Name: Propagação de 01-vírus Homalodisca coagulata Via Homalodisca vitripennis Cultura de Células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Aprenda a propagar o vírus HoCV-1 em culturas de células de Homalodisca vitripennis usando extração de RNA e qRT-PCR. Este método permite estudar replicação viral e interações hospedeiro-patógeno de forma controlada.

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Gostaríamos de agradecer ao Programa de Pesquisa e Educação da Doença de Texas Pierce e ao USDA-APHIS por seu apoio financeiro a este projeto. Também gostaríamos de agradecer a Hema Kothari, do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em Tyler, por sua assistência com a microscopia confocal.

Cultura 1 celular NOTA: linhas celulares Homalodisca vitripennis estabelecidos pelo laboratório Dr. Wayne Hunter no Serviço de Pesquisa Agrícola do USDA (Ft. Pierce, FL EUA) foram utilizados para iniciar um estoque laboratório composto por estágios de células mistas, incluindo fibroblastos iniciais e monocamadas. <ol><li> Executar os seguintes procedimentos em ambiente estéril laboratório mantido a uma temperatura de 20-24 ° C de 25 cm 2 frascos de cultura. </li><li> Cultivar e manter culturas de 25 centímetros dois frascos de cultura de tecidos, utilizando meio de H2G + Cigarrinha, uma modificação meios de abelha WH2 10 (Tabela 1). </li><li> Incubar frascos de cultura a 24 ° C, com ~ 53% de humidade. </li><li> Use um microscópio invertido com uma ampliação total (MT) de 100X para acompanhar o crescimento da cultura, por exemplo, verificar se há algum crescimento celular anormal, monitorização de quaisquer contaminantes potenciais, e verificar o progresso de crescimento em todo o culsuperfície tura. </li><li> Realize uma mudança médio completo (~ 4 ml de meio de cultura por frasco) a cada 7-10 dias sem perturbar a superfície da cultura. </li><li> Passa culturas quando a superfície da cultura é aproximadamente de 80% coberta por um crescimento celular (confluente) usando 0,25% de tripsina contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para dissociar as células. Adicionar ~ 2 - 3 ml de tripsina a cada balão de cultura e expor a cultura (s) para a enzima durante curtos períodos de tempo (5-10 min) para obter a dissociação de células completas. </li><li> Adicionar uma quantidade igual de meio fresco para o frasco de cultura (s) (~ 2 - 3 ml) para parar a actividade da enzima e transferem toda a solução para um tubo cónico de centrifugação. </li><li> As células por centrifugação a 4 ° C durante 6 min a 350 x g. </li><li> Retirar o sobrenadante sem perturbar o pelete de células e adicionar ~ se 8 ml de meio fresco a cada tubo. Gentilmente homogeneizar células usando uma pipeta. </li><li> Culturas desdobramento à 1: 2 proporção de 25 centímetros 2 frascos (~ 4 ml de soluti celularem por balão) e deixam as culturas recentemente transmitidos em repouso por 48 horas para permitir que as células em suspensão para fixar firmemente à superfície do frasco. NOTA: O cultivo de células de 48 poços em placas estéreis de cultura de tecido com uma superfície de crescimento de 1 cm 2, também é possível e que pode ser mantida na mesma forma como frascos de cultura, com uma redução do volume de meio de cultura para ~ 250 mL. </li></ol> 2 Extracção vírus inteiro <ol><li> Homogeneizar corpos inteiros de vírus H. positivo vitripennis em tampão fosfato, pH ~ 7,2, com tri-hidrato de dietilditiocarbamato de sódio a 0,02% (DETCA) por rotação durante ~ intervalos de 10 segundos até que não haja mais de grandes aglomerados de tecido presente. Extracto de vírus através de centrifugação a superspeed 124.500 xg durante 4 horas a 4 ° C ou 22.000 xg durante 16 horas a 4 ° C. Se se formar um precipitado na parte superior, retire-os com um cotonete estéril 11. </li><li> Descartar