadores celulares. As amostras de sangue e tecidos coletados mostraram níveis esperados de paclitaxel, no intervalo dos níveis observados após infusões jugulares 1. Esta técnica pode ser esperado funcionar igualmente bem em outros modelos de ratinho e com outras soluções injectáveis.

<table><tbody><tr><td>Tubulação de polietileno 0,024" OD X 0,011 " IDENTIFICAÇÃO&nbsp;</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>PE10</td><td></td></tr><tr><td>3 agulhas cegas (calibre 30)</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td>Plugue de porta de aço inoxidável <td>NB-30</td><td></td></tr><tr><td>(calibre 28)</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>PP-28</td><td>Ligeiramente maior que a identificação da tubulação PE, para se encaixar perfeitamente e manter uma vedação firme.</td></tr><tr><td>2 plugues de conector de aço inoxidável (calibre 30)</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>C-30</td><td></td></tr><tr><td>Três seringas de 1 cc</td><td>Becton, Dickinson e Co.</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>Solução salina estéril a 0,9%</td><td>Hospira</td><td>0409-7984-37</td><td></td></tr><tr><td>Cath-Loc HGS Heparina/Glycerol Solution&nbsp;</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td>Sutura de seda <td>HGS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>SUT-S&nbsp; 113</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura Vanna (micro-tesoura)</td><td>World Precision Instruments</td><td>14122</td><td>Este modelo tem uma ponta curva, mas tesouras de ponta reta também funcionam.</td></tr><tr><td>Fórceps Hemostático Hartman Mesquito</td><td>World Precision Instruments</td><td>501705</td><td></td></tr><tr><td>Betadine Swabsticks</td><td>Perdue Products L.P.</td><td>BSWS1S</td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaína</td><td>Hospira</td><td>0409-1160-01</td><td>Pode ser substituído por lidocaína ou anestesia local semelhante.</td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>LC Laboratories</td><td>P-9600</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Tubos Capilares de Hematócrito, Heparinizado</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-566</td><td></td></tr><tr><td>Micro Tubo Capilar Selante&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-678</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J camundongos</td><td>Fox Chase Cancer Center, Laboratório Animal Facility em-house-bred</td><td></td><td></td></tr><tr><td>API 4000 Q-Trap espetrômetro em massa Applied</td><td>Biosystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas análise de taxanos em ratos

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

Ao propor a utilização de um fármaco, a combinação de fármacos, ou a entrega de drogas para um novo sistema, deve-se avaliar a farmacocinética do fármaco no modelo de estudo. Como o uso de modelos do rato são muitas vezes um passo vital para a descoberta de drogas pré-clínica e no desenvolvimento de drogas 1-8, é necessária a concepção de um sistema para introduzir medicamentos em ratos de uma maneira reprodutível uniforme,. Idealmente, o sistema deve permitir a recolha de amostras de sangue em intervalos regulares ao longo de um período de tempo definido. A capacidade para medir as concentrações de droga por espectrometria de massa, tem permitido aos investigadores seguir as mudanças nos níveis de droga no plasma ao longo do tempo em murganhos individuais 1, 9, 10. Neste estudo, o paclitaxel foi introduzido em ratinhos transgénicos como uma infusão arterial contínua ao longo de três horas, enquanto que as amostras de sangue foram simultaneamente tomadas por hemorragias retro-orbital em momentos set. Infusões artéria carótida são uma alternativa potencial para as infusões de veia jugular, quando factores tais comotumores mamários ou outras obstruções fazer infusões jugular impraticável. Usando esta técnica, as concentrações de paclitaxel no plasma e tecido atingido níveis semelhantes em comparação com a infusão jugular. Neste tutorial, vamos demonstrar como a cateterização da artéria carótida com sucesso através da preparação de um cateter otimizado para o modelo individual do mouse, em seguida, mostrar como inserir e fixar o cateter na artéria carótida de rato, coloque a ponta do cateter para fora através da parte traseira do pescoço do rato, e ligar o rato a uma bomba para entregar uma velocidade controlada de influxo de drogas. Várias sangramentos retro-orbital de baixo volume para permitir a análise de concentrações de droga no plasma ao longo do tempo.

O paclitaxel distribuição segue padrões previsíveis durante um regime de dosagem de 3 h de uma infusão de 15 minutos de alta velocidade, seguido de uma infusão de 165 minutos a baixa velocidade. A Figura 1 mostra uma comparação entre a infusão venosa concentrações de paclitaxel plasma jugular e da artéria carótida-infusões. As concentrações de paclitaxel cair rapidamente nos primeiros 15 minutos após a infusão inicial de alto volume, e depois se estabilizar ao longo do próxi...

