RNA-Seq Análise de Gene Expression Diferencial em electroporados Pintainho Embryonic Medular

O objetivo geral deste procedimento é avaliar os níveis de expressão de todos os genes e amostras da medula espinhal embrionária de pintinhos eletroporados. Isso é feito primeiro in ovo, porcionando o lado direito dos tubos neurais embrionários iniciais e incubando novamente os embriões até o estágio desejado. A segunda etapa do procedimento é dissecar as metades do tubo neural transfectadas com sucesso em um ambiente livre de RNA e proceder à lise o mais rápido possível.

O terceiro passo é isolar o RNA e submeter as amostras à preparação da biblioteca e sequenciamento de alto rendimento. A etapa final é processar os conjuntos de dados para remover artefatos de sequenciamento. Mapeie as raças para o genoma e atribua níveis de expressão a cada gene.

Em última análise, os resultados podem mostrar genes diferencialmente expressos por meio da comparação dos níveis de expressão em condições de controle e experimentais. A demonstração visual deste método é crítica como uma dissecção do tubo neuro. Os passos são difíceis de aprender porque exigimos familiaridade com a manipulação de embriões.

Para esta demonstração, os embriões foram transformados com a construção que expressa GFP no tubo neural. Prepare-se para passar duas horas trabalhando em até 10 embriões para coletar de um a dois microgramas de RNA total por embrião. Sob RNAs, condições livres, colher os embriões usando uma tesoura de dissecação fina e uma colher de coleta SVE transferir cada embrião para o frio.

Tratados com DEPC. A PBS usou uma solução para todas as etapas de isolamento do tubo neural usando pinças finas para remover toda a região do flanco de um embrião entre os botões dos membros. Mova esta seção para uma solução fria fresca com o lado dorsal do tecido para cima.

Use duas agulhas de vidro finas para perfurar três pontos em cada lado lateral dorsal do embrião entre o tubo neural e o mesoderma parial. Agora introduza as duas agulhas de vidro na perfuração central e afaste-as ao longo do eixo AP. Faça isso através de cada perfuração, conforme necessário, para separar o mesoderma paral, remover e descartar esse tecido.

Em seguida, vire o embrião de lado e introduza as pontas de duas pinças entre o tubo neural e o cordão nodal. Deslize-os ao longo do eixo AP para dividir as estruturas. Termine de remover pedaços maiores de tecido meder do tubo neural, prendendo-o suavemente com uma pinça enquanto retira o excesso de mesoderma.

Em seguida, transfira suavemente o tubo neural para uma solução fria fresca. Usando uma pipeta de vidro com uma bomba manual, colete todos os tubos neurais necessários e mantenha-os no gelo antes de prosseguir. Agora, divida cada um dos tubos neurais em duas metades.

Insira uma pinça de ponta afiada no lúmen e rasgue a placa do teto. Em seguida, use a pinça para cortar a placa do piso e dividir o tecido ao meio. Usando um microscópio de dissecação fluorescente, separe as metades eletroporadas das não eletroporadas.

Transfira as metades do tubo neural classificadas para um tubo de 1,5 mililitro com solução nova. Agite esses tubos para levar todo o tecido até o fundo. Em seguida, gire os tubos a 100 GS por alguns segundos.

Em seguida, com muito cuidado, sob iluminação forte, aspire o snat. Se o tecido for retirado, ejete-o lentamente e repita o giro. Uma vez que as metades do tubo neural tenham sido limpas da solução, adicione 70 microlitros por tubo neural, metade do tampão de lise ao tubo.

Agite o tubo e incube-o em temperatura ambiente por 15 minutos a cada cinco minutos, vortex o tubo vigorosamente e prossiga com a coleta do RNA para purificar o RNA Para sequenciamento, tenha pelo menos oito metades do tubo neural por amostra. Outras coleções de tubos neurais de lyce armazenados a 80 graus Celsius negativos podem ser agrupadas na coleção. Comece descongelando-os no gelo por 15 a 30 minutos e, em seguida, conclua o descongelamento em temperatura ambiente.

Depois de descongelado, vortex todas as amostras vigorosamente e deixe-as descansar por cinco minutos. Em seguida, vortex as amostras novamente e centrifugue-as a 15.000 GS por um minuto. Para se livrar do material insolúvel, transfira o sobrenadante para um novo tubo e prossiga com a extração.