o sobrenadante. </li><li> Coletar o sedimento edissolvem-se com 5 mL de 10 mM de tampão de fosfato (sem DETCA), pH ~ 7,2, contendo 0,4% de ácido Na-desoxicólico e 4% de éter de polietileno glicol de hexadecilo (Brij 52). <ol><li> Para misturar o sedimento assim, remover o pellet a partir do lado do tubo e esmagar até que em solução, se necessário. </li><li> Adicionar mais tampão fosfato 10 mM, em incrementos de 5 ml ~ para ajudar a pelota entrar em solução, se necessário, e combinar-se dois tubos 11. </li></ol></li><li> Centrifuga-se a solução a 300 xg durante 15 minutos 11. </li><li> Remover o sobrenadante e passar a solução através de um filtro de 0,45 mm, e recolher o filtrado em tubo grande coleção 11. </li><li> Transferência filtrado para uma membrana de diálise com um peso molecular de corte (MWCO) de 3,5 kD, utilizando pequenas quantidades de tampão fosfato 10 mM (pH 7) contendo nenhum DETCA 11, se necessário. </li><li> Colocar a membrana de diálise num copo grande cheio com ddH2O a 4 ° C. Alterar o DDH 2 O a cada hora fou 5-6 horas, até que se forme um precipitado branco na membrana 11. </li><li> Recolhe-se o vírus purificada a partir de dentro da membrana e sujeitar a solução de vírus de 100% de uma série de diluições de 10 vezes por adição de 10 ul de solução de 90 ul de ddH 2 O. Subsequentemente juntar 10 ul de uma diluição de mais 90 ul de ddH2O até atingir uma diluição de 1: 100.000. </li><li> Solução vírus armazenar a -80 ° C. </li></ol> 3. replicação viral <ol><li> Células de sementes em placas de cultura de 48 poços e crescem todas as linhas até o crescimento celular é de 80% confluentes (cerca de 72 horas pós-pass se as células estão crescendo a uma taxa média). </li><li> Inocular cada linha de células com o vírus diluído em série, uma vez o crescimento das células atinge a confluência, isto é, uma linha de uma diluição de 1:10, uma linha de uma diluição de 1: 100, etc, excepto para a linha de cima. Utilizar a linha superior como um controlo e adicionar 10 uL de ddH2O a cada poço como controlo de volume. <ol><li> A fim de estabelecer uma concentração de células a partir da linha de base para comparação com as contagens de células experimentais, dissociam-se e contam a primeira cavidade de cada fileira, antes da inoculação inicial de todos os poços das culturas com vírus. </li></ol></li><li> Monitor de placas de cultura de todas as 24 horas após a inoculação virai para qualquer alteração de cor no meio indica uma alteração do pH e de quaisquer alterações na morfologia celular. </li><li> Imagem uma coluna da placa de teste, em cada ponto do tempo, utilizando um microscópio invertido em 100X TM. </li><li> Remover todo o meio da coluna, que foi representada por imagem em cada ponto de tempo de 24 horas e armazená-lo a curto prazo a -20 ° C, durante a extracção de ARN viral e quantificação ou a longo prazo a -80 ° C. </li><li> Dissociar as células dos poços, após a remoção do meio como anteriormente descrito nos passos 1,6-1,9, utilizando apenas ~ 250 uL de EDTA a 0,25% de tripsina e meio fresco para parar a actividade da enzima e ~ 250 ul de meio fresco para re-suspender a Pelle célulat. </li><li> Adicionam-se 10 ul de 0,4% de azul tripano mancha para cada tubo contendo as células para realizar a contagem de células após a dissociação das células por cada período de 24 horas durante uma semana. Permitir mancha para descansar por 10 min antes de realizar a contagem de células. <ol><li> Efectuar a contagem de células no espaço de 1 hora de exposição à mancha ou células viáveis ​​irão começar a absorção de manchas, bem como as células não viáveis. </li></ol></li><li> Lentamente, adicionar 10 ml da solução de células coradas para cada lado de um hemocitómetro padrão utilizando uma micropipeta. Permitir que a solução a adoptar-se por acção capilar, para