Este método foi desenvolvido com o objectivo de proporcionar uma solução de fármaco estável através da artéria carótida, para avaliar a farmacocinética de drogas novas em modelos de rato.

Infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas Análise de taxanos em Ratos

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

O objetivo geral deste procedimento é infundir um medicamento de interesse através da artéria carótida para analisar o perfil farmacocinético do medicamento. Isso é feito primeiro moldando um cateter personalizado a partir de tubos de polietileno e, em seguida, prendendo o cateter dentro da artéria carótida do camundongo. Em seguida, o camundongo é conectado a uma bomba de infusão automatizada por meio do cateter da artéria carótida.Na etapa final, a droga é infundida no camundongo a uma taxa constante e amostras de sangue são coletadas em intervalos regulares. Em última análise, cromatografia líquida, espectrometria de massa é usada para determinar a concentração do medicamento nas amostras de tecido e plasma. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como injeção em bolus, intraperitoneal ou veia da cauda ou infusão jugular, é que ela é representativa das taxas de infusão clínica, além de geralmente ser mais fácil de executar do que a inserção jugular.Este método pode responder a questões-chave em farmacologia, como qual é a distribuição in vivo de um medicamento, ou podemos determinar se um inibidor ou modulador afeta a função da proteína. Para preparar um cateter para o experimento, primeiro estabeleça uma chama baixa e constante em um bico de bunsen. Em seguida, segure um pedaço de tubo perto da chama para amolecer o polietileno.Quando o tubo começar a derreter, separe lentamente as duas extremidades para criar uma seção fina do tubo, com aproximadamente 0,25 milímetros de diâmetro. Em seguida, corte uma extremidade chanfrada no tubo aproximadamente 0,75 centímetros ao longo da seção fina e, em seguida, passe a extremidade rapidamente pela chama para torná-la ligeiramente arredondada e aumentada. A ponta se enganchará ligeiramente para trás, o que ajudará a ancorar o tubo durante a inserção na artéria.Corte o tubo a 6,0 centímetros do ponto onde começa a afinar para fazer um cateter e, em seguida, encha uma seringa equipada com uma agulha embotada com 200 microlitros de solução de heparina. Insira a agulha na extremidade larga do cateter e encha o cateter com heparina. Tomando cuidado para evitar bolhas.Em seguida, armazene a agulha e o cateter em um local estéril para isolar a artéria carótida. Comece fazendo um corte longitudinal de um centímetro ligeiramente à direita da linha média do pescoço do animal e, em seguida, use uma pinça para separar a gordura e o músculo e expor a traqueia. A artéria carótida corre paralela à traqueia.Em seguida, separe cuidadosamente a fáscia que cobre a artéria e, em seguida, puxe levemente o nervo VAs para o lado. Insira a pinça no espaço entre a artéria carótida e o nervo VAs e abra suavemente a pinça para criar uma lacuna no rosto. Puxe cuidadosamente o nervo para longe da artéria, abrindo um espaço da bifurcação na extremidade anterior perto da laringe até a extremidade posterior mais exposta, isolando pelo menos três milímetros de comprimento da artéria.Em seguida, use uma pinça para desenhar um fio de sutura de seda sob a artéria e dê um nó seguro para fechar a artéria o mais longe possível na extremidade anterior. Depois de colocar um segundo fio, dê um nó retrátil para fechar temporariamente a artéria o mais próximo possível da extremidade posterior. Em seguida, use um terceiro fio para dar um nó muito frouxo entre as duas primeiras suturas a serem usadas para prender rapidamente o cateter após a colocação.Para inserir o cateter, pegue o nó de sutura inferior para puxar a artéria ligeiramente esticada. Em seguida, corte a artéria acima e muito perto da sutura anterior. Tomando cuidado para não cortar muito profundamente.Verifique a fenda para certificar-se de que a abertura está desobstruída. Remova o cateter cheio de heparina da agulha da seringa e, em seguida, tome cuidado para não criar grandes bolsas de ar. Em cada extremidade, manipule o cateter para posicionar a extremidade chanfrada em um ângulo confortável para baixo e ligeiramente em direção à mão dominante.Em seguida, enquanto segura a sutura, para manter a artéria ligeiramente