Name: Vibratome Seccionamento Rato Retina de Preparar culturas Fotorreceptoras (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Aprenda a isolar a camada de fotorreceptores da retina de camundongo usando vibratome para cultura celular. Este método confiável permite estudar biologia retiniana e explorar terapias para degeneração retiniana hereditária.

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Igal Gery e David Hicks para anticorpos anti-SAG. Ram Fridlich pela leitura do manuscrito.

NOTA: O procedimento foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Darwin Pierre e Marie Curie (CE5 / 2009/048) 1. Preparação da solução de gelatina, Instrumentos, Vibratome, Cultura, Mídia e Cultura Placa <ol><li> Prepara-se uma solução de gelatina a 20% pelo menos um dia antes da experiência. <ol><li> Sob o capô, adicionar 500 mL de gentamicina [10 mg / mL] para um frasco de 500 ml contendo CO 2 forma independente (CO 2 -i). </li><li> Numa proveta separada, adicionar 20 ml de CO2-I (a partir do passo 1.1.1) e aquecer a 95 ° C num bloco de aquecimento com agitação constante durante 15 min. Observar uma mudança de cor para amarelo, indicando que a solução está pronta para utilização adicional. </li><li> Pesar 4 g de gelatina e gradualmente pobre para a solução preparada acima (passo 1.1.2) com o aumento da agitação e aquecimento a 95 ° C durante 45 min, para se obter uma solução de cor amarela. Permitir que a solução de gelatina a arrefecer sobo capuz durante aproximadamente 5 min. </li><li> Pour 4 ml da solução de gelatina de 35 mm em placas de cultura de diâmetro sem introduzir bolhas de ar. Manter o prato a 21 ° C durante 30 min. Cubra os pratos com filme plástico, e transformar os pratos de cabeça para baixo. Opcionalmente, os pratos armazenar a 4 ° C durante até 2 meses antes da utilização. </li></ol></li><li> Prepara-se uma solução de gelatina a 4%. <ol><li> Sob o capô, adicionar 25 ml de CO 2 -i forma de um recipiente de plástico estéril, e aquece-se a 42 ° C num bloco de aquecimento. Remover o meio do bloco de aquecimento e gradualmente adicione 1 g de gelatina para o meio quente e mexa. Retornar rapidamente o recipiente sobre o bloco de aquecimento (42 ° C) e mantê-lo aquecido durante o processo. </li></ol></li><li> Definindo-se o aparelho vibratome: <ol><li> Retirar as placas contendo solução de gelatina a 20% armazenada a 4 ° C. Cortar a gelatina com um bisturi. Vire a fatia de gelatina e colá-la no disco apoio preto do vibratome usando uma gota de scola uper. </li><li> Quebre uma lâmina de barbear em duas metades, e inserir um meio para o vibratome segurando receptáculo. Insira o disco de apoio preto sobre o aparelho vibratome. Ligue o botão preto para o lado direito. Corrigir o receptáculo segurando a cabeça do vibratome. Adicionar uma quantidade suficiente de CO 2 -i meio no tanque de vibratome para cobrir o bloco de gelatina. </li><li> Ligue o vibratome e cortou três fatias de 100 um bloco de gelatina. Manter o bloco de gelatina para utilização posterior. </li></ol></li><li> Preparar 40 ml de meio de cultura: <ol><li> Prepare meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) sob o capô. Prepare 1 mg / ml de poli-D-lisina usando tampão fosfato salino (PBS) pH 7,4. </li><li> Numa placa de 96 poços, adicionar 2 g / cm 2 de Poli-D-Lisina para revestir o fundo dos poços. Incubar a placa durante 45 minutos a 37 ° C dentro de 5% de CO2. Após a incubação, remover PBS e substituir com 200 ul/ Poço de DMEM e novamente lugar a 37 ° C em 5% de CO2 antes de usar. </li></ol></li></ol> 2. Dissecção da Retina Entire <ol><li> Enuclear o mouse: <ol><li> Sacrifique o mouse de acordo com a directiva europeia 2010/63: por deslocamento cervical. Corte a cabeça com curvas-tesoura e coloque-o em uma placa de Petri de diâmetro 100 milímetros, depois de ter desinfectado o olho com desinfetante. </li><li> Remova o olho depois de ter destacado o nervo óptico por seccionamento lo com muito cuidado usando um aperto curvo. Em seguida, colocar ambos os olhos numa placa de 35 milímetros de Petri contendo meio de CO 2 -i estéril a 21 ° C. </li></ol></li><li> Removendo a retina: <ol><li> Fazer um buraco no nível do olho-membro com a ajuda de