evitar bolhas de ar. </li><li> Conte o número de células viáveis ​​(não-coradas) em ambos os lados do hemocitómetro (o equivalente a quatro contagens dos 16 quadrados no hemocitómetro). Efectuar a contagem de células para cada poço da coluna que foi removida. </li><li> Calcular a média das contagens das células de cada coluna usando a seguinte fórmula para se obter o número total da contagem de células: (média do número de células / 4) x factor de diluição = número de células 10 x <sup&gt; 4 ml. Esta é a densidade de células ou o número de células viáveis ​​na cultura. </li></ol> 4 Extração Vírus de Cultura de Células <ol><li> Remover tratado H. vitripennis células de balões de cultura como anteriormente descrito nos passos 1,6-1,8, utilizando apenas ~ 250 uL de EDTA a 0,25% de tripsina e meio fresco para parar a actividade da enzima. </li><li> Descartar o sobrenadante. </li><li> Extracto de vírus a partir de células de cultura de acordo com o protocolo anteriormente descrito nos passos 2,3-2,8. </li></ol> Extração de RNA 5. <ol><li> Extrair RNA de amostras de meio colhidas durante cada ensaio de vírus de uma semana, utilizando uma extracção de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidina concebido para amostras líquidas por protocolo do fabricante. </li><li> Loja extraiu amostras a -80 ° C. </li></ol> 6. RT-PCR <ol><li> Estabelecer padrões virais para RT-PCR, executando PCR tradicional usando opar de iniciadores HoCV RT-PCR o iniciador 1 (5&#39;-frente GCTCCCCGGCTTTGCTGGTT-3 &#39;, reverso 5&#39;-ACGACGGATCTGCGTGCCAA-3&#39;) com o vírus isolado a partir de todo o corpo H. vitripennis. </li><li> Produto de PCR sujeita a electroforese em gel, durante 60 minutos a 120 V num gel de agarose a 2% contendo 0,1% de brometo de etídio. </li><li> Excisar as bandas do gel e purifica-se utilizando um kit de extracção de gel, conforme o protocolo do fabricante. </li><li> Piscina tudo excisadas e produto gel purificado e ainda purificar por precipitação básica etanol. Eluir o produto a precipitação em cerca de 30 ul de Tris EDTA (TE) para aumentar a concentração total da amostra. </li><li> Quantificar o nível de cDNA em amostras combinadas através de espectrofotometria utilizando 260/230 configurações de comprimento de onda para a detecção de ácido nucleico. </li><li> Executar uma série de diluição em série de dez vezes da amostra purificada variando de 57 ng / mL a 57 ag / mL (10 -18). Realizar a diluição em série semelhante à descrita in 2.8 com os ajustes feitos para a diferença de requisitos de concentração. </li><li> Determinar os limites de detecção da série de diluição através da realização de qRT-PCR, utilizando um kit de qRT-PCR com quantificação fiável de transcritos de baixa abundância. NOTA: As concentrações virais inferior a 5 x 10 -3 cópias não são detectáveis. </li><li> Extrair RNA de amostras experimentais como descrito anteriormente no passo 5.1 e utilizando espectrofotometria de quantificar. </li><li> Normalizar todas as amostras extraídas de 5 ng / mL, utilizando água livre de nuclease. </li><li> Realizar qRT-PCR em todas as amostras, em duplicado, como reacções de 25 ul usando um kit de um único passo de qRT-PCR, com a capacidade para detectar números de cópias baixo como se segue: 50 ° C para manter 10 min; 95 ° C espera por 5 min; 30 ciclos de 95 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 30 seg; derreter 50-99 ° C durante 5 segundos em cada passo. <ol><li> Faça a mistura principal para que cada mistura de reação contém 12,5 mL de maste 1xmistura r, 1,0 ul (0,3 mM) de iniciador para a frente, 1,0 ul (0,3 mM) de iniciador reverso, 0,25 ul de transcriptase reversa e de quantidades variáveis ​​de modelo com base em valores de normalização. </li><li> Levar o volume total de reacção de 25 ul com RNase isenta de água. </li><li> Incluir