Name: Confocal Time Lapse de imagem como um método eficiente para a Avaliação citocompatibilidade of Dental Composites (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a avaliar a citocompatibilidade de compósitos dentários usando microscopia confocal 3D em time-lapse com fibroblastos gengivais humanos. Este método permite monitorar em tempo real o comportamento celular sem alterar a estrutura.

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Saremco Dental Switzerland e Olympus Microsystems France As empresas são gratas por seu apoio financeiro. A Saremco Dental também é reconhecida pela generosa doação dos compósitos dentários ELS extra low shrinkage. Os autores também desejam expressar sua gratidão ao Dr. Simon Banks, do departamento de Química (University College London), por sua ajuda na revisão do inglês.

O protocolo consiste em três etapas principais: o primeiro passo compreende a preparação de extracto de compósito em meios de cultura; a segunda diz respeito a Primary fibroblastos humanos gengivais (HGF) de cultura de células, o contato de células com os extratos compostos e coloração de células; a terceira etapa consiste de imagem confocal e análise de sinal fluorescente. Para tecidos gengivais tomar, o protocolo foi aprovado em conformidade com a legislação francesa, o consentimento informado eo comitê de ética local. 1. Composite Extratos Preparação Use meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) como meio de eluição. Assegure-se que a relação entre a área de superfície das amostras e o volume de meio de extracção é no nível mais baixo dos requisitos ISO 10993/12. O procedimento é descrito recentemente 11 e descritas resumidamente a seguir: <ol><li> Formar amostras esféricas do compósito dental não curado usando um porão sob medidaer. O tamanho titular é de 2 mm de raio, que está de acordo com a profundidade de cura geralmente recomendado no tratamento clínico oral. </li><li> Prepare-se poços de placas, cada uma contendo 1 ml de meio de cultura (DMEM), com uma mistura de 5% de penicilina / estreptomicina e 1% de anfotericina mas sem soro bovino fetal (FBS). </li><li> Amostras de cura dentro do meio DMEM contendo bem usando uma lâmpada de luz LED com um 1.070 mW cm -2 intensidade (λ = 465-475 nm) por 40 segundos. Assegure-se que a distância entre a ponta e as amostras de cura está na gama de 0,5 mm. Utilize este modo de cura para simular o contato temporário entre o dente eo compósito dental não curado. Em situação clínica, o contacto ocorre quando o compósito restaurador é colocada na cavidade oral. </li><li> Incubar as amostras (compósitos espécimes em meio DMEM) a 37 ° C sob atmosfera humidificada de 5% de CO 2 no ar. Incubar meio DMEM (sem amostras compostas) para células de controlo nas mesmas condições. </li></ol> 2. HGF Cultura de Células, Composite Extratos Testes e células marcadas <ol><li> O crescimento e manutenção de culturas de células Isolar fibroblastos gengivais humanos saudáveis ​​de biópsias de tecido gengival de pacientes tomadas durante extrações ortodônticas de rotina. <ol><li> Cultivar fibroblastos gengivais humanos em DMEM em presença de 10% de FBS, 5% de Penicilina / Estreptomicina e 1% de anfotericina B. Manter as células a 37 ° C na incubadora sob uma atmosfera humidificada de 5% de CO 2 no ar. </li><li> Médias trocado a cada 3 dias, e de passagem células a cada cinco dias. Depois de atingir a confluência, as células de colheita por tripsinização. </li><li> Centrifugar células a 90 xg durante 5 minutos e re-suspendê-las no meio de cultura. Contagem de células com um contador de células cetro de mão automático. </li><li> Suspensão de células de semente a uma densidade celular de 2,5 x 10 4 células / ml em um sistema de câmara de corrediça. Permitir que a incubação das células durante a noite a 37 ° C numa atmosfera de 5%. </li></ol></li><li> A adição de extractos de compostos para as células em cultura <ol><li> Substitua o material de dois poços da lâmina câmara por 1 ml dos extratos compostos testados (após 24 horas de incubação). </li><li> Manter as duas restantes poços de controlo (células) nas mesmas condições. </li><li> Incubar a lâmina câmara que contém os quatro poços a 37 ° C na incubadora, sob uma atmosfera humidificada de 5% de CO 2 no ar. </li></ol></li><li> Coloração fluorescente Use o Vivo mancha / citotoxicidade Morto por células eucarióticas de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: o kit fornece um teste de fluorescência rápida de duas cores para determinar a viabilidade de células em