Medições em tempo real de proteína de membrana: Receptor Interações Usando Superfície Plasmon Resonance (SPR)

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar uma interação do receptor de proteína usando plasma de superfície e ressonância. Isso é obtido pela injeção dos íons de níquel sobre o ácido nitro triacético ou matriz NT a. Em seguida, uma das proteínas, denominada ligante, é imobilizada no chip do sensor após uma injeção em branco.

A segunda proteína denominada analito é injetada sobre o ligante imobilizado. Para detectar uma interação entre as duas proteínas, os resultados mostram que as duas proteínas interagem transitoriamente com as associações do analito e se dissociam do ligante. A afinidade da interação pode ser calculada com base nas taxas de dissociação e dissociação medidas das duas proteínas.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como pull down ou imunoprecipitação, é que ela pode identificar interações transitórias ou de baixa afinidade que geralmente são de grandes consequências biológicas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave Em bioquímica, como se a proteína de interesse se liga a outra proteína ou outra molécula pequena, a natureza da interação pode ser determinada e a afinidade pode ser medida. Para preparar a amostra, remover todos os agregados da proteína purificada, tal como descrito no protocolo de texto.

Prepare o tampão de corrida e filtre todos os tampões e amostras de proteínas usando filtros de 22 mícrons de ponto zero. Certifique-se de que os filtros são compatíveis com proteínas com antecedência antes de conectar a garrafa tampão de corrida à entrada da bomba. Reserve 10 mililitros do tampão de corrida em um tubo separado.

Em seguida, dilua as amostras no buffer em execução para evitar incompatibilidades de buffer. Como regra geral, para desmobilização estável do ligante, use baixas concentrações de ligante com injeções mais longas em baixo fluxo, em oposição a altas concentrações de ligante Com injeções mais curtas em alto fluxo, dilua o estoque de ligante concentrado em tampão de corrida até uma concentração final de aproximadamente 20 microgramas por mililitro. Por fim, diluir a substância a analisar na substância a correr até à concentração desejada.

Para um sistema de afinidade desconhecida, testar uma gama de concentrações de analitos de 10 micromolares a 10 anos molares em diluições dez vezes. Nesta demonstração, um chip acoplado a NTA adequado para capturar proteínas com uma etiqueta de oli-histidina é reutilizado. Depois de retirar o chip armazenado do tampão, enxágue abundantemente com água bidestilada

Para encaixar o chip no instrumento SPR, abra a porta do chip do sensor e coloque o chip em sua bainha. Feche a porta e pressione o chip dock. Defina a temperatura da célula do chip para 25 graus Celsius.

Defina o compartimento de amostras para sete graus Celsius para manter a proteína estável durante todo o experimento. Depois de preparar as soluções para carregamento e decapagem conforme descrito no protocolo de texto, prepare o instrumento SPR com buffer de corrida. Para a próxima etapa, defina o fluxo para 50 microlitros por minuto.

Defina os caminhos de fluxo e a subtração de referência para obter os resultados descritos aqui. Defina os caminhos para a célula de fluxo número um e a célula de fluxo número dois e a célula de fluxo número um, subtraídos da célula de fluxo número dois, após selecionar o rack de amostras adequado, salve o arquivo de resultados antes de iniciar o experimento para que os dados sejam salvos durante a execução. Cada experimento é composto por ciclos.

Mantenha um registro claro das injeções feitas em cada ciclo e separe os ligantes que carregam a injeção em branco do tampão e a injeção do analito em diferentes ciclos. O primeiro ciclo é a preparação de cavacos e carregamento de níquel. Certifique-se de que o fluxo e os caminhos estejam definidos e, em seguida, injete 350 milimolares de EDTA por um minuto para lavar as moléculas restantes.

Em seguida, defina o fluxo para 10 microlitros por minuto. Em seguida, injete cloreto de níquel 0,5 milimolar por dois minutos. Agora a resina do chip é revestida por íons de níquel.

O ciclo dois é a imobilização do ligante. Defina o fluxo para 15 microlitros por minuto e defina o caminho do fluxo para a célula de fluxo. Número dois, injete o ligante A até atingir a unidade de resposta ou os valores de R ru que são 10 a 20 vezes o peso molecular do ligante.