esticada, insira suavemente o cateter na fenda. Em seguida, use a pinça para agarrar o nó de sutura anterior e puxe suavemente a artéria para baixo sobre o cateter. Solte cuidadosamente o cateter e a sutura anterior.Em seguida, aperte o nó do meio para prender o cateter próximo à entrada do cateter na artéria, tomando cuidado para não obstruir o fluxo através do cateter. Faça um nó triplo apertado com a sutura do meio e, em seguida, use a sutura anterior para prender o cateter no lugar abaixo da entrada da artéria. Agora use um plugue conector para conectar um cabo de solução salina ao cateter, tomando cuidado para não criar bolhas.Em seguida, segure as extremidades da sutura posterior e puxe-a suavemente para liberar o nó, manobre a sutura pela artéria e sobre a extremidade do cateter sem remover o fio. O sangue deve fluir para o cateter quando o fluxo parecer desobstruído. Use o fio da sutura posterior para dar um nó adicional ligeiramente acima da sutura do meio.Em seguida, lave o cateter de sangue e use um hemostático para prender a extremidade do cateter perto do plugue do conector. Substitua o conector por um plugue de porta para vedar a extremidade do cateter e remover o hemostático. Em seguida, use um par de pinças para segurar o cateter logo abaixo da sutura anterior e outra pinça para pressionar uma dobra no cateter para que ele se dobre facilmente para o lado depois de criar uma segunda dobra.Da mesma forma, vire o mouse para o lado esquerdo e limpe a área abaixo e logo atrás da orelha do animal com etanol 70% e iodopovidona. Quando a área estiver desinfetada, faça uma pequena incisão de quatro milímetros na pele. Em seguida, use uma pinça para manter aberta a aba de tecido e trabalhe uma sonda oca e romba sob a pele para criar um canal através da bochecha até a cavidade no pescoço.Use a pinça para liberar cuidadosamente um espaço para a saída da sonda e, em seguida, rosqueie suavemente o plugue da porta e o cateter através da sonda até o orifício de saída. Tomando cuidado para não esmagar ou contrair quaisquer vasos sanguíneos ou órgãos após o animal ter se recuperado por 30 a 60 minutos, prenda uma agulha cega em uma extremidade de um pedaço de tubo de polietileno de 40 centímetros e uma porta de conexão na outra. Em seguida, coloque o medicamento de interesse em uma seringa com um diâmetro interno conhecido.Conecte a agulha à seringa e carregue o medicamento através da agulha e do tubo. Depois de colocar a seringa na bomba, de acordo com as instruções do fabricante, prepare a bomba para que o medicamento flua suavemente para fora do conector. Conecte então para conectar o animal à bomba, segure o mouse com firmeza e use o hemostático para prender o cateter próximo ao plugue da porta.Por fim, substitua o plugue por um conector conectado à seringa e ao tubo. Administre rapidamente uma bomba rápida para limpar o volume do cateter e, em seguida, mude imediatamente para a taxa de infusão desejada. Nesta primeira figura, é mostrada uma comparação da concentração plasmática de paclitaxel após infusão da veia jugular e infusão da artéria carótida.A concentração do medicamento cai rapidamente nos primeiros 15 minutos após uma infusão inicial de alto volume e, em seguida, se estabiliza nos próximos 150 minutos. Em comparação, os níveis de paclitaxel em uma infusão ruim começam relativamente baixos e oscilam para cima e para baixo durante todo o ensaio, provavelmente devido a um bloqueio na linha no início da infusão. Aqui, os níveis relativos de paclitaxel no fígado, cérebro e plasma sanguíneo ao final de uma infusão de três horas são mostrados Como esperado, o animal exibe uma alta ligação às proteínas plasmáticas, juntamente com baixas concentrações de droga no tecido cerebral Uma vez dominada, essa técnica deve levar de 45 a 60 minutos se realizada corretamente.Depois de assistir ao vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar uma artéria carótida, inserir um cateter e realizar uma infusão.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Esta descreve uma cirurgia de ligadura parcial da carótida, o que causa as condições de fluxo perturbado e desenvolvimento da aterosclerose subsequente (em duas semanas) com intraplaca neo-vascularização (em quatro semanas) em ratos artéria carótida comum. Descrevemos também um novo método de isolamento de RNA a íntima carótida, proporcionando RNA de alta pureza endoteliais.