uma população com base na integridade da membrana plasmática e atividade esterase. A mancha distinguir vivo a partir de células danificadas por marcação simultaneamente com verde-fluorescente de Calceina-AM para indicar a actividade de esterase intracelular e vermelho fluorescentes homodímero de etídio-1 (EthD-1) para indicar a perda de Membrane integridade. <ol><li> Preparar uma solução de trabalho dos dois reagentes mancha contendo 2 uM de Calceína AM e 4 uM EthD-1 (concentração final relatada como sendo adequados para a coloração de fibroblastos). Adicionar a mancha para as células aderentes cultivadas na presença ou na ausência dos extractos compostos seleccionados. </li><li> Observar diretamente e rapidamente as populações de células coradas no mínimo, 15 minutos após a coloração e através da imagem time-lapse. Não centrífuga e não fixe as células coradas. </li></ol></li></ol> 3. confocal Time Lapse Imagem e Análise de Sinais O sistema utilizado é equipado com um laser de diodo de quatro unidades e uma imagem multi-corados para até quatro corantes fluorescentes para cada espécime. O sistema pode realizar um mapeamento de imagem (ampliação de 10X), que dá uma visão geral da amostra de teste em que se pode mover-se para observar uma região de interesse (ampliação 600X). <ol><li> Time lapse imagem <ol><li> Coloque os specimens (o slide câmara contendo as amostras coradas) no quarto escuro da incubadora integrado confocal (37 ° C, 5% de CO 2 e atmosfera húmida). </li><li> Selecione os lasers correspondentes. Use as duas fontes de laser 473 nm (15 mW) e 559 nm (18 mW) para excitar Calcein e EthD-1. </li><li> Use um modo para dois seqüencial para adquirir imagens através de seqüências de linha sem interferência na imagem com os dois corantes fluorescentes usadas. </li><li> Usar um detector com um espectro recentemente desenvolvido para definir automaticamente as condições de acordo com o corante de fluorescência na unidade de digitalização. </li><li> Optimizar as larguras de banda de fluorescência detectada para cada canal para o máximo. Grave todas as aquisições sequencialmente para evitar potencial cross-talking. </li><li> Selecione as condições de imagem mais adequados com base na seleção corante fluorescente usando o software de aquisição. </li><li> Adquirir uma imagem do Mapa que é automaticamente criado a partir do centro em um padrão espiral,com a área de interesse a ser facilmente selecionados para uma análise mais aprofundada. </li><li> Selecione o modo de observação. Escolha até cinco tipos de modos de observação, incluindo time-lapse, Z-stack, e multi-área, conforme necessário. Use uma combinação de Z-stack e modos de lapso de tempo no presente estudo e concluir rapidamente a captura de imagem, </li><li> Mudar e mudar o corante fluorescente. Alternativamente, sobrepor a fluorescente e as imagens de contraste de luz com o outro. Observar imagens ao vivo usando o ponto selecionado na tela mapa da esquerda inferior. </li><li> Determine a área de imagem, utilizando o enquadramento e as funções de zoom. Opcionalmente, alternar entre as telas para cada tipo de corante fluorescente. NOTA: O microscópio utilizado neste protocolo tem a mesma funcionalidade que um alto confocal convencional em um design compacto. O microscópio é equipado com objetivos de imersão em água invertidos que são perfeitamente adaptados para estável de imagem time-lapse de células vivas com uma incubadora de built-in simplificado. </lEu&gt; </ol></li><li> Análise de sinais e quantificação <ol><li> Use o software de imagem para quantificar o sinal de fluorescência. Obter cinco imagens de mapas com o objetivo 10X tanto para controle de amostra e de células testadas. </li><li> Obtido 1024 × 1024 pixels imagens regulares, com um tamanho de 0,231 mm × 0,231 pixels? M. Armazenar imagens no formato Olympus Imagem (OIF) para a análise de sinais. Este formato permite armazenar vários ajustes de parâmetros e imagens juntos. Use diferentes ferramentas de análise (medição do perfil de intensidade, relação de intensidade entre os dois canais utilizados). </li><li> Armazene as imagens de projeção máximas como arquivos TIFF de 12 bits / pixel. </li><li> Preformas análises estatísticas utilizando o software R comandante. Analisar as diferenças por meio de análise unidirecional de variância (ANOVA) com um teste de repetição. Relate os resultados como média desvio padrão (± DP) e significância estatística de p &lt;0,05. </li></ol></li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes, não têm nada a divulgar.