Por exemplo, carregue um ligante de 50 kilodaltons entre 501.000 rus. Manter um registo do valor de EF alcançado. Em seguida, defina o fluxo para 15 microlitros por minuto e o caminho do fluxo para a célula de fluxo número um, injete o ligante de controle B até o mesmo valor RU que o do ligante a monitorar a subtração, sensori Graham online para ajudar a controlar o comprimento da injeção.

Em seguida, defina o fluxo para 50 microlitros por minuto e o caminho do fluxo para a célula de fluxo número um e a célula de fluxo. Número dois, prossiga para lavar o sistema por cinco a 20 minutos até que a linha de base se estabilize. O ciclo três é a injeção em branco.

Esta injeção servirá para subtração em branco. Portanto, inclua todos os componentes que serão injetados com o analito, exceto o próprio analito. A duração da injeção pode variar dependendo do tempo que leva para atingir o equilíbrio.

Defina o fluxo para 15 microlitros por minuto e defina o caminho do fluxo para a célula de fluxo número um e a célula de fluxo número dois e a célula de fluxo número um, subtraída da célula de fluxo. Número dois, insira o comando de peso por 30 segundos para obter uma linha de base estável. Em seguida, injete o buffer de execução por 13 segundos.

Aguarde de 120 a 600 segundos para registrar a fase de dissociação. A duração desta etapa varia de acordo com o kd. Quanto mais lenta a dissociação, mais longa essa etapa precisa ser.

O ciclo quatro é a injeção de analitos. Copie e cole as condições exatas usadas no ciclo três para que essas duas injeções possam ser subtraídas posteriormente. Altere a localização do slot no rack daquele que contém a solução de controle para um que contém a solução de analito.

Escolha uma concentração ligeiramente acima da constante de dissociação de equilíbrio esperada. Se nenhum conhecimento prévio estiver disponível, escolha um micromolar como um bom ponto de partida. Depois de realizar a injeção de tampão e a injeção de analito uma segunda vez, execute o ciclo sete de desarme de cavacos.

Defina o fluxo para 50 microlitros por minuto e, em seguida, injete 350 mili molar EDTA por um minuto. Repita esta etapa mais duas vezes. Não use uma única injeção de três minutos, pois isso pode danificar o chip.

Em seguida, injete 0,25% de sulfato de dcal de sódio por um minuto. Repita esta etapa duas vezes. Não use uma única injeção de três minutos, pois isso pode danificar o cavaco após o carregamento de níquel, o transportador de interesse é imobilizado na célula de fluxo número dois até 3.500 R rus.

Em seguida, usando o mesmo fluxo e duração da injeção, o ligante de controle é injetado na célula de fluxo número um, atingindo inicialmente apenas até 3000 R para garantir que quantidades semelhantes de proteína sejam imobilizadas em ambas as células de fluxo. O ligante de controle é ainda carregado com injeção mais curta enquanto monitora a carga de até 3.500 RDUs. A forma de escada representa o aumento gradual da massa na célula de fluxo número um em cada injeção mostrada aqui é a célula de fluxo número um, subtraída da célula de fluxo.

Número dois, é importante variar a duração da injeção de ligantes para obter uma carga igual. Em contraste, a duração da injeção do analito deve ser mantida constante para todas as concentrações usadas para obter dados quantitativos. Uma faixa de concentrações de analito é injetada.

Aqui são mostradas injeções de diferentes concentrações de analito com um comprimento de injeção constante. As diferentes concentrações do analito são injetadas por ordem aleatória e os gramas sensoriais duplos em branco são alinhados com o eixo x antes da análise para derivar a afinidade e a constante de taxa. Um ajuste de modelo é aplicado.

A constante de dissociação de equilíbrio calculada para a interação mod BCA é aproximadamente três vezes 10 elevado a menos seis molares com um KA moderadamente rápido e KD rápido Uma vez dominado. Essa técnica pode ser feita dentro de algumas horas depois de assistir a este vídeo. Você deve ter uma boa compreensão de como projetar e realizar um experimento de SPR usando sua proteína de interesse.