Name: RNA-Seq Análise de Gene Expression Diferencial em electroporados Pintainho Embryonic Medular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprenda a analisar expressão gênica diferencial por RNA-Seq em medulas espinais de embriões de pintainho eletroporados. Este protocolo demonstra dissecação, isolamento de RNA e sequenciamento para estudos de neurociência e biologia do desenvolvimento.

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CYIY é apoiado pela FAPESP (2012/14421-5) e FMV é apoiado por uma bolsa da FAPESP (2009/53695-0). Agradecemos ao DNA Technologies Core da Universidade da Califórnia, Davis, pela preparação e sequenciamento das bibliotecas de RNA-Seq usadas neste trabalho, à equipe Galaxy por fornecer uma interface excelente e gratuita para ferramentas de análise de dados de sequenciamento de alto rendimento e à Dra. Marianne Bronner por nos permitir filmar em seu espaço de laboratório.

1. electroporate do construto de interesse nos tubos neurais da HH12-13 frango embriões no ovo Usar um repórter fluorescente, de preferência, em uma transcrição bicistrï¿½ica ou fundido com a proteína de interesse com um péptido intercalante 2a viral 11, para permitir uma rápida identificação de indivíduos com níveis satisfatórios de transfecção. NOTA: O tempo de incubação típico para esta fase é de cerca de 48 horas a 37,8 ° C. <ol><li> Abrir uma pequena janela em que os ovos após a remoção de 3 ml de albumina com uma seringa acoplada a um 18 G x 1 1/2 agulha. Para melhorar a visualização do embrião, injetar uma pequena quantidade de tinta nanquim diluída 1:50 em solução de Ringer estéril sob o embrião 1-4. </li><li> Depois de cobrir o embrião com a solução estéril de Ringer, injectar uma solução de 10 mM Tris-HCl, pH 8,2 e 0,1% Corante Alimentar (F, D e C) contendo 2,5 mg / mL de ADN através da extremidade posterior do tubo neural, até que preenchaaté a região hindbrain. Para electroporate, eletrodos de platina posição (0,5 milímetros de diâmetro) separados por quatro milímetros ao longo de uma região do flanco e entregar cinco pulsos de 50 ms e 20 V com um intervalo de 100 ms entre eles 4. </li><li> Após eletroporação, incubar os embriões manipulados por 48 horas mais até atingirem estágio HH23 e identificar indivíduos com alto nível de transfecção na região flanco sob microscópio estereoscópico fluorescente. NOTA: A duração da incubação após a electroporação depende do objectivo da experiência. Os plasmídeos eletroporados pode gerar níveis de expressão significativa após 2 horas 2. Assim, se o interesse reside nos genes de início precoce do período de incubação pós-electroporação pode ser reduzida. </li></ol> 2. Colheita sucesso Transfected Embriões e dissecar as Metades Medula Espinhal electroporados NOTA: Este procedimento dura 2-3 horas para cada 10 embriões e rendimentos 1-2 Ug de RNA total por embrião. A dissecção de tubos neurais requer movimentos finos e algumas sessões de prática pode ser necessária antes de aplicá-lo a amostras experimentais. <ol><li> Descontaminar instrumentos de dissecação metálicas com solução de descontaminação de RNase ou por cozedura a 150 ° C durante 4 h 12 e preparar tratada com DEPC PBS. Use somente novo plasticware livre de RNase certificado. NOTA: Após a colheita, é importante seguir o tratamento padrão para evitar a contaminação RNase durante a dissecção. </li><li> Colher os embriões usando um par de tesouras de dissecação multa e uma colher coleção peneirada. Manter os embriões no frio tratada com DEPC PBS numa placa de Petri de 100 milímetros. </li><li> Com um par de pinças finas, cortar a região do flanco inteiro (entre o limite posterior do broto de membro anterior eo limite anterior do broto de membro posterior) e transfira esta seção para um novo prato contendo frio tratados com DEPC PBS. </li><li> Use duas agulhas de vidro finos para perfurar em três diferentesaponta em cada lado dorsolateral do embrião entre o tubo neural e da mesoderme paraxial. </li><li> Introduzir as duas agulhas de vidro na perfuração central e mover-se lentamente uma delas distância ao longo do tubo do eixo ântero-posterior neural. Repita esse procedimento para as perfurações que não foram alcançados pelos primeiros movimentos. Retire a mesoderme paraxial isolada com um par de pinças finas. </li><li> Ligue o embrião lateralmente, inserir as pontas das pinças entre o tubo neural e da notocorda e deslizá-los em sentidos opostos ao longo do eixo ântero-posterior para separar as duas estruturas. NOTA: Este também deve remover a maior parte da mesoderme ainda ligado ao tubo neural. </li><li> Se necessário, retire