Comportamento do material biocompatibilidade é o parâmetro mais pré-requisito para ser avaliado antes de uso médico. As normas internacionais cobrir dispositivos médicos ISO 10993 33 e, especificamente, materiais dentários ISO 7405 34. A ausência de efeitos tóxicos para as células vizinhas é a norma fundamental na avaliação da biocompatibilidade desses materiais. É por isso que a análise da citotoxicidade tem tanta importância na avaliação de material odontológico biocompatibilidade 35-37. A ISO sugeriu métodos de ensaio pode ser baseada em atividade metabólica ou a integridade da membrana. Terminais seleccionados devem seguir as condições específicas para a classificação de efeitos adversos induzidos por um material de teste, a fim de minimizar o tempo e o custo dos ensaios de avaliação. O método atual de investigação (3D tempo confocal lapso de imagem) é a integridade da membrana baseado. A avaliação da citotoxicidade através deste parâmetro parece ser um marcador válido para biocompa celulartibilidade com materiais testados e é também ISO aprovado endpoint. Testes in vitro são projetados para determinar como uma amostra de material afeta um tipo particular de célula. O ensaio colorimétrico MTT foi originalmente descrito por Mossman (1983) como um método útil para a medição da citotoxicidade in vitro e a proliferação celular. O ensaio MTT baseia-se na conversão do sal de tetrazólio em cristais de formazano por células activas, que determina a actividade mitocondrial. Isso pode ser traduzido por taxa de viabilidade 38. Gupta e colaboradores relataram que o teste MTT é o método mais amplamente utilizado para medir a citotoxicidade das resinas compostas. Succínico desidrogenase e respostas de fosfatase alcalina também têm sido utilizados para o mesmo fim 39. No entanto, as células de destino não pode ser seguido para cima, uma vez que o ensaio MTT requer matando as células em cada ponto de tempo de medição. A fim de acompanhar mais de perto o comportamento das células coradas no estudo atual, diobservação rect de células vivas foi realizado, graças ao tempo de imagem lapso MCVL combinado com uma pequena mancha de protocolo, análise de imagem automatizada e quantificação sinal fluorescente. Compósitos odontológicos vêm em estreito contacto com os tecidos orais, especialmente células gengivais e pulpares. Fibroblastos seria o alvo dos componentes liberados a partir destes compósitos restauradores 40-41. Além disso, vários estudos têm relatado que as células imortalizadas e células primárias podem ter diferentes respostas celulares em contato com biomateriais. As células primárias foram encontrados para ser mais apropriado para avaliar os efeitos biomateriais 42. Isto explica o uso de células de fibroblastos gengivais humanos primários como modelo para a avaliação da citotoxicidade celular do compósito dentário testado no presente estudo. O potencial de toxicidade das substâncias liberadas de compósito dental tem sido amplamente estudada 43-44. A fim de avaliar tele potencial citotóxico de materiais, duas células modelo de contacto pode ser realizado. No sistema modelo de contacto directo do material é directamente colocado com células-alvo, enquanto no sistema de contacto indirecto, as células alvo estão em contacto com elui a partir de meios biológicos. Em aplicações clínicas e de procedimentos restauradores, composto dental são colocados em contato indireto com os tecidos gengivais. Por este motivo, o protocolo experimental corrente foi focada no sistema de contacto indirecto com fibroblastos gengivais humanos (células na presença dos compostos testados extractos). Como relatado anteriormente por Dahl e colaboradores, as respostas de citotoxicidade foram classificados como graves (&lt;30%), moderado (30-60%), ligeiro (60-90%) ou não-citotóxico (&gt; 90%) com base na actividade relativa aos Os valores obtidos para os controles 45. Portanto, de acordo com este ranking, e à luz dos resultados obtidos (Tabela 1), composto ELS extra baixa retração poderia ser classificado como very ligeiramente citotóxico e apresentaram comportamento comparável às células de controlo durante todo o período do lapso de tempo. Usando o mesmo método de investigação precisamente, os resultados deste estudo podem ser comparados com os de um estudo recentemente publicado. O ELS adicional composta baixo encolhimento demonstraram biocompatibilidade superior em comparação com os dois compostos testados previamente utilizados para a mesma aplicação clínica, que é a restauração direta 11. Mais estudos ainda são necessários para estabelecer a comparação mais completa. Ao decidir qual ensaio de citotoxicidade para aprovar uma avaliação terminal específico, é importante entender as vantagens e as limitações de cada ensaio. A principal finalidade da imagem confocal é alcançar uma arquitectura 3-D de células e órgãos. A técnica é capaz de revelar não só a superfície de um espécime, mas também a sua subsuperficial. O protocolo aqui descrito sublinha a utilização de MCVL 3D lapso de tempo de imagiologia confocal, como um sensitiva método para avaliar o comportamento de biocompatibilidade in vitro de um compósito dentário. No entanto, a fim de evitar as limitações encontradas neste trabalho, estações de trabalho de anti-vibração podia ser utilizado, a fim de permitir mais estável e mais longo lapso de tempo de imagem; o tampo da mesa pode isolar o sistema confocal usado contra os efeitos prejudiciais que as vibrações no laboratório pode causar. Além disso, os materiais a serem utilizados na cavidade oral, devem, idealmente, ser inofensivo para os tecidos gengivais e não deve conter substâncias que poderiam causar toxicidade sistémica. Em conformidade com a metodologia utilizada e os resultados obtidos a partir do estudo de corrente pode concluir-se que o composto testado (ELS extra de baixo encolhimento) não é citotóxico nas presentes condições experimentais. Como o método CLSM pode dar sensivelmente a taxa inicial de células viáveis, outras possibilidades poderia ser prevista para avaliar mais pontos finais. Em particular, como tem sido relatado recentemente que os monómeros compostos afectam células thrOugh espécies reativas de oxigênio (ROS) 46- 48, é necessária uma investigação mais aprofundada para avaliar se algum correlações entre a citotoxicidade sinalização redes e produção de ROS. O protocolo de futuro poderia ser projetado para avaliar simultaneamente a produção de ROS (H 2 O 2 e / ou O 2 - coloração) e taxa de citotoxicidade (coloração Live / morto) usando lapso de tempo MCVL imagem.