cinco concentrações padrão em cada PCR executado com os seguintes números de cópias: 5 x 10 -10, 5 x 10 -8, 5 x 10 -6, 5 x 10 -4, e 5 x 10 -2 cópias. Definir o limite para cada corrida até um pouco abaixo uma fluorescência de 10x -2.5 para reduzir o ruído durante a aquisição precoce no início de cada execução. </li></ol></li></ol> 7. microscopia confocal <ol><li> Cultivar células Homalodisca vitripennis em um doze poços contendo lamínulas de vidro com 18 mm de diâmetro em cada poço. </li><li> Inocule uma coluna na placa de cada 24 h durante um período de quatro dias, uma vez que uma monocamada é alcançado. Assegurar que cada column contém também um controle, uma diluição baixa viral (1:10) bem e uma diluição viral alta (1: 100.000) também. Utilizar soluções de vírus obtidas a partir do passo 2.8. </li><li> Remova toda a mídia no quinto dia e lavar as células duas vezes com 1x PBS (pH 7,4). </li><li> Fixar as células com paraformaldeído a 4% frio, a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Adicionar 500 ul de 1x tampão de fosfato salino (PBS) para as células e lava-las durante 10 minutos à temperatura ambiente num agitador rotativo a baixa velocidade. Lavam-se as células três vezes. </li><li> Adicionar 500 ul de 0,1% de Triton X-100 às células para permeabilizar eles. Deixar assentar durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lave as células uma vez, como descrito anteriormente no passo 7.5. </li><li> Adicionar 500 ul de uma solução a 5% de albumina de soro bovino (BSA) para bloquear as células à temperatura ambiente. Deixe descansar por 2 horas e depois retire. </li><li> Diluir estoque rodamina faloidina vermelho-conjugado (RCP) 1: 250 em 1x PBS contendo 5% BSA e adicionar 250 ul da diluição a cada poço a mancha de F-actina. </li><li> Placa de cobertura em alumínio fóleo para evitar que o corante de branqueamento e incubar as células a 4 ° CO / N. </li><li> Retirar a RCP após 12 h de incubação e substituí-la com 250 ul de 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (250 ug / ml) diluídas em PBS 1x contendo 5% de BSA, para corar os núcleos das células . </li><li> Incubar as células contendo DAPI, à TA durante 1 hora. </li><li> Lave as células três vezes com PBS 1x, como descrito anteriormente no passo 7.5. </li><li> Remova cuidadosamente as lamelas dos poços e montar a lâminas de microscópio utilizando um meio de montagem com um reagente anti-fade. </li><li> Permitir que os slides para secar lightproof caixas até visto sob o microscópio confocal. Ver de lâminas preparadas para, logo que possível, como corantes podem desaparecer rapidamente. </li><li> Imagem de células marcadas, utilizando um sistema confocal equipado com um microscópio que contém uma lente de 63X (óleo)-apochromate plano. <ol><li> Defina os comprimentos de onda do laser para 543 ± 10 nm de excitação e 575 ± 10 nm de emissão para Rhoadmine phalloidin vermelho-conjucated, E 369 ± 10 nm de excitação e de emissão de 450 ± 30 nm para DAPI. </li><li> Use ganho idêntico e partiu-configurações para o detector de obter todas as imagens. </li><li> Processar imagens usando o software apropriado para o processamento de imagem e de triagem e de importação desejada imagens em um software gestão de imagem. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Crescentes preocupações em relação à entrada de espécies invasoras agrícolas têm levado a um aumento da procura de novas metodologias para se defender contra pragas e patógenos emergentes. Um foco de prevenção e gestão de doenças envolve a gestão de vetores de patógenos e era o alvo principal deste estudo. Economia desempenhar um papel vital na decisão de produzir este tipo de biopesticida para gerenciar vetores de patógenos na agricultura porque a aplicação prática precisa ser de grandes quantidades em grandes áreas, m...