todos os pedaços maiores de tecido mesodérmica que permanecem ligados puxando com um par de pinças, enquanto levemente segurando o tubo neural com outro par de pinças. Quando terminar, gentilmente transferir o tubo neural para outro prato contendo frio tratados com DEPC PBS usando umLivre de RNase pipeta de Pasteur de vidro acoplado a uma bomba de pipeta manual e manter em gelo até que todos os tubos são dissecados. </li><li> Dividir os tubos neurais em duas metades. Para isso, insira a ponta afiada de um par de pinças fechado na luz e abrir a placa de telhado movendo a pinça para fora através dele. Após isso, separar as metades cortando a placa de piso com as pontas pinças. </li><li> Ordenar electroporadas a partir de metades não-electroporado sob um escopo de dissecação fluorescente e transferir para um tubo de 1,5 ml cheio com gelado tratada com DEPC PBS. Se necessário, os microtubos agite suavemente para libertar qualquer tecido ligado às paredes de plástico e para promover a sedimentação dos tubos. </li><li> Rotação a 100 xg por 3 segundos e remover muito lentamente, tanto PBS possível com uma micropipeta de 1 ml. Faça isso enquanto olha para uma fonte de luz que brilha através do microtubo para monitorar se qualquer material embrionário é sugado para a ponta da pipeta; se isso acontecer, lentamente descarregar e repita a centrifugação. </li><li> Adicionar 70 ml de solução de lise para extração de RNA por tubo neural metade e apertar o tubo para misturar o conteúdo. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min e vórtex vigorosamente. Repetir a 5 min de incubação e vórtex mais duas vezes. Armazenar a -80 ° C. </li><li> Recolher pelo menos oito metades do tubo neural por amostra para garantir um rendimento adequado para o passo seguinte. Piscina amostras menores se várias sessões de eletroporação / dissecação são obrigados a acumular número suficiente de tubos neurais. Armazenar amostras suficientes para duplicatas ou triplicatas para cada condição. </li></ol> 3. Purify RNA e Prepare Bibliotecas para Illumina Sequencing <ol><li> Retirar amostras de -80 ° C de armazenamento e colocar no gelo por 15-30 min. Retomar o descongelamento à temperatura ambiente até estar completa. </li><li> Vortex bem e deixe em temperatura ambiente por 5 min. Vortex e centrifuga-se novamente a 15000 xg durante 1 min para sedimentar o material insolúvel. </li><li> Transferir o sobrenadante para um novo tuboe proceder à extração de RNA de acordo com as instruções de isolamento de RNA total de manuais kit. Eluir no volume mínimo recomendado para aumentar a concentração. NOTA: tratamento DNase após clean-up é recomendado, a fim de evitar a contaminação potencial de sequências genômicas de DNA em RNA-Seq conjuntos de dados. </li><li> Flick o tubo para misturar o conteúdo e remover 5 mL para análise de controle de qualidade. Armazenar o restante amostra a -80 ° C até à preparação da biblioteca; estas amostras devem ser descongeladas apenas uma vez para evitar a degradação do RNA. </li><li> Executar RNA purificado em um instrumento Bioanalyzer usando o kit RNA 6000 Nano; RIN valor deve ser, pelo menos, acima de 7 para prosseguir. </li><li> Gerar bibliotecas usando um kit de preparação biblioteca RNA-Seq compatível Illumina e multiplexar até quatro bibliotecas em uma pista de um instrumento HiSeq definido para gerar 100 pb única lê. Se possível, inclua todas as amostras no mesmo prazo para minimizar potenciais artefatos técnicos. NOTA: Este deve produzir até 50 milhões de rEADS por exemplo, que é mais do que suficiente para obter cobertura para a maioria dos genes 13. </li></ol> 4. Compare os conjuntos de dados de RNA-Seq no Servidor Público Galaxy 10. NOTA: o espaço de armazenamento do servidor é limitado e experimentos comparando muitas amostras podem requerer a exclusão de arquivos intermediários gerados nas etapas de filtragem. <ol><li> Criar uma conta de usuário no servidor público Galaxy ( <a href="https://usegalaxy.org/">https://usegalaxy.org</a> ) e FTP upload dos conjuntos de dados Illumina em formato fastq. </li><li> Prepare os arquivos enviados com a ferramenta FastqGroomer 14 do NGS: menu de QC e manipulação; se os índices de qualidade já são codificados em Phred + 33 (Sanger), ignore esta etapa, simplesmente mudando o tipo de arquivo para fastqsanger sob os atributos para cada conjunto de dados. </li><li> Analisar a qualidade geral de cada conjunto de dados usando a ferramenta FastQC sob a NGS: QC e manipulação menu. NOTA: Deve ser dada especial atenção aos gráficos resultantes para o conteúdo sequência de bases por qualidade sequência de bases