Confocal Time Lapse de imagem como um método eficiente para a Avaliação citocompatibilidade of Dental Composites

O objetivo geral deste procedimento é usar microscopia confocal de varredura a laser 3D para imagens de lapso de tempo para avaliar qualitativa e quantitativamente a biocompatibilidade in vitro de compósitos dentários. Isso é feito primeiro coletando amostras esféricas de compósito dentário não curado na segunda etapa. Os fibroblastos gengivais humanos são cultivados na presença ou ausência desses extratos compostos e, em seguida, as células são marcadas com coloração de mortos-vivos.

As imagens do mapa são então geradas das culturas de células e as imagens de sobreposição são criadas para as áreas de interesse. Em última análise, as diferenças em tempo real no comportamento celular que ocorrem na presença ou ausência dos compósitos testados podem ser monitoradas de acordo com as mudanças nos sinais fluorescentes verdes ou vermelhos observados nas imagens. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes são que ela permite o monitoramento em tempo real de células vivas sem induzir alterações na estrutura celular.

Nenhuma etapa de fixação ou secagem é necessária após a coloração celular ou antes da observação do lapso de tempo. Para preparar o extrato composto, comece usando um suporte sob medida com um raio de dois milímetros para formar amostras esféricas do compósito dentário não curado. Transfira as amostras para poços individuais de uma placa de seis poços contendo um mililitro de meio de cultura, tomando cuidado para deixar alguns poços com meio apenas para culturas de células de controle e, em seguida, organize uma lâmpada LED com uma intensidade quadrada de centímetro de 1070 miliwatts dentro de 0,5 milímetros das amostras.

Curou as amostras por 40 segundos para simular o contato temporário entre os dentes e o composto dentário não cuidado e, em seguida, incubou as amostras compostas por 24 horas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Troque o meio a cada três dias e as células de passagem a cada cinco dias. Então, depois que a cultura atingir a cofluência, colha as células e gire-as por cinco minutos a 90 vezes G e a 37 graus Celsius.

Ressuspenda o pellet em meio de cultura e, depois de contar as células, semeie a suspensão celular a uma densidade celular de 2,5 vezes 10 elevado a quatro células por mililitro em um sistema de lâminas de câmara durante a noite a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, substitua o meio em dois poços da lâmina da câmara por um mililitro dos extratos compostos testados e coloque a lâmina de volta na incubadora para obter imagens das células por confocal. Imagem com lapso de tempo.

Primeiro rotule as células compostas de co-cultura e controle com coloração de citotoxicidade de mortos-vivos para células eucarióticas de acordo com as instruções do fabricante. 15 minutos após a coloração, coloque a lâmina da câmara no escuro na câmara confocal integrada sob condições de cultura de células e aqueça os lasers de 473 nanômetros e 559 nanômetros. Em seguida, use um detector com um espectro recém-desenvolvido para definir automaticamente as condições de imagem para o laser de 473 nanômetros.

Use as funções de enquadramento e zoom para selecionar a área de interesse e, em seguida, escolha o modo de observação. Selecione até cinco tipos de modos de observação, incluindo Zack de lapso de tempo e área múltipla conforme necessário e, em seguida, capture rapidamente cinco imagens de mapa com um laser de 473 nanômetros sob a objetiva de 10 x para a amostra de teste e as células de controle quando as imagens desejadas forem adquiridas. Mude para o laser de 559 nanômetros e capture imagens da célula na segunda fluorescente, como acabamos de demonstrar.

Como alternativa, sobreponha as imagens fluorescentes e de contraste de luz usando o ponto selecionado na tela ao vivo do X 60 para observar o armazenamento de imagens ao vivo. As imagens do mapa no formato de imagem Olympus para análise de sinal e as imagens de projeção máxima são de 24 bits por pixel. Os arquivos TIFF usam as diferentes ferramentas de análise para medir o perfil de intensidade do sinal e a relação de intensidade entre os dois canais fluorescentes.

Por fim, analise as diferenças na sinalização de células fluorescentes entre os dois grupos com o software apropriado. Nessas imagens de mapa de células vivas da coloração TED em meio isolado ou exposto a extrato composto, não foram observadas diferenças na viabilidade das células 15 minutos após o período de lapso de tempo. Aqui, as imagens de projeção máxima das células de controle mostram o destino ampliado das células nos primeiros 15 minutos e cinco horas depois, no final do período de lapso de tempo, conforme observado, não houve variação significativa na fluorescência dentro das células de controle durante o período de incubação.

As células expostas ao ELS de encolhimento extra baixo assumiram uma morfologia de fuso semelhante às células de controle, mas exibiram uma ligeira diminuição no sinal fluorescente verde e um ligeiro aumento na fluorescência vermelha no final do período de lapso de tempo. O perfil de intensidade das células coradas é ilustrado nesses gráficos, nos quais as intensidades de emissão de fluorescência do homodímero de endotélio de cálcio foram medidas em células expostas de controle e compostas em intervalos de uma hora por até cinco horas. Não foram observadas diferenças significativas na sinalização entre as duas culturas.

As taxas de viabilidade para as células de controle e compostas expostas são mostradas na tabela. Na presença do compósito testado, verificou-se que a porcentagem de células vivas diminuiu ligeiramente de 100 para 93,9% após uma hora de contato após cinco horas. Diferenças significativas na viabilidade celular foram observadas entre o ELS composto testado, retração extra baixa e as culturas de células de controle negativo, apesar da não citotoxicidade do compósito.

Os dados atuais destacam o uso da imagem confocal com lapso de tempo como um método preciso e sensível para avaliar o comportamento dos fibroblastos genéticos em contato com compósitos dentários após seu desenvolvimento. Este método é uma forma privada para pesquisadores no campo da toxicologia explorarem a citotoxicidade e a avaliação de risco de materiais odontológicos, medicamentos, substâncias químicas e outros dispositivos médicos.