Um modelo de Disturbed Aterosclerose Flow-induzido em rato artéria carótida pela ligadura parcial e um método simples de isolamento de RNA a partir do endotélio Carótidas

O manguito constricting apresentado neste artigo é projetado para induzir a aterosclerose na artéria carótida comum murino. Devido à forma cônica de sua luz interior do manguito implantado gera regiões bem definidas de baixa, alta tensão e de cisalhamento oscilatório desencadear o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas de diferentes fenótipos inflamatórios.

Implantação de um Cuff Carotid para Triggering Shear-estresse aterosclerose induzida em camundongos

Fonte: Leda, A. R., et al. Técnica de infusão de microcirurgia de camundongo para entrega de substância direcionada no SNC através da artéria carótida interna. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra um procedimento microcirúrgico projetado para facilitar a infusão direcionada de uma substância de teste no cérebro através da artéria carótida interna (ACI). O procedimento envolve sutura precisa e manipulação vascular para restringir temporariamente o fluxo sanguíneo, garantindo uma entrega...

Entrega de substâncias direcionadas ao cérebro do camundongo por meio de infusão na artéria carótida interna

Descrevemos aqui o método de imagem baseada em microscopia fluorescente confocal de fibra (FCFM), que fornece um modo inovador para entender fenômenos fisiológicos nos níveis celular e subcelular em animais.

Induzida pela quimioterapia Vascular Toxicidade - em tempo real<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem de Impairment Vessel

O presente protocolo descreve uma técnica de infusão de microcirurgia de camundongo, que efetivamente fornece substâncias diretamente no cérebro através da artéria carótida interna.

Técnica do mouse Microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no SNC via Artéria carótida interna

Metástases cerebrais tornou-se uma necessidade médica não atendida urgente como a sua incidência tem aumentado enquanto as opções terapêuticas têm permanecido paliativos. Criando modelos animais experimentais de metástase cerebral através de injecção arterial intracarotídeo de células cancerosas facilita estudos sobre os mecanismos da biologia da doença e avaliação de novos regimes de intervenção.

Intracarotídeo injeção de células de cancer para produzir mouse modelos de metástases cerebrais

Apresentamos um método para isolar células e núcleos endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos expostas a condições de fluxo estáveis ou perturbadas para a realização de experimentos ômicos unicelulares.

Isolamento de células endoteliais do lúmen de artérias carótidas de camundongos para experimentos multi-ômicos unicelulares

A metástase cerebral é uma causa de morbidade e mortalidade graves em pacientes com câncer. A maioria dos modelos de camundongos com metástases cerebrais é complicada por metástases sistêmicas que confundem a análise da mortalidade e os resultados da intervenção terapêutica. Apresenta-se aqui um protocolo para injeção carotídea interna de células cancerígenas que produz tumores intracranianos consistentes com tumores sistêmicos mínimos.

Modelagem de Metástases Cerebrais por Injeção de Células Cancerígenas na Artéria Carótida Interna

Os tumores do sistema nervoso central (SNC) são a principal causa de morte relacionada ao câncer em crianças, e as terapias loco-regionais baseadas em imunidade estão sendo cada vez mais testadas para pacientes em ensaios clínicos. Este protocolo descreve métodos de implante de cânula locorregional em camundongos para avaliação pré-clínica de infusões imunoterápicas direcionadas a tumores do SNC.

Implante de Cânula Intracraniana para Infusões Seriadas de Células T com Receptor de Antígeno Quimérico Quimérico (CAR) em Camundongos

O reparo da artéria intracarótida em um modelo de camundongo após a injeção retorna o fluxo sanguíneo para a artéria sem afetar negativamente a distribuição do material injetado. O reparo no local da injeção facilita as injeções subsequentes através da mesma artéria e previne a isquemia cerebral em cepas de camundongos que não possuem um Círculo de Willis completo.

Facilitando injeções intracarotídeas repetidas em modelos de camundongos por uma nova técnica de reparo no local da injeção

O presente protocolo descreve um método cirúrgico padronizado para a indução de aneurismas carotídeos em modelo murino por meio de uma única operação cirúrgica.

Um modelo murino de formação de aneurisma carotídeo

Aprenda a realizar infusão na artéria carótida para análise farmacocinética de fármacos em camundongos. Este método utiliza cateter personalizado e bomba automatizada para avaliação precisa da distribuição in vivo.

Infusões artéria carótida para farmacocinéticas e farmacodinâmicas Análise de taxanos em Ratos

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