uma agulha de 18 G, deve ser capaz de introduzir a tesoura para o globo ocular. Introduzir tesoura reta no interior do buraco e cuidadosamente cortada na esclera abaixo da íris em todo o perímetro do globo ocular para remover o corpo ciliar. </li><li&gt; Remover a córnea e a lente e manter a câmara posterior do olho com a retina contígua à esclerótica. Com dois apertos finas, remover o vítreo localizado no interior da câmara posterior, sem danificar a retina. Executar quatro cortes radiais (retina / esclera) para permitir achatamento da retina. </li><li> Aumento do globo ocular e descascá-lo como um &quot;laranja&quot;. Retire a retina da esclera e epitélio pigmentado da retina (EPR). Retire a retina ainda ligado ao nível do nervo óptico com muito cuidado com curvas-tesoura fina. </li><li> Separe o vítreo restante da periferia para o centro da retina com dois apertos finas. Certifique-se de que todo o vítreo é completamente removido para permitir que o achatamento da retina. </li><li> Cortar a extremidade de uma pipeta de plástico e transferir a retina para um diâmetro de 35 milímetros placa de Petri contendo meio de CO 2 -i com a pipeta de plástico. </li></ol></li></ol> 3. Selagem de-Mounte Planod Retina para Gelatin Bloco <ol><li> Remover 20-30 ml de CO 2 médio -i do tanque vibratome (o bloco de gelatina é gratuita) para permitir a vedação de retina flat-montado. </li><li> Transferir a retina para uma lâmina de vidro usando uma pipeta de plástico e adicionar uma gota de meio de CO 2 -i antes de transferir para a fatia de gelatina com o foto-receptor voltado para baixo sobre a fatia de gelatina. </li><li> Encaixe da retina para o bloco de gelatina por injecção aqueceu-se suavemente a 4% de gelatina, de um lado do bloco entre a retina e o bloco de gelatina e simultaneamente expulsar gelatina quente, por outro lado. </li><li> Aspirar 4% de gelatina com uma pipeta de pasteur. Aguarde 10 minutos para permitir a vedação total. Adicionar CO 2 médio -i para mergulhar o bloco ea lâmina completamente. </li></ol> 4. Seccionamento da Retina NOTA: Este passo é crítico para se obter uma camada de células fotorreceptoras sem as outras células da retina (Figura 1). <ol><li> A partir da parte superior sobre o bloco de gelatina, 100 mm cortar secções em série para atingir a retina. Em seguida, retira 100-120 mm secções da camada interior. Dependendo da aplicação, esta camada pode ser descartada ou armazenada em azoto líquido. Assegure-se que a velocidade de vibratome é muito lento (a 1 ou 2), durante o corte das camadas ou camadas interiores fotorreceptores. </li><li> Realizar intermédios 15 mm secções da retina que corresponde à interface entre o interior e exterior da retina. Observe esta seção sob um microscópio. A ausência de vasos sanguíneos indica que a retina externa foi atingido. </li><li> Cortar 200 um da retina externa (a camada de fotorreceptores) com gelatina e transferi-lo para um prato de 35 milímetros de diâmetro cheia com 3 mL de meio de CO 2 -i. Mantê-lo em gelo até são obtidas todas as seções da camada de fotorreceptores de todos os retinas. </li></ol> 5. dissociar as células fotoreceptoras <ol><li> Leve o prato (es) contendo a camada (s) de fotorreceptores e colocá-lo (eles) em uma incubadora a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Usando fórceps suavemente separar a camada de fotorreceptores da gelatina e transferi-lo num prato novo cheio com 3 ml de solução de Ringer. Repita este passo (5.2) para cada preparação camada de fotorreceptores. </li><li> Incubar 2 unidades de papaína com 25 ul de solução de activador (1,1 mM de EDTA; 5,5 mM de L-cisteína; 60 uM β-mercaptoetanol) em 5 ml de um tubo de polipropileno estéril e incubar-lo 30 min a 37 ° C dentro de 5% de CO 2 incubadora . A activação da papaína é conseguida a 37 ° C. Durante esta incubação, cortar a camada de fotorreceptores em 2 milímetros 2 peças (não muito pequenos) e transferir estas peças em um 5 ml tubos. </li><li> Lavar a retina duas vezes com 1,5 ml de solução de solução de Ringer, seguido por sedimentação por gravidade. Remova todo o restante solução de Ringer do tubo com a amostra. </li><li> Adicionar 475 ul de solução de Ringer para o tubo que contém