e por, como estes irão fornecer estimativas para os parâmetros usados ​​para aparar as extremidades da lê. </li><li> Aparar lê descartar 3 &#39;com dados de baixa qualidade, utilizando a ferramenta FASTQ Qualidade Trimmer 14 do NGS: menu de QC e manipulação. Definir a ferramenta para processar apenas 3 &#39;para o índice de qualidade inferior a 20. </li><li> Remover seqüências adaptadoras de lê usando a ferramenta Clip ( <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> ) sob a NGS: menu de QC e manipulação. Definir a ferramenta para descartar leituras com menos do que 45 bp para a esquerda, a sequência de entrada do adaptador usado e escolher a saída de modo a incluir ambas as sequências cortadas e não-cortadas. Além disso, optar por não descartar sequências com bases desconhecidos pois a maioria das bases de baixa qualidade já foram removidos na última etapa. </lEu&gt; <li> Usando a ferramenta de sequências de guarnição ( <a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> ), sob a NGS: QC e menu de manipulação, apare as primeiras bases da lê para remover 5 &#39;viés seqüência detectada por FastQC (normalmente 10). NOTA: Neste ponto, é uma boa idéia para executar FastQC novamente e comparar com a análise anterior para determinar se a qualidade do conjunto de dados foi melhorada. </li><li> Baixe e descompacte o mais recente montagem do genoma da galinha para o navegador genoma UCSC de Illumina iGenomes ( <a href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn</a> ) e fazer o upload de todo o arquivo de formato genoma fasta eo arquivo de formato GTF anotação genes para a história da galáxia utilizando a ferramenta de upload de arquivos no menu Obter dados. </li><li> Mapa lê para cada amostra para o genoma de galinha utilizando o alinhador TopHat2 15 sobos NGS: menu de Análise RNA. Escolha usar um genoma de História (selecione o arquivo fasta carregado no passo 4.7). </li><li> Construir um transcriptoma previsto para cada amostra usando abotoaduras 16 sob as NGS: menu de Análise RNA. Escolha usar anotação de referência como guia (selecione o arquivo GTF carregado no passo 4.7) e ativar as opções de realizar correção de viés (de História, arquivo fasta do passo 4.7) e usar multi-leitura correta. </li><li> Mesclar transcriptomes previstos para todas as amostras usando Cuffmerge 16 sob a NGS: Menu Análise de RNA. Escolha usar anotação de referência (arquivo GTF do passo 4.7) e dados de sequências (de História, arquivo fasta do passo 4.7). </li><li> Compare arquivos BAM gerados por TopHat2 para cada amostra usando Cuffdiff 16 sob a NGS: Menu Análise RNA. Nas transcrições de campo, selecione a metranscriptoma rged gerado pelo Cuffmerge e ativar as opções de realizar correção de viés (de História, arquivo fasta do passo 4.7) e usar multi-leitura correta. </li><li> Ordenar expressão diferencial testar tabelas numericamente ascensão na coluna 13 (valor q) usando o Sort ferramenta sob o menu Filtro e classificar. NOTA: Genes / transcrições mostrando expressão diferencial significativa entre as condições experimentais serão apresentados os valores de q menores. </li><li> Para verificar os resultados visualmente com gráficos de cobertura, primeiro converter arquivos para o formato BAM bedGraph utilizando a ferramenta Criar um BedGraph de cobertura do genoma 17 sob o menu BEDTools. Desativar relatório de regiões sem cobertura, escolha para tratar entradas emendados como intervalos distintos e dimensionar a cobertura por um fator que normaliza profundidade sequenciamento para todos os conjuntos de dados que estão sendo comparados. </li><li> Converter o arquivo para o formato bedGraph resultando figurão usando oferramenta peruca / BedGraph-a-mandachuva ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) no menu Formatos converter. Faça o upload dos arquivos bigwig como faixas personalizadas no navegador UCSC genoma ( <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ) para a montagem galGal4 e procurar um gene de interesse para visualizar a cobertura nos conjuntos de dados. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui nós fornecemos orientações para a análise dos efeitos após a eletroporação do frango medula espinhal. Embora eletroporação de vetores de DNA é mais freqüentemente usado para superexpressão de um gene de interesse, pode-se também usar construções que codificam negativos dominantes, proteínas quimeric ou precursores de siRNAs para gerar condições de função do gene knock-down 19-21. Na verdade, a comparação de perfis de transcriptoma resultantes de ambos gain- e análise por perda de função pode apontar gene...