Usando um kit de isolamento de RNA, conclua o processo iludindo o RNA na maior concentração possível. Este protocolo requer uma conta no site do Galaxy para garantir a cota de espaço necessária. Primeiro, faça o upload dos arquivos FASTQ para o site, a menos que os índices de qualidade já estejam codificados no Shred plus 33.

Primeiro, prepare os conjuntos de dados carregados usando a ferramenta groomer FASTQ no menu NGS QC and Manipulation. Caso contrário, em atributos, altere o tipo de arquivo para remetente FASTQ. Em seguida, no menu NGS QC and Manipulation, use a ferramenta FAST QC para analisar a qualidade geral dos conjuntos de dados.

Selecione o aparador de qualidade FASTQ no mesmo menu para descartar as três extremidades principais de baixa qualidade. Um índice de qualidade de 20 ou superior deve ser processado. Agora vá para a ferramenta de clipe no mesmo menu.

Defina essa ferramenta para descartar leituras com menos de 45 pares de base. Insira a sequência do adaptador. Desative a opção de descartar leituras com bases desconhecidas e escolha a saída para incluir sequências recortadas e não recortadas.

Prossiga com a ferramenta de sequências de corte. Use-o para cortar as primeiras bases da leitura para remover o viés de sequência de cinco primos detectado pelo FAST qc. O próximo passo é baixar e descompactar a mais recente montagem do genoma da galinha do site do genoma Illumina I.

Em seguida, carregue todo o arquivo de formato mais rápido do genoma e o arquivo de formato GTF de anotação do gene para o Galaxy History. Agora mapeie as leituras de cada amostra para o genoma acessando o menu de análise N-G-S-R-N-A e selecionando a ferramenta top hat two. Selecione o arquivo fasta carregado no Galaxy History como o genoma de referência.

Em seguida, escolha a ferramenta de abotoaduras no mesmo menu para criar um transcriptoma previsto. Para cada amostra, escolha o arquivo GTF a ser usado como guia de anotação de referência. Selecione Executar correção de polarização usando o arquivo FASTA para os dados de sequência e ative a opção usar correção de leitura múltipla.

Em seguida, mescle todos os transcriptomas de montagem usando a ferramenta de mesclagem de manguito. Com esta ferramenta, escolha o arquivo GTF para a anotação de referência e o arquivo FASTA para os dados da sequência. Agora compare os arquivos BAM gerados pela cartola dois para cada amostra usando a ferramenta TIFF do manguito ainda no menu de análise de RNA.

No campo transcrições, selecione o transcriptoma de mesclagem gerado pela mesclagem de manguito e ative as opções. Use a correção de leitura múltipla e execute a correção de polarização usando o arquivo FASTA para os dados da sequência. A próxima etapa é classificar as tabelas diferenciais Usando a coluna Valor Q, selecione a ferramenta de classificação no menu de filtro e classificação.

As sequências com diferença significativa entre as condições experimentais terão os menores valores de Q na coluna 13. Agora dê uma olhada nos gráficos de cobertura. Primeiro, converta os arquivos BAM em arquivos de gráfico de leito usando a ferramenta de conversão no menu de ferramentas de leito nas opções, desative o relatório de regiões sem cobertura e opte por tratar as entradas emendadas como intervalos distintos.

Dimensione também a cobertura por um fator que normalize todas as coberturas no experimento. Em seguida, converta o arquivo de gráfico de leito resultante para o formato de peruca grande usando a ferramenta no menu de formatos de conversão e carregue o arquivo de peruca grande como uma faixa personalizada para o servidor UCSE. Na página do navegador do genoma do USCS, use GAL quatro montagens e pesquisas de genes para cobertura visual dos conjuntos de dados usando os métodos descritos tubos neurais que expressam vetores PS vazios foram coletados para seu RNA.

Isso foi feito em duplicata e o RNA resultante era de altíssima qualidade com um valor RIN ideal de 10, conforme esperado. A comparação global dos transcriptomas dos controles vetoriais vazios duplicados não mostrou diferença clara e o coeficiente de correlação de Pearson foi o ponto 99. Além disso, houve um claro aumento no número de leituras mapeadas para a sequência do gene scratch two em uma amostra experimental que expressa os domínios scratch two zinc finger.

Assim, os métodos foram sensíveis o suficiente para detectar o enriquecimento previsto. Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de isolar o neurotubo embrionário e ter uma boa compreensão de como processar e comparar o conjunto de dados IC para encontrar genes diferencialmente expressos seguindo as etapas de análise de silício na seção quatro do protocolo.