Uma das principais normas citadas nas recomendações ISO para definir biocompatibilidade é a ausência de material de toxicidade para as células. À base de resina compósitos odontológicos podem liberar componentes da matriz resinosa, que poderia ser inicialmente devido a polimerização parcial, e / ou mais tarde devido a processos de degradação ao longo do tempo 1-4. Esses componentes liberados entrar em contacto com os tecidos orais e pode ter vários inconvenientes, como urticária e reações da mucosa 5, o desenvolvimento de alergias e reacções de hipersensibilidade em pacientes 6, modificações de fibroblastos gengivais morfologia e redução de colágeno tipo I de proteína 7, imunossupressão ou imunoestimulação em mitógeno -driven proliferação de linfócitos T purificados e células do baço 8 e danos no DNA de fibroblastos gengivais humanos primários, o que sublinha o seu potencial genotóxico 9. Muitos parâmetros podem afetar a toxicidade composta dental, como a sombra da composite, a cura pela luz, a composição química do monómero de resina, o material de enchimento e do grau de conversão de 10- 13. Desde in vitro potencial tóxico de materiais pode prever em situações in vivo e poderia ser comparado a situações clínicas pelo estudo de alguns parâmetros pertinentes. A citotoxicidade dos compósitos e os seus componentes foram amplamente avaliados utilizando sistemas de cultura de células 14- 16. Estes sistemas in vitro têm sido desenvolvidos para avaliar a biocompatibilidade de compósitos dentários em termos de: o crescimento celular e a apoptose de células THP-1monocytes utilizando como células 17, citotoxicidade em fibroblastos gengivais humanos 18, potencial inflamatório em queratinócitos HaCaT 2, como as células da funcionalidade das células odontoblast- como MDPC-23 células 19, redução dos níveis de RNA total, e aumento significativo na indução de apoptose em gengival humano queratinócitos 20 eDanos no DNA em fibroblastos gengivais e polpa células 21. Diferentes metodologias são sugeridas para investigar a biocompatibilidade dos compósitos odontológicos. Ensaios colorimétricos, que envolvem corantes específicos e medidas de adsorção de luz, continuam a ser o mais utilizado, devido à sua relativa simplicidade e baixo custo de 22 a 26. Análise de microscopia por contraste de luz com frequência consome mais tempo e incorre em custos mais elevados. No entanto, estas técnicas de microscopia tem algumas vantagens importantes. A observação da estrutura celular dá informações estendidas sobre efeitos tóxicos experientes, fornecendo assim dados mais relevantes e sensíveis. Em particular, a introdução de microscopia confocal 27 permitiu a observação de estruturas biológicas com a melhoria da resolução axial em relação a todo o campo microscópios de fluorescência imagiologia tradicionais. Assim, imagem confocal tornou-se um poderoso instrumento de investigação em diferentes áreas depesquisas médicas e científicas. Em contraste com as técnicas de microscopia electrónica, microscopia confocal de varrimento oferece a capacidade de visualizar os componentes distintos de células por incorporação de marcadores fluorescentes específicos. A maioria destes marcadores específicos são estáveis ​​em um ambiente aquoso, de forma sensata mensurável, barato e não tóxico 28, permitindo a sua utilização em clínica, bem como estudos de investigação de laboratório. Além disso, a secagem e a fixação da amostra necessária para a análise de microscopia electrónica convencional, não é necessário para lapso de tempo de imagiologia confocal, aquisição, assim, dependente do tempo, também é possível em amostras. Em comparação com a imagem bidimensional, o princípio de imagem confocal permite uma visualização exemplar do subsolo e reconstrução da estrutura tridimensional das diferentes imagens de profundidade obtidos; detalhes que resultam em, mais precisos e mais estruturais 29, 30. O estudo de vídeo atual é um exemplo do uso de tridimensional Time-Lapse Confocal Laser Scanning Microscopy (3D-MCVL) combinado com uma rotulagem Vivo / Dead fluorescente e quantificação de sinais como um método inovador. A técnica apresentada neste trabalho tem a vantagem de permitir a avaliação e time-lapse de imagens sensíveis de células vivas, sem alterar a estrutura celular avaliado. Não há etapas de preparação são necessários antes da análise confocal. Anteriormente, a mesma coloração foi utilizada para avaliar a viabilidade da cultura núcleos de osso esponjoso 31, mas sem confocal time-lapse seguinte. Da mesma forma o mesmo procedimento de lapso de tempo confocal foi utilizado para avaliar a eritromicina atividade tempo de morte em bactérias de lodo ativado de acordo com o seu tipo Gram 32 usando uma bactéria específicos Viva / coloração mortos. Estes métodos foram recentemente adaptado e utilizado para comparar a toxicidade de compósitos dentários baseados em monómeros de metacrilato de 11.