O atirador vítreo-de-asa (Homalodisca vitripennis Germar 1821) foi identificado como o vetor predominante de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), o agente causal da doença da videira (PD) de Pierce na América do Norte 1. Gestão da população de insetos rapidamente se tornou o foco de investigação para combater este problema devastador para a indústria de viticultura na Califórnia e em todo o sul dos Estados Unidos. Um de sentido positivo, vírus de RNA de cadeia simples, que pertence à família Dicistroviridae, Homalodisca vírus-01 coagulata (HoCV-01) foi identificada em H. selvagem populações vitripennis e mostrado para aumentar a mortalidade nessas populações 2-4, enquanto diminuem a resistência do inseto aos inseticidas. Desenvolvimento de métodos para efetivamente traseira infectado H. vitripennis à idade adulta em um ambiente de laboratório têm sido difíceis porque <em&gt; H. vitripennis têm necessidades nutricionais específicas de palco diferentes que exigem uma variedade de plantas hospedeiras 5-8. Instalações específicas são necessárias para H. vivo traseira vitripennis nos Estados Unidos; por conseguinte, a cultura celular é mais económico e uma alternativa viável, assim como cada vez mais importante para HoCV-01 e detecção da replicação 2,9. Embora métodos básicos para se estabelecer culturas de células de H. vitripennis são descritos, estes métodos não têm sido utilizados para a produção comercial de agentes de controlo biológico, tais como vírus 2. O objectivo global dos processos seguintes é para produzir uma elevada concentração de HoCV-01 apropriada para utilização como um agente de controlo biológico. A replicação viral requer uma célula viva, que é por isso que cultivar com sucesso e otimizando H. vitripennis culturas é vital para o progresso de produzir níveis rentáveis ​​de vírus.

<table><tbody><tr><td>Frascos de cultura de células Corning</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430168</td><td>Área de superfície 25 cm2, gargalo inclinado, tampa (plug seal)</td></tr><tr><td>Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td>Microscópio invertido e câmera</td></tr><tr><td>Solução de tripsina-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td>0,25%, filtrado estéril, BioReagent, adequado para cultura celular, 2,5 g de tripsina suína e 0,2 g de EDTA &bull; 4Na por litro de Hanks&prime; Solução salina balanceada com vermelho de fenol</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR placas de cultura multipoços</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8937</td><td>48 poços (TC tratado com tampa)</td></tr> <tr><td>DETCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>228680</td><td>Dietilditiocarbamato de sódio trihidratado</td></tr><tr><td>Sistema de filtro a vácuo de garrafa Corning</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS431206</td><td>Membrana de acetato de celulose, tamanho do poro 0,45 &mu; m, área da membrana 54,5 cm2, capacidade de filtragem 500 ml</td></tr><tr><td>Brij 52</td><td>Sigma Aldrich</td><td>388831</td><td>Éter hexadecílico de polietilenoglicol</td></tr><tr><td>Solução tampão de fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5244</td><td>Recebido como 100 mM diluído a 10 mM com água estéril</td></tr><tr><td>TRIzol LS</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>Para por eletroforese</td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7637</td><td>BioReagent, para biologia molecular, em pó</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect qRT-PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>204243</td><td></td></tr><tr><td>4% de paraformaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Grau de reagente, cristalino</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Fosfato solução salina tamponada</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Faloidina conjugada com vermelho de rodamina</td><td>Life Technologies</td><td>R415</td><td>A faloidina de rodamina é uma sonda de actina F de alta afinidade conjugada ao corante fluorescente vermelho-laranja, tetrametilrodamina</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Antidesvanecimento ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 Meta Sistema Confocal</td><td>Software Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen 2007 Carl</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Meio de inseto (suplementado, 1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8142</td><td>H2G+ cigarrinha componente