Estudos genéticos sobre os organismos vivos utilizam frequentemente o embrião de galinha como modelo porque em eletroporação in ovo representa uma forma rápida e barata para transf parcialmente estruturas embrionárias in vivo com DNA constrói 1-5. Vectores de expressão bicistrónicos que codificam um transcrito contendo um repórter fluorescente em conjunto com o gene de interesse, tais como PCIG 6 ou 7 PMES, permitir a verificação rápida da qualidade transfecção na região desejada sob um microscópio estereoscópico antes de processar os embriões para análise a jusante. Com os recentes avanços na sequenciação de ADN, é agora possível obter perfis de expressão transcriptoma digitais inteiras a partir de amostras de ARN utilizando ARN-8,9 Seq. Portanto, em vez de métodos demorados que permitem a análise de apenas alguns produtos de genes em paralelo, tais como hibridação in situ, imuno-histoquímica e qPCR, preparação de bibliotecas de cDNA parade alto rendimento seqüenciamento pode fornecer informações de todo o transcriptoma. Observação dos efeitos experimentais sobre os níveis de cada gene único de expressão podem, por sua vez fornecem insights poderosos sobre os percursos alterados pela construção usado. Isto é particularmente fácil, se uma montagem genómico para o organismo utilizado, está disponível, assim, o embrião de galinha é novamente um modelo adequado. Se o usuário tem acesso a um centro de sequenciamento do genoma de confiança, a questão principal é a obtenção de amostras de RNA de alta qualidade. Este trabalho demonstra um método para a obtenção de amostras de ARN a partir de tubos neurais transfectadas adequadas para a RNA-Seq, bem como os passos a jusante para a análise in silico dos conjuntos de dados resultantes. Após eletroporação em HH12-13 seguido de 48 horas de incubação, tronco transfectadas metades da medula espinhal foram dissecados em condições livres de ribonuclease, imediatamente lisadas e mais protegida da degradação por ultra-baixo de congelamento até purificação RNA e biblioteca preparatião. O servidor público Galaxy 10 fornece acesso a recursos livres para análise de dados de sequenciamento de alto rendimento. A quantidade de espaço oferecido para usuários registrados é suficiente para pequenos experimentos, eliminando assim a necessidade de infra-estrutura computacional local. A análise de dados de RNA-Seq inclui filtragem, alinhamento e quantificação / Comparação da expressão do gene. Embora existam diretrizes gerais para a análise de dados de RNA-Seq, parâmetros de filtragem dependerá em grande parte a qualidade do sequenciamento e deve ser determinada após a análise dos dados brutos de controle de qualidade. Este protocolo descreve os passos para obter e comparar os perfis de RNA-Seq de frango embrionário medulas espinhais transfectadas in vivo. Como um resultado representativo, a comparação de conjuntos de dados obtidos a partir de duas amostras de controlo independentes transfectadas com um vector vazio mostraram que o método é reprodutível e deve permitir a identificação de expres diferencialmentetranscrições sed em amostras experimentais. Portanto, a aplicação deste método tem o potencial para aumentar grandemente o número de descobertas após uma única experiência e, assim, proporcionar um grande conjunto de dados para investigação posterior.