<table><tbody><tr><td>Olympus Fluoview FV10i&nbsp;</td><td>Microscópio Confocal</td> <td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>O2/CO2 Incubadora</td><td>Pnasonic</td><td>MCO 5M</td> Kit <td>de Incubação de Células</td></tr><tr><td>Vivas/Mortas</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>MP 03224</td><td>Mancha&nbsp;</td></tr><tr><td>Encolhimento extra baixo do ELS &nbsp;</td><td>Saremco&nbsp;</td><td></td><td>Composto dentário</td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Sigma</td><td>D 6046</td><td>Meio de cultura</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td>harvesting cells</td></tr><tr><td>chamber slide system&nbsp; &nbsp;</td><td>PAA</td><td>14220040X</td><td>Câmara de cultura</td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina&nbsp;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>PAA</td><td>P11-001</td><td>Cultura celular</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino&nbsp;</td><td>PAA</td><td>A11-101</td><td>Contador de Células de Cultura</td></tr><tr><td>de Células</td><td>Merck Millipore</td><td>00110230TP1</td><td>Contagem de células&nbsp;</td></tr></tbody></table>

confocal time lapse de imagem como um método eficiente para a avaliação citocompatibilidade of dental composites

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

Aceita-se geralmente que a interacção no material celular in vitro é um critério útil na avaliação da biocompatibilidade de material dentário. O objetivo deste estudo foi utilizar MCVL 3D lapso de tempo confocal de imagem para avaliar a biocompatibilidade in vitro de compósitos odontológicos. Este método fornece uma indicação precisa e sensível da taxa de células viáveis ​​em contacto com extractos de compósitos dentários. O ELS extra baixa retração, um compósito odontológico usado para restauração direta, tem sido tomado como exemplo. Avaliação in vitro foi realizado em células humanas em cultura primária de fibroblastos gengivais usando coloração Live / Morto. As imagens foram obtidas com o sistema biológico FV10i confocal invertido e analisados ​​com o software 3.1 FV10-ASW. A análise da imagem mostrou uma citotoxicidade muito ligeira na presença do composto testado depois de 5 horas de tempo decorrido. Uma ligeira diminuição da viabilidade celular foi mostrado em contacto com o composto testado extractos compared com células de controlo. As descobertas destacou o uso de MCVL 3D lapso de tempo de imagem como um método sensível para avaliar qualitativa e quantitativamente o comportamento biocompatibilidade dos compósitos odontológicos.

Figura 1 mostrou uma visão geral das células coradas vivo / morto em imagens de mapeamento obtidos (objetiva de 10x), tanto para o controle e as células expostas aos extratos compostos testados (ELS extra baixa encolhimento). A estrutura das células tridimensional pode ser visualizado na ampliação 600X. A visualização das células recolhidas na câmara de controlo e de células recolhidas na câmara na presença dos extractos compostos testados é apresentado na Figura 2. A projecção máxima (60x objectivo) mostra o destino de populações de células seleccionadas no início do lapso de tempo (15 min) e no fim do período de tempo decorrido (em 5 h). Cinqüenta e sete pilhas de imagens (xyzt varredura mod, 39 imagens por pilhas, voxel de profundidade 1,00 mm) foram obtidos durante este período. Uma ligeira diminuição do sinal de fluorescência verde e muito ligeira variação na fluorescência vermelha foram obtidas nas células expostas. Não foi observada variação significativa para o controlecélulas. Células extratos expostos Composite assumiu morfologia do fuso semelhante para controlar as células; morfologia não foi alterada nestas condições experimentais (não obstante o decréscimo do sinal verde e o aumento de sinal vermelho, na presença do composto testado). A análise