papaína activada e mistura. Adicionar esta solução para o tubo contendo a retina. </li><li> Incubar o tubo com a retina durante 20 minutos a 37 ° C dentro de 5% de CO2. Parar a reacção por adição de 1 ml de FCS a 10% em DMEM. Adicionar 25 L de desoxirribonuclease I (ADNase I) para ADN digerido a partir de células de morte. Homogeneizar cuidadosamente a suspensão de células utilizando uma pipeta de 1 ml. Gire a 50 g durante 6 min em temperatura ambiente. </li><li> Descartar o sobrenadante para remover vestígios de soro e adicionar meio DMEM com suplementos (ver tabela de reagents_equipment específica) para o sedimento de células e ressuspender cuidadosamente a suspensão de células com uma pipeta de 1 ml. Gire a 50 g durante 6 min em temperatura ambiente. Repita este passo (5.7) mais uma vez. </li></ol> 6 A cultura as células fotoreceptoras <ol><li> A camada de fotorreceptores de um rato em PN8 contém cerca de 1-1500000 células utilizando esta técnica. Semente as células fotorreceptoras a 15 x 10 células / cm2 numa placa de cultura com meio de cultura e a cultura das células durante 5 dias a 37 ° C dentro de 5% de CO2. No dia 5, prossiga para imunoquímica e de estudo de acordo com métodos de transferência Western fornecidos pelos anticorpos fornecedores. NOTA: Passos para parar a cultura e os ensaios preliminares são descritos na referência 21. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A retina é um modelo de órgão em biologia. Estudo da retina levou a 6 grandes descobertas em biologia. Ele está na origem do RB1 gene supressor de tumor primeira. Ele revela a ligação molecular entre os receptores tirosina-quinase e da MAP quinase, através da interação com o filho de Sevenless. Ele estava envolvido na descoberta de PAX6, o primeiro gene de controle mestre para morfogênese órgão. É no centro da associação genética do factor H do complemento (CFH) com degeneração macular relacionada com a idade (DMRI), o primeiro gene de susceptibilidade a doença identificado por tela genoma ampla associação (GWAS). Por fim, levou à primeira terapia genética bem sucedida para amaurose congênita de Leber, o primeiro julgamento terapia genética corretiva em humano de qualquer doença hereditária. A estrutura deste órgão é conservada na maioria das espécies de vertebrado. Sua acessibilidade para a manipulação in vivo tem incentivado desde cedo genômica investigações funcionais nesta parte integrante do central sistema nervoso. Mostramos aqui como separar a camada de fotorreceptores na camada interna da retina por vibratome seccionamento. Este passo é crítico para obter culturas puras de fotorreceptores. Nosso protocolo de dissecção torna a contaminação por células RPE muito improvável. Um dos principais desafios é o achatamento da retina que é necessário para a seção corretamente o interior eo exterior retina. O seccionamento da retina é melhor na retina, com pequeno diâmetro como aqueles a partir de roedores e este diâmetro é uma limitação da técnica actual com o material disponível. É aconselhável, antes de iniciar uma experiência biologicamente significativa, para a prática de uma amostra da retina. Nós ilustram o método de obter resultados representativos obtidos a partir de células fotorreceptoras cultivadas, utilizando o material para realizar estudo de ambos os mRNAs e proteínas de expressão. Estudos de expressão também pode ser realizada alternativamente em sections obtido por captura a laser microdissection, mas as culturas são melhor realizadas utilizando vibratome seccionamento. Poderíamos ter usado a técnica de laser de microdissection com uma estratégia completamente diferente. Mas, para recolher a camada de fotorreceptores com o aparelho microdissecação de cultura, que seria necessário para evitar fixador e isto complicaria a metodologia actual significativamente. Estamos desenvolvendo um protocolo que visa estudar a cinética de expressão gênica e protéica em vibratome seções durante a degeneração dos fotorreceptores em modelos de retinite pigmentosa. Acreditamos que a descrição detalhada do protocolo irá ser útil para investigadores no campo da biologia da retina, e mais particularmente para os estudos de proteómica e metabolômicos.