médio</td></tr><tr><td>L-histidina monohidratada</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8125</td><td>H2G+ cigarrinha meio componente</td></tr><tr><td>Meio 199 (10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4530</td><td>H2G+ cigarrinha meio componente</td></tr><tr><td>Meio 1066 (1x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0422</td><td>H2G+ cigarrinha meio componente</td></tr><tr><td>Hank' s Sais Balanceados (1x)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>51322C</td><td>H2G + cigarrinha componente médio</td></tr><tr><td>L-Glutamina (100x)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td>H2G + cigarrinha componente médio</td></tr><tr><td>MEM, mistura de aminoácidos (50x)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>56419C</td><td>H2G + cigarinha componente médio</td></tr><tr><td>1 M MgCl solução</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>H2G + cigarrinha componente médio</td></tr><tr><td>Pen-Strep (w / glutamina)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>G6784</td><td>H2G + cigarrinha componente médio</td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N6261</td><td>H2G + cigarrinha componente médio</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46305</td><td>H2G + cigarrinha componente médio</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>H2G + cigarrinha componente médio</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>H2G + cigarrinhas componente médio</td></tr></tbody></table>

propagação de<em&gt; 01-vírus homalodisca coagulata</em&gt; via<em&gt; homalodisca vitripennis</em&gt; cultura de células

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

O atirador vítreo-de-asa (Homalodisca vitripennis) é um inseto altamente vágil e polífagas encontrados em todo o sudoeste dos Estados Unidos. Esses insetos são os vetores predominantes de Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), uma bactéria restrita ao xilema, que é o agente causal da doença de Pierce (PD) de videira. Doença de Pierce é economicamente prejudicial; assim, H. vitripennis tornaram-se um alvo para estratégias de gestão patógeno. Um dicistrovirus identificado como Homalodisca coagulata vírus-01 (HoCV-01) tem sido associado com um aumento da mortalidade em H. populações vitripennis. Por causa de uma célula hospedeira é necessária para a replicação HoCV-01, a cultura de células fornece um ambiente uniforme para a replicação que é orientada logisticamente e economicamente valiosa para a produção de biopesticida. Neste estudo, um sistema para a propagação em larga escala de H. vitripennis células através de cultura de tecidos foi desenvolvido, providing um mecanismo de replicação viral. HoCV-01 foi extraído a partir de insectos de corpo inteiro e usada para inocular H. cultivadas vitripennis células em níveis variados. O meio de cultura foi removido a cada 24 h durante 168 horas, o RNA extraído e analisado com qRT-PCR. As células foram coradas com azul de tripan e contadas para quantificar a capacidade de sobrevivência de células por microscopia de luz. Partículas de vírus inteiros foram extraídos até 96 horas após a infecção, o que foi o ponto de tempo determinado antes de ser ocorreu colapso total de cultura de células. As células também foram submetidos a coloração fluorescente e visualizadas por microscopia confocal para investigar a atividade viral na F-actina apego e núcleos integridade. A conclusão deste estudo é que H. vitripennis células são capazes de serem cultivadas e utilizadas para a produção em massa de HoCV-01 a um nível apropriado para permitir a produção de um biopesticida.

A adesão celular e crescimento ocorreu dentro de 48 horas de passagem em ambos os pequenos e grandes frascos de cultura, a partir de culturas primárias e passagens contínuas. Crescimento de fibroblastos e desenvolvimento também foi observada dentro deste prazo. Quando frascos recém semeadas foram perturbados antes de 48 horas, houve um declínio visível na fixação das células, levando a culturas de crescimento lento e às vezes nenhum apego ou de crescimento em tudo. As células foram de aproximadamente 80% confluente dent...

Aqui apresentamos um protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Médio foi removido do HoCV-1 culturas positivas e RNA extraído a cada 24 horas para 168 horas. A capacidade de sobrevivência das células foi quantificada por coloração com azul de tripano. Partículas de vírus inteiros foram extraídos após a infecção. RNA extraído foi quantificada por qRT-PCR.