<table><tbody><tr><td>Tinta da China</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 agulha</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 3 ml</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>F D & C Blue 1</td><td>Spectra Colors Corporation</td><td>5.FC.0010P0</td><td>Corante alimentar usado para visualizar a injeção de DNA</td></tr><tr><td>Solução de Ringer (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 7,2 g de NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,37 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,225 g de CaCl2&#8226; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,217 g Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,02 g KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O para 800 ml e ajuste o pH para 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O a 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Filtro e autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (Solução Tamponada com Fosfato) (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 8 g de NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,2 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 1,15 g Na2HPO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,2 g KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O para 800 ml e ajuste o pH para 7,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - ddH2O a 1 L e filtro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 1 ml de DEPC (dietilpirocarbonato)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Agite vigorosamente e deixe repousar durante a noite em temperatura</td><td></td><td></td><td></td> ambiente</tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colher peneirada</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de poliestireno estéreis de 60 x 15 mm</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Solução de descontaminação RNase</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica de ponta fina</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinças retas de ponta fina</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agulha de vidro puxada feita de tubos capilares de vidro de 1,1 x 75 mm</td><td>Kimble Chase</td><td>40A502</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de vidro de 9 ''</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de pipeta manual</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno microcentrífugo transparente de 1,5 ml Microcentrífuga</td><td>Corning Life Sciences</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de solução RNAlater para estabilização de RNA</td><td>Life Technologies</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Kit de isolamento de RNA total aquoso</td><td>Life Technologies</td><td>AM1912</td><td></td></tr><tr><td>Etanol de grau de biologia molecular</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>2100 Eletroforese Instrumento Bioanalisador</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Preparação de Amostras de RNA Truseq v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001/RS-122-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