de imagem foi realizada em cinco pilhas de imagens diferentes seleccionados correspondentes às diferentes populações de células a partir das imagens obtidas para o composto testado, em comparação com células de controlo negativo, tanto para o sinal vermelho e verde. O perfil de intensidade de células coradas é ilustrada na Figura 3; a evolução do sinal verde e vermelho das células em contacto com o composto testado foi comparável à das células de controlo. Calceína e EthD-1 intensidades de emissão de fluorescência foram medidos em células de controlo e nas células expostas compostas. A medição foi feita em intervalos de uma hora durante até cinco horas. A relação de verde / vermelho de fluorescência (baseado em intensidades integradas do verde 495-515 nm e 620-650 nm sinais vermelhos) Foi calculada durante o período de time-lapse. Os rácios de viabilidade para controlo e células expostas a ELS extractos extra de baixo encolhimento são apresentados na T abela 1. Na presença do composto testado, a percentagem de células vivas foi encontrada para diminuir ligeiramente a partir de 100% para 93,9% depois de 1 hora contato. Foi observada diferença significativa entre o composto testado e controle negativo (células sem quaisquer extratos compósitos) após 5 horas do período de lapso de tempo indicado. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg"> Figura 1: Visão geral de mapeamento de imagem mostraram células na objectiva 10X, (A) células de controlo e células (B) corado na presença de extractos compósitos (ELS extra de baixo encolhimento) no início do período do lapso de tempo (t = 15 min). As áreas verdes são células vivas e áreas vermelhas são as células danificadas. Nestecondições do experimento, não houve variação (tanto para a fluorescência verde e vermelho) foi observada para compósitos expostos células em comparação com células de controlo negativo. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg"> Figura 2: as imagens CLSM na objectiva 60X de uma população de células a partir de (A) e da câmara de controlo (B) extractos de compósitos câmara no início e no fim do período de exposição de lapso de tempo (I: 15 min e II: 5 h, respectivamente ). As áreas verdes são células vivas e áreas vermelhas são as células danificadas. O painel das imagens demonstrou ligeira mudança no sinal de intensidade (ligeira diminuição no sinal verde e muito ligeiro aumento no vermelho). Não há alterações na morfologia celular foram observados na presença dos extratos de compósitos; expor as células mantiveram a sua morfologia em forma de fuso e de fibroblastos como células de controlo. Figura 3: Perfil de linha de células observadas em microscopia de lapso de tempo de células (A) Controlo (B) extractos de células compostas expostas, (I) em 15 min e (II) em 5 h.. Nenhuma variação visível na evolução do sinal verde na presença de composto testado independentemente do tempo de contato. No entanto, foi observado ligeiro aumento do sinal vermelho na presença de compósito após 5 hr de contacto. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Tempo de contato (horas) </td><td colspan="5"> Viabilidade celular (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> As células de controlo </td><td> 100 </td><td> 100 </td><td> 100 &lt;/ Td&gt; </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> ELS extra de baixo encolhimento ® </td><td> 93,9 ± 7 </td><td> 91,3 ± 5 * </td><td> 89,5 ± 3 * </td><td> 87,6 ± 2 * </td><td> 87,7 ± 3 * </td></tr></tbody></table> Tabela 1:. Taxa de HGF vivo evolução células após 1, 2, 3, 4 e 5 hr de contacto com extractos compósitos A viabilidade celular foi ensaiada através de coloração utilizando o kit de citotoxicidade Live / Morto. Os dados mostram valores médios ± DP de cinco imagens empilha análise. Os valores são significativamente diferentes das células de controlo a p &lt;0,05.