Propagação de<em&gt; 01-vírus Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cultura de Células

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar se o vírus um de Homalodisca coagulata, ou HOCV-um, pode ser replicado utilizando culturas de células de Homalodisca vitripennis e, em seguida, extraído para usos posteriores. Isso é alcançado mediante o cultivo bem-sucedido de H. vitripennis para introduzir HOCV-um purificado e promover sua replicação. Como segundo passo, o meio e as células contendo o vírus são removidos da cultura e, então, submetidos a extrações de vírus e de RNA.Em seguida, o RNA extraído dos cultivos infectados é submetido à PCR para determinar se o RNA viral está presente nas células. Os resultados mostram que o HOCV um pode ser replicado in vivo com base na contagem de células viáveis antes e após a infecção e na análise de qRT-PCR.A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos existentes, como a criação de insetos vivos infectantes, é que ela é mais econômica e facilmente gerenciável com instalações e equipamentos mínimos. O uso deste método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de controle biológico. Por exemplo, um vírus de inseto ou um vírus específico para uma espécie de inseto pode ser usado para controlar uma praga em larga escala?Embora este método possa fornecer informações sobre o manejo desse inseto específico, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como o controle de formigas-de-fogo-vermelhas importadas utilizando um vírus da mesma família que o HOCV. Antes de iniciar este procedimento, cultive e mantenha culturas em frascos de cultura de tecidos de 25 centímetros quadrados usando o meio H2G acrescido de meio para cigarrinhas, um meio modificado para abelhas do tipo WH-dois. Homogeneíze corpos inteiros de H. vitripennis positivos para o vírus em tampão fosfato com 0,02% de DETCA por meio de vortex em intervalos de aproximadamente dez segundos até que não haja mais grandes aglomerados de tecido. Extraia o vírus por meio de centrifugação ultraveloz a 22.000 g durante 16 horas a quatro graus Celsius.Após descartar o sobrenatante, colete o pellet e dissolva-o com cinco mililitros de tampão fosfato 10 milimolar contendo 0,4% de ácido desoxicólico de sódio e 4% de polietilenoglicol hexaéter desal. Para misturar bem o pellet, remova-o da parede do tubo e triture-o, se necessário. Após centrifugação a 300 ×g por 15 minutos, remova o sobrenatante e, em seguida, passe a solução por um filtro de 0,45 micrômetro, coletando o filtrado em um tubo de coleta grande.Transfira o filtrado para uma membrana de diálise com corte de peso molecular de 3,5 kilodaltons, utilizando pequenas quantidades de tampão fosfato 10 milimolar sem DETCA, se necessário. Coloque a membrana de diálise em um béquer grande contendo água destilada duas vezes a quatro graus Celsius. Troque a água a cada hora durante cinco a seis horas, até que um precipitado branco se forme na membrana. Nesse momento, semeie as células em placas de cultura de 48 poços.Quando o crescimento celular atingir 80% de confluência, inocule cada linha de células com o vírus diluído em série. Em seguida, adicione 10 microlitros de água bidestilada a cada poço como controle de volume. Para estabelecer uma concentração inicial de células como referência para comparação com as contagens celulares experimentais, dissocie o primeiro poço de cada linha antes da inoculação inicial de qualquer poço nas culturas com o vírus. Em seguida, conte as células.Em seguida, remova todo o meio da coluna que foi analisado em cada ponto temporal de 24 horas e armazene-o a 20 graus negativos Celsius para extração de RNA e quantificação viral. Após extrair o vírus das células em cultura seguindo o protocolo descrito anteriormente, extraia o RNA de amostras de meio coletadas durante cada ensaio viral semanal usando uma extração com tiocianato de guanidínio, fenol e clorofórmio, projetada para amostras líquidas, conforme o protocolo do fabricante. Para a RT-PCR, estabeleça padrões virais realizando PCR convencional utilizando o par de iniciadores HOCV RT-PCR primer-um com o isolado viral de corpo inteiro de H. vitripennisEm seguida, realize uma série de diluições seriadas de dez vezes da amostra purificada, variando de 57 nanogramas por microlitro a 57 atogramas por microlitro. Determine os limites de detecção da série de diluições por qRT-PCR utilizando um kit de qRT-PCR com quantificação confiável de transcritos de baixa abundância.Após extrair o RNA das amostras experimentais conforme descrito anteriormente, quantifique utilizando espectrofotometria. Em seguida, realize qRT-PCR em todas as amostras em duplicata como reações de 25 microlitros usando um kit de qRT-PCR em um único passo com capacidade de detectar números baixos de cópias, da seguinte forma. Prepare a mistura-mestra de modo que cada mistura de reação contenha 12,5 microlitros