rna-seq análise de gene expression diferencial em electroporados pintainho embryonic medular

RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

A eletroporação in ovo do tubo neural do pintinho é um método rápido e barato para identificação da função gênica durante o desenvolvimento neural. A análise de todo o genoma de transcritos diferencialmente expressos após tal manipulação experimental tem o potencial de descobrir uma imagem quase completa dos efeitos a jusante causados pela construção transfectada. Este trabalho descreve um método simples para comparar transcriptomas de amostras de medula espinhal embrionária transfectada compreendendo todas as etapas entre a eletroporação e a identificação de transcritos diferencialmente expressos. A primeira etapa consiste em diretrizes para eletroporação e instruções para dissecção de metades da medula espinhal transfectadas de embriões HH23 em ambiente livre de ribonuclease e extração de amostras de RNA de alta qualidade adequadas para sequenciamento de transcriptoma. A próxima etapa é a da análise bioinformática com diretrizes gerais para filtragem e comparação de conjuntos de dados de RNA-Seq no servidor público Galaxy, o que elimina a necessidade de uma estrutura computacional local para experimentos de pequena e média escala. Os resultados representativos mostram que os métodos de dissecção geram amostras de RNA de alta qualidade e que os transcriptomas obtidos de duas amostras controle são essencialmente os mesmos, um requisito importante para a detecção de genes de expressão diferencial em amostras experimentais. Além disso, é fornecido um exemplo em que a superexpressão experimental de uma construção de DNA pode ser verificada visualmente após comparação com amostras de controle. A aplicação deste método pode ser uma ferramenta poderosa para facilitar novas descobertas sobre a função de fatores neurais envolvidos no desenvolvimento inicial da medula espinhal.

Para validar o método descrito, duas amostras de controlo foram gerados a partir de embriões electroporadas com as PMEs de vetores vazios 7 e uma amostra a partir de embriões transfectadas com o mesmo vector contendo a inserção construir SCRT2-ZnF, que codifica os domínios dedo-de-zinco de frango SCRT2 18. As amostras de RNA total produzindo 11-22 g cada foram obtidos a partir de misturas de 8 a 12 embriões. Todas as três amostras teve um valor óptimo RIN em 10 de um controlo de qualidade realizada...

Este vídeo mostra as etapas básicas para realizar a análise de transcriptoma completo em amostras de medula espinhal embrionária de pintinho dissecado após a transfecção com eletroporação in ovo.