A retina é uma parte integrante do sistema nervoso central que tem uma arquitectura conservado entre os vertebrados. Os neurónios da retina neural são organizadas em camadas, com o mais distante para a luz incidente, a camada de fotorreceptores em estreito contacto com o epitélio pigmentado da retina (EPR) na parte de trás do olho. Bastonetes e cones photorecptors são células sensíveis à luz que dependem de moléculas sensíveis opsina para captura de fótons. Estas moléculas são fechados em membranas de disco com uma estrutura celular de, localizadas no segmento exterior do fotorreceptor, que aponta na direcção do EPR ​​1. Esta estrutura, que é muitas vezes influenciada muito precoce em casos de degenerações fotorreceptoras, é renovada a uma taxa de 10% de todos os dias. A camada interior chamada contém a maioria dos outros neurónios que computam o sinal recebido dos fotorreceptores, o bipolar, amacrine e células horizontais bem como as células ganglionares. Estes últimos com os seus axóniosformar um feixe que é o nervo óptico. Esta camada é tão conservado que os biólogos têm usado o termo deslocado células amácrinas quando as células são encontradas fora da camada plexiforme interna 2. Camadas de neurônios são distribuídos dentro de uma armadura de células da glia radial Müller. Células bipolares fotorreceptores ligar a células ganglionares. Eles estão localizados entre a camada plexiforme externa e a camada plexiforme interna. As células ganglionares formar a camada plexiforme interna em conexão com as células bipolares. As células amacrin são nomeados como células de associação localizados na camada plexiforme interna entre as células bipolares e células ganglionares. A camada plexiforme externa contém células horizontais. Esta combinação única de camadas neuronais do sistema nervoso central permite o isolamento da camada de fotorreceptores na camada celular interna da retina por corte plana montada utilizando um vibratome. Originalmente, esta técnica foi utilizada para isolar fotorreceptores para transplantation no olho do rato RD1, um modelo de retinite pigmentosa humana (RP) 3. O rato RD1 portador de uma mutação recessiva no gene Pde6b que codifica para a subunidade beta da fosfodiesterase específica de haste. Mutações recessivas deste resultado gene em RP em humanos 4. Depois de bastonetes se degeneraram, o paciente perde a visão noturna, e surpreendentemente fotorreceptores cone, que não expressam o gene mutado, degeneram como uma segunda etapa. Porque os cones são necessários para a visão de cores e acuidade visual, os pacientes tornam-se progressivamente cego e um tratamento eficaz para a doença ainda não se desenvolveu. Enxertando camada de fotorreceptores de um rato do tipo selvagem a degeneração cone do mouse anfitrião não for 3,5. As hastes perdida no modelo degenerativa haste de cone não poderia ser substituído por um transplante devido a conexão sináptica entre as hastes e as células bipolares só pode ser obtido numa fase específica de rdesenvolvimento etinal, marcada pelo aparecimento de expressão Nrl 6. A camada de fotorreceptores é introduzido por cirurgia no espaço sub-retinal na retina de RD1-haste menos, entre a EPR e da retina externa que corresponde a apenas 3% dos fotorreceptores restantes, os cones. Duas semanas após a cirurgia, 40% dos cones a partir do animal transplantado com uma camada de fotorreceptores normais sobreviveram, em comparação com o animal transplantado com uma camada normal das células da retina interna, ou para o animal de operação simulada. A topografia do cone de sobrevivência, espalhar-se por toda a superfície da retina mutada localizada na posição do tecido enxertado indica que o efeito protector é devida a uma molécula difusível 7. Em seguida, utilizou-se um sistema de co-cultura, bem como meios de cultura condicionados para validar o facto de que o efeito de protecção baseia-se na secreção de uma proteína por hastes de 8,9. Nossa hipótese é que essa proteína será exprEssed contínua e especificamente por hastes e que a sua morte durante a primeira fase da doença irá desencadear cone degeneração secundária pela perda de um sinal de proteção das hastes de forma autónoma não-célula 10. Devido à importância de cone mediada visão central nos primatas desta proteína putativa vai ser uma ferramenta terapêutica altamente relevante para o PR. Preservar os cones em RP teoricamente impedir que um total de 1,5 milhões de pacientes em todo o mundo para tornar-se cego 11. Nós usamos uma abordagem de alta triagem de conteúdo e um modelo de cultura enriquecido com cone para identificar um cDNA que codifica Rod derivado Cone Viabilidade Factor (RdCVF) a partir de uma biblioteca de cDNA da retina 12. RdCVF é o produto de splicing do gene NXNL1 que, curiosamente é homólogo ao gene que codifica para proteínas envolvidas em tioredoxina