Um método altamente reprodutível e fácil de executar In Vivo Ocular Enucleação no Rato após a abertura dos olhos
6 de outubro de 2014
A remoção de olhos, também chamada de enucleação, fornece uma estratégia útil para estudar aspectos do visual, cross-modal, e plasticidade do desenvolvimento ao longo do sistema visual de mamíferos, uma vez que induz irreversível parcial (monocular) ou completo (binocular) a perda da visão. Aqui nós descrevemos um método altamente reprodutível e fácil de realizar in vivo enucleação.
O objetivo geral deste procedimento é remover com sucesso um olho de um camundongo anestesiado de maneira muito direta e reprodutível. Isso é feito primeiro deslocando o globo ocular pressionando suavemente o canto com uma pinça curva. A segunda etapa do procedimento é guiar a pinça atrás do olho, para segurar firmemente o nervo óptico.
O terceiro passo é fazer movimentos circulares. Com a mão segurando a pinça, o corpo do mouse se moverá na mesma direção. A etapa final é aumentar gradualmente a velocidade dos movimentos para garantir a constrição do nervo óptico, resultando no descolamento do globo ocular.
Em última análise, o olho pode ser usado para estudar longitudinalmente a via visual AFR, por exemplo, revelando diferentes processos de plasticidade de privação sensorial no cérebro do camundongo. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, que geralmente usam sutura e dissecção romba, é que nosso método de iação é simplesmente baseado na constrição do nervo óptico, o que resulta em mínimo ou nenhum sangramento e é muito fácil de aprender. Comece anestesiando o camundongo usando uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina e meina em solução salina.
Confirme a sedação verificando os reflexos do mouse. Aperte os dedos dos pés com uma pinça e verifique se há uma resposta reflexa. Se não houver resposta, use um aplicador com ponta de algodão e etanol 70% para limpar as pálpebras e a área ao redor do olho.
Se não houver resposta ao piscar dos olhos, prossiga com o olho na nucleação. Coloque o mouse em uma superfície estável, plana, lisa e seca. Esterilize as pontas da pinça serrilhada curva em um esterilizador de esferas de vidro.
O melhor tamanho de ponta a ser usado é 0,5 por 0,4 milímetros. Em seguida, pressione suavemente o canto com a pinça até que o globo ocular seja deslocado da cavidade e o nervo óptico esteja acessível. Em seguida, guie a pinça atrás do olho e pressione e segure firmemente o nervo óptico com o nervo óptico agarrado Lentamente, comece a mover a pinça em círculos na direção de menor resistência.
Mantendo o mouse contra a mesa de operação, o mouse deve ser preso. Seu corpo também deve se mover. Acelere gradualmente até depois de sete a 15 movimentos circulares, o nervo óptico se contrai e o globo ocular se desprende.
Se as rotações forem muito rápidas ou as pinças forem puxadas com muita força, o nervo se romperá prematuramente e a súplica se seguirá. Comece com a reversão da anestesia. Dê ao camundongo uma injeção intraperitoneal de aamaz todo o cloridrato em solução salina.
Em seguida, administre 0,05 por via intramuscular. Mililitros de analgésico preparado, como meloxicam e analgesia, devem ser administrados a cada 24 horas. Agora, aplique pomada ocular no olho restante para evitar a desidratação da córnea.
Se isso tivesse sido aplicado antes da cirurgia, teria manchado a mesa. Mova o mouse para uma gaiola de retenção, controle a temperatura corporal do mouse usando uma placa de aquecimento ou um cobertor enquanto ele se recupera quando o animal recupera o controle motor, transfira-o de volta para sua gaiola de origem. Uma remoção bem-sucedida do olho é caracterizada pela ausência de sangramento ou qualquer dano físico aparente ao tecido orbital ou à órbita ocular.
O olho enucleado deve ter características de um globo intacto, como uma córnea lisa e coróide. O nervo óptico deve ser contraído na base da retina. O comprimento restante do nervo no animal deve mostrar um corte limpo e a área cerebral circundante não deve ser danificada.
Um experimento foi conduzido usando essas técnicas, seguido pela detecção de mRNA Z 2 68 por hibridização radioativa em C dois para descobrir a atividade neuronal induzida visualmente no córtex cerebral. Em contraste com os controles estimulados visualmente, os camundongos com ambos os olhos e nucleados mostraram atividade basal no córtex visual esquerdo e direito devido à completa falta de entrada visual. Como tal, as fronteiras entre o córtex visual e o não visual foram descobertas.
A enucleação monocular revelou as duas regiões monoculares como hipoativas no córtex visual contralateral ao corante removido. Essas regiões estão localizadas medial e lateralmente à zona binocular central. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de um minuto se executada corretamente.