O aspecto mais estudado da biocompatibilidade dos compósitos é sua citotoxicidade MCVL 3D de imagens de lapso de tempo combinado com quantificação sinal fluorescente permite uma avaliação sensível do destino das células ao longo do tempo. Utilizando este método pode ser uma ferramenta eficiente para avaliar a citocompatibilidade de compósitos odontológicos.

Confocal Time Lapse de imagem como um método eficiente para a Avaliação citocompatibilidade of Dental Composites

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

O objetivo geral deste procedimento é usar microscopia confocal de varredura a laser 3D para imagens de lapso de tempo para avaliar qualitativa e quantitativamente a biocompatibilidade in vitro de compósitos dentários. Isso é feito primeiro coletando amostras esféricas de compósito dentário não curado na segunda etapa. Os fibroblastos gengivais humanos são cultivados na presença ou ausência desses extratos compostos e, em seguida, as células são marcadas com coloração de mortos-vivos.As imagens do mapa são então geradas das culturas de células e as imagens de sobreposição são criadas para as áreas de interesse. Em última análise, as diferenças em tempo real no comportamento celular que ocorrem na presença ou ausência dos compósitos testados podem ser monitoradas de acordo com as mudanças nos sinais fluorescentes verdes ou vermelhos observados nas imagens. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes são que ela permite o monitoramento em tempo real de células vivas sem induzir alterações na estrutura celular.Nenhuma etapa de fixação ou secagem é necessária após a coloração celular ou antes da observação do lapso de tempo. Para preparar o extrato composto, comece usando um suporte sob medida com um raio de dois milímetros para formar amostras esféricas do compósito dentário não curado. Transfira as amostras para poços individuais de uma placa de seis poços contendo um mililitro de meio de cultura, tomando cuidado para deixar alguns poços com meio apenas para culturas de células de controle e, em seguida, organize uma lâmpada LED com uma intensidade quadrada de centímetro de 1070 miliwatts dentro de 0,5 milímetros das amostras.Curou as amostras por 40 segundos para simular o contato temporário entre os dentes e o composto dentário não cuidado e, em seguida, incubou as amostras compostas por 24 horas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Troque o meio a cada três dias e as células de passagem a cada cinco dias. Então, depois que a cultura atingir a cofluência, colha as células e gire-as por cinco minutos a 90 vezes G e a 37 graus Celsius.Ressuspenda o pellet em meio de cultura e, depois de contar as células, semeie a suspensão celular a uma densidade celular de 2,5 vezes 10 elevado a quatro células por mililitro em um sistema de lâminas de câmara durante a noite a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono. Na manhã seguinte, substitua o meio em dois poços da lâmina da câmara por um mililitro dos extratos compostos testados e coloque a lâmina de volta na incubadora para obter imagens das células por confocal. Imagem com lapso de tempo.Primeiro rotule as células compostas de co-cultura e controle com coloração de citotoxicidade de mortos-vivos para células eucarióticas de acordo com as instruções do fabricante. 