de mistura-mestra 1x, 1,0 microlitro de iniciador (primer) direto 0,3 micromolar, 1,0 microlitro de iniciador reverso 0,3 micromolar, 0,25 microlitros de transcriptase reversa e quantidades variáveis de molde com base nos valores de padronização. Em seguida, complete o volume total da reação para 25 microlitros com água livre de RNAses. Inclua cinco concentrações padrão em cada corrida de PCR com cinco vezes 10 elevado a menos 10, cinco vezes 10 elevado a menos oito, cinco vezes 10 elevado a menos seis, cinco vezes 10 elevado a menos quatro e cinco vezes 10 elevado a menos dois cópias. Defina o limiar para cada corrida logo abaixo de uma fluorescência de 10 elevado a menos 2,5 para reduzir o ruído durante a aquisição inicial no início de cada corrida. Uma vez que as células de Homalodisca vitripennis tenham sido cultivadas em uma placa de 12 poços contendo lamínulas de vidro, inocule uma coluna a cada 24 horas durante quatro dias, após a obtenção de uma monocamada com o vírus extraído. Ao finalizar, fixe as células com paraformaldeído a 4% frio a quatro graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione 500 microlitros de PBS 1X às células e lave-as por 10 minutos à temperatura ambiente em agitador com velocidade baixa. Após lavar as células três vezes, adicione 500 microlitros de TritonX-100 a 0,1% para permeabilizar as células por 10 minutos.Após as células terem sido lavadas com PBS 1X, adicione 500 microlitros de uma solução de albúmina sérica bovina a 5% para bloquear as células à temperatura ambiente. Após duas horas, remova a solução das células. Em seguida, adicione 250 microlitros de uma solução diluída de Phalloidina conjugada com rodamina-vermelha em cada poço para colorir a f-actina. Cubra a placa com folha de alumínio para evitar o desbotamento do corante e incube as células a quatro graus Celsius durante a noite. Após a incubação, remova a solução de rodamina e substitua por 250 microlitros de DAPI diluído em PBS 1X contendo 5% de BSA para corar os núcleos das células. Após incubar as células à temperatura ambiente por uma hora, lave-as três vezes com PBS 1X conforme descrito anteriormente.Por fim, remova cuidadosamente as lamínulas dos poços e monte-as em lâminas de microscópio utilizando um meio de montagem com um reagente antidesbotamento.A adesão celular e o desenvolvimento de fibroblastos foram observados dentro de 48 horas após a repicagem em frascos de cultivo pequenos e grandes. Quando os frascos recém-semeados foram perturbados, houve uma diminuição na adesão celular, levando a culturas com crescimento mais lento e, às vezes, à ausência de adesão ou crescimento.As células atingiram aproximadamente 80% de confluência em uma semana e formaram uma monocamada entre 10 e 14 dias. Culturas infectadas exibiram sinais de declínio na integridade da forma celular, e o que pareciam ser grandes buracos estava presente nas superfícies celulares 48 horas após a infecção. As células encolheram e se destacaram da superfície de cultura aproximadamente entre 72 e 96 horas após infecção com HOCV-one não diluído. As contagens médias de células vivas foram plotadas para demonstrar as diferenças na abundância de células vivas entre as cargas virais ao longo do tempo. Os grupos com tratamento viral mais alto indicam uma diminuição muito mais acentuada na saúde da cultura, com uma queda acentuada no número de células vivas entre 48 e 72 horas. Enquanto isso, os grupos com carga viral mais baixa declinaram lentamente até cair por volta de 144 horas. A probabilidade de sobrevivência das células inoculadas com tratamentos virais mais altos foi menor, conforme testado por curvas de Kaplan-Meier, o que se correlaciona com as análises de contagem média de células vivas. Embora não significativo, os dados sugerem que células expostas ao vírus têm 88% mais probabilidade de exibir taxas de sobrevivência mais baixas ao longo do tempo. O declínio no número de núcleos presentes, bem como a aparência desfigurada da f-actina nas células expostas ao HOCV-one, indicam um impacto acentuado na cultura. Células saudáveis expostas à carga viral mais alta, de 10, apresentaram maior estresse. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de completar cada etapa do protocolo em tempo hábil, já que algumas etapas são sensíveis ao tempo e à temperatura. Após este procedimento, outros métodos, como ELISA, podem ser utilizados para responder perguntas fundamentais, por exemplo, quanto vírus está presente em um cultivo celular após a inoculação de quantidades variáveis de vírus nesse cultivo? Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar uma linhagem de células de inseto para replicar um vírus de RNA, extrair esse vírus e então quantificá-lo utilizando qRT-PCR.

propagation-homalodisca-coagulata-virus-01-via-homalodisca

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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