Portanto, fornece um método eficiente para examinar a atividade, plasticidade ou outros fenômenos na via visual otorrinolaringológica.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método simples para realizar enucleação in vivo em camundongos, permitindo aos pesquisadores estudar a plasticidade visual e cruzada. A técnica minimiza sangramentos e é fácil de aprender, tornando-se adequada para diversas aplicações experimentais.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Sistema Visual
- Pesquisa em Plasticidade
Contexto
- A enucleação induz perda da visão, facilitando estudos sobre o processamento visual.
- O procedimento permite a análise dos efeitos da privação sensorial no cérebro.
- Os métodos existentes frequentemente envolvem técnicas complexas que podem levar a complicações.
- Este método tem como objetivo fornecer uma alternativa mais segura e eficiente.
Objetivo do Estudo
- Descrever uma técnica reprodutível para remoção do olho em camundongos.
- Permitir o estudo das vias visuais e da plasticidade no cérebro.
- Aprimorar os métodos de enucleação existentes.
Métodos Utilizados
- Anestesia do camundongo utilizando uma mistura de cetamina e solução salina.
- Deslocamento do globo ocular utilizando pinça curva.
- Preensão e constrição do nervo óptico para destacar o globo ocular.
- Cuidados pós-operatórios, incluindo alívio da dor e monitoramento da recuperação.
Resultados Principais
- A técnica resultou em sangramento mínimo e tecidos circundantes intactos.
- Camundongos enucleados mostraram atividade neuronal alterada na córtex visual.
- A enucleação monocular revelou hipofunção em regiões visuais específicas.
- O procedimento pode ser realizado de forma eficiente em menos de um minuto.
Conclusões
- O método de enucleação descrito é eficaz para o estudo da plasticidade visual.
- Oferece uma abordagem confiável para investigar os efeitos da privação sensorial.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para obter insights mais profundos sobre o processamento visual.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A enucleação ocular in vivo confiável em camundongos permite a investigação de alto rendimento da plasticidade do sistema visual e dos mecanismos de privação sensorial, apoiando a validação precoce de alvos em neurobiologia. A reprodutibilidade e a simplicidade operacional do método reduzem a variabilidade do procedimento, aumentando a confiança preditiva nas análises subsequentes. Essa capacidade é estrategicamente relevante para equipes de biofármacos que buscam modelos pré-clínicos robustos para investigar a adaptação neural e a plasticidade cruzada de modalidades.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite modelos de desaferentação controlada para estudos mecanicistas da plasticidade neural.
- Apoia a validação funcional de alvos ao isolar variáveis de entrada sensorial in vivo.
- Facilita a investigação orientada por hipóteses da adaptação da via visual.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece preparação padronizada de modelos animais para triagem fenotípica reproduzível.
- Garante dano tecidual mínimo e recuperação pós-operatória consistente, apoiando a confiabilidade do ensaio.
- Permite avaliação quantitativa das alterações na atividade neuronal após privação sensorial.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para o estudo da neuroplasticidade e perda sensorial.
- Apoia a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica de alvos neurais.
- Reduz o risco biológico ao permitir a geração robusta e escalável de modelos animais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de enucleação se insere na continuidade entre a descoberta inicial e a fase pré-clínica, fornecendo uma base para a redução de riscos mecanicistas e a validação de alvos na pesquisa neurobiológica.
- Biologia da Descoberta: Facilita o teste da hipótese nula ao permitir a remoção precisa da entrada sensorial.
- Triagem: Fornece modelos animais reprodutíveis para ensaios quantitativos posteriores.
- Análises: Permite a medição da atividade neuronal e da plasticidade cortical após enucleação.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas básicas com modelos pré-clínicos de privação sensorial.
- Reutilização Empresarial: Oferece um protocolo escalável e de baixa variabilidade, adaptável a diferentes modelos de roedores.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em estudos de adaptação neural e validação de alvos.
- Valor Operacional: Padroniza o preparo dos animais, reduzindo a carga de treinamento e a variabilidade dos procedimentos.
- Valor Estratégico: Permite decisões eficientes de prosseguir/não prosseguir em portfólios com foco em neuroplasticidade.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos e vias neurais.
Considerações de Implementação
- Exige proficiência em anestesia de roedores e manipulação microcirúrgica.
- Requer acesso a pinças curvas esterilizadas e infraestrutura de cuidados pós-operatórios.
- Exige padronização entre equipes para reprodutibilidade em estudos multicêntricos.
- A adaptação a outras espécies de roedores é viável com modificações mínimas.
- Não é adequado para análise de tecido retiniano devido ao potencial dano procedural.