15 minutos após a coloração, coloque a lâmina da câmara no escuro na câmara confocal integrada sob condições de cultura de células e aqueça os lasers de 473 nanômetros e 559 nanômetros. Em seguida, use um detector com um espectro recém-desenvolvido para definir automaticamente as condições de imagem para o laser de 473 nanômetros.Use as funções de enquadramento e zoom para selecionar a área de interesse e, em seguida, escolha o modo de observação. Selecione até cinco tipos de modos de observação, incluindo Zack de lapso de tempo e área múltipla conforme necessário e, em seguida, capture rapidamente cinco imagens de mapa com um laser de 473 nanômetros sob a objetiva de 10 x para a amostra de teste e as células de controle quando as imagens desejadas forem adquiridas. Mude para o laser de 559 nanômetros e capture imagens da célula na segunda fluorescente, como acabamos de demonstrar.Como alternativa, sobreponha as imagens fluorescentes e de contraste de luz usando o ponto selecionado na tela ao vivo do X 60 para observar o armazenamento de imagens ao vivo. As imagens do mapa no formato de imagem Olympus para análise de sinal e as imagens de projeção máxima são de 24 bits por pixel. Os arquivos TIFF usam as diferentes ferramentas de análise para medir o perfil de intensidade do sinal e a relação de intensidade entre os dois canais fluorescentes.Por fim, analise as diferenças na sinalização de células fluorescentes entre os dois grupos com o software apropriado. Nessas imagens de mapa de células vivas da coloração TED em meio isolado ou exposto a extrato composto, não foram observadas diferenças na viabilidade das células 15 minutos após o período de lapso de tempo. Aqui, as imagens de projeção máxima das células de controle mostram o destino ampliado das células nos primeiros 15 minutos e cinco horas depois, no final do período de lapso de tempo, conforme observado, não houve variação significativa na fluorescência dentro das células de controle durante o período de incubação.As células expostas ao ELS de encolhimento extra baixo assumiram uma morfologia de fuso semelhante às células de controle, mas exibiram uma ligeira diminuição no sinal fluorescente verde e um ligeiro aumento na fluorescência vermelha no final do período de lapso de tempo. O perfil de intensidade das células coradas é ilustrado nesses gráficos, nos quais as intensidades de emissão de fluorescência do homodímero de endotélio de cálcio foram medidas em células expostas de controle e compostas em intervalos de uma hora por até cinco horas. Não foram observadas diferenças significativas na sinalização entre as duas culturas.As taxas de viabilidade para as células de controle e compostas expostas são mostradas na tabela. Na presença do compósito testado, verificou-se que a porcentagem de células vivas diminuiu ligeiramente de 100 para 93,9% após uma hora de contato após cinco horas. Diferenças significativas na viabilidade celular foram observadas entre o ELS composto testado, retração extra baixa e as culturas de células de controle negativo, apesar da não citotoxicidade do compósito.Os dados atuais destacam o uso da imagem confocal com lapso de tempo como um método preciso e sensível para avaliar o comportamento dos fibroblastos genéticos em contato com compósitos dentários após seu desenvolvimento. Este método é uma forma privada para pesquisadores no campo da toxicologia explorarem a citotoxicidade e a avaliação de risco de materiais odontológicos, medicamentos, substâncias químicas e outros dispositivos médicos.

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Research

JoVE Journal

Medicine

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