RNA-Seq Análise de Gene Expression Diferencial em electroporados Pintainho Embryonic Medular

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar os níveis de expressão de todos os genes e amostras da medula espinhal embrionária de pintinhos eletroporados. Isso é feito primeiro in ovo, porcionando o lado direito dos tubos neurais embrionários iniciais e incubando novamente os embriões até o estágio desejado. A segunda etapa do procedimento é dissecar as metades do tubo neural transfectadas com sucesso em um ambiente livre de RNA e proceder à lise o mais rápido possível.O terceiro passo é isolar o RNA e submeter as amostras à preparação da biblioteca e sequenciamento de alto rendimento. A etapa final é processar os conjuntos de dados para remover artefatos de sequenciamento. Mapeie as raças para o genoma e atribua níveis de expressão a cada gene.Em última análise, os resultados podem mostrar genes diferencialmente expressos por meio da comparação dos níveis de expressão em condições de controle e experimentais. A demonstração visual deste método é crítica como uma dissecção do tubo neuro. Os passos são difíceis de aprender porque exigimos familiaridade com a manipulação de embriões.Para esta demonstração, os embriões foram transformados com a construção que expressa GFP no tubo neural. Prepare-se para passar duas horas trabalhando em até 10 embriões para coletar de um a dois microgramas de RNA total por embrião. Sob RNAs, condições livres, colher os embriões usando uma tesoura de dissecação fina e uma colher de coleta SVE transferir cada embrião para o frio.Tratados com DEPC. A PBS usou uma solução para todas as etapas de isolamento do tubo neural usando pinças finas para remover toda a região do flanco de um embrião entre os botões dos membros. Mova esta seção para uma solução fria fresca com o lado dorsal do tecido para cima.Use duas agulhas de vidro finas para perfurar três pontos em cada lado lateral dorsal do embrião entre o tubo neural e o mesoderma parial. Agora introduza as duas agulhas de vidro na perfuração central e afaste-as ao longo do eixo AP. Faça isso através de cada perfuração, conforme necessário, para separar o mesoderma paral, remover e descartar esse tecido.Em seguida, vire o embrião de lado e introduza as pontas de duas pinças entre o tubo neural e o cordão nodal. Deslize-os ao longo do eixo AP para dividir as estruturas. Termine de remover pedaços maiores de tecido meder do tubo neural, prendendo-o suavemente com uma pinça enquanto retira o excesso de mesoderma.Em seguida, transfira suavemente o tubo neural para uma solução fria fresca. Usando uma pipeta de vidro com uma bomba manual, colete todos os tubos neurais necessários e mantenha-os no gelo antes de prosseguir. Agora, divida cada um dos tubos neurais em duas metades.Insira uma pinça de ponta afiada no lúmen e rasgue a placa do teto. Em seguida, use a pinça para cortar a placa do piso e dividir o tecido ao meio. Usando um microscópio de dissecação fluorescente, separe as metades eletroporadas das não eletroporadas.Transfira as metades do tubo neural classificadas para um tubo de 1,5 mililitro com solução nova. Agite esses tubos para levar todo o tecido até o fundo. Em seguida, gire os tubos a 100 GS por alguns segundos.Em seguida, com muito cuidado, sob iluminação forte, aspire o snat. Se o tecido for retirado, ejete-o lentamente e repita o giro. Uma vez que as metades do tubo neural tenham sido limpas da solução, adicione 70 microlitros por tubo neural, metade do tampão de lise ao tubo.Agite o tubo e incube-o em temperatura ambiente por 15 minutos a cada cinco minutos, vortex o tubo vigorosamente e prossiga com a coleta do RNA para purificar o RNA Para sequenciamento, tenha pelo menos oito metades do tubo neural por amostra. Outras coleções de tubos neurais de lyce armazenados a 80 graus Celsius negativos podem ser agrupadas na coleção. Comece descongelando-os no gelo por 15 a 30 minutos e, em seguida, conclua o descongelamento em temperatura ambiente.Depois de descongelado, vortex todas as amostras vigorosamente e deixe-as descansar por cinco minutos. Em seguida, vortex as amostras novamente e centrifugue-as a 15.000 GS por um minuto. Para se livrar do material insolúvel, transfira o sobrenadante para um novo tubo e prossiga com a extração.Usando um kit de isolamento de RNA, conclua o processo iludindo o RNA na maior concentração possível. Este protocolo requer uma conta no site do Galaxy para garantir a cota de espaço necessária. Primeiro, faça o upload dos arquivos FASTQ para o site, a menos que os índices de qualidade já estejam codificados no Shred plus 33.Primeiro, prepare os conjuntos de dados carregados usando a ferramenta groomer FASTQ no menu NGS QC and Manipulation. Caso contrário, em atributos, altere o tipo de arquivo para remetente FASTQ. Em seguida, no menu NGS QC and Manipulation, use a ferramenta FAST QC para analisar a qualidade geral dos conjuntos de dados.Selecione o aparador de qualidade FASTQ no mesmo menu para descartar as três extremidades principais de baixa qualidade. Um índice de qualidade de 20 ou superior deve ser processado. Agora vá para a ferramenta de clipe no mesmo menu.Defina essa ferramenta para descartar leituras com menos de 45 pares de base. Insira a sequência do adaptador. Desative a opção de descartar leituras com bases desconhecidas e escolha a saída para incluir sequências recortadas e não recortadas.Prossiga com a ferramenta de sequências de corte. Use-o para cortar as primeiras bases da leitura para remover o viés de sequência de cinco primos detectado pelo FAST qc. O próximo passo é baixar e descompactar a mais recente montagem do genoma da galinha do site do genoma Illumina I.Em seguida, carregue todo o arquivo de formato mais rápido do genoma e o arquivo de formato GTF de anotação do gene para o Galaxy History. Agora mapeie as leituras de cada amostra para o genoma acessando o menu de análise N-G-S-R-N-A e selecionando a ferramenta top hat two. Selecione o arquivo fasta carregado no Galaxy History como o genoma de referência.Em seguida, escolha a ferramenta de abotoaduras no mesmo menu para criar um transcriptoma previsto. Para cada amostra, escolha o arquivo GTF a ser usado como guia de anotação de referência. Selecione Executar correção de polarização usando o arquivo FASTA para os dados de sequência e ative a opção usar correção de leitura múltipla.Em seguida, mescle todos os transcriptomas de montagem usando a ferramenta de mesclagem de manguito. Com esta ferramenta, escolha o arquivo GTF para a anotação de referência e o arquivo FASTA para os dados da sequência. Agora compare os arquivos BAM gerados pela cartola dois para cada amostra usando a ferramenta TIFF do manguito ainda no menu de análise de RNA.No campo transcrições, selecione o transcriptoma de mesclagem gerado pela mesclagem de manguito e ative as opções. Use a correção de leitura múltipla e execute a correção de polarização usando o arquivo FASTA para os dados da sequência. A próxima etapa é classificar as tabelas diferenciais Usando a coluna Valor Q, selecione a ferramenta de classificação no menu de filtro e classificação.As sequências com diferença significativa entre as condições experimentais terão os menores valores de Q na coluna 13. Agora dê uma olhada nos gráficos de cobertura. Primeiro, converta os arquivos BAM em arquivos de gráfico de leito usando a ferramenta de conversão no menu de ferramentas de leito nas opções, desative o relatório de regiões sem cobertura e opte por tratar as entradas emendadas como intervalos distintos.Dimensione também a cobertura por um fator que normalize todas as coberturas no experimento. Em seguida, converta o arquivo de gráfico de leito resultante para o formato de peruca grande usando a ferramenta no menu de formatos de conversão e carregue o arquivo de peruca grande como uma faixa personalizada para o servidor UCSE. Na página do navegador do genoma do USCS, use GAL quatro montagens e pesquisas de genes para cobertura visual dos conjuntos de dados usando os métodos descritos tubos neurais que expressam vetores PS vazios foram coletados para seu RNA.Isso foi feito em duplicata e o RNA resultante era de altíssima qualidade com um valor RIN ideal de 10, conforme esperado. A comparação global dos transcriptomas dos controles vetoriais vazios duplicados não mostrou diferença clara e o coeficiente de correlação de Pearson foi o ponto 99. Além disso, houve um claro aumento no número de leituras mapeadas para a sequência do gene scratch two em uma amostra experimental que expressa os domínios scratch two zinc finger.Assim, os métodos foram sensíveis o suficiente para detectar o enriquecimento previsto. Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de isolar o neurotubo embrionário e ter uma boa compreensão de como processar e comparar o conjunto de dados IC para encontrar genes diferencialmente expressos seguindo as etapas de análise de silício na seção quatro do protocolo.

rna-seq-analysis-differential-gene-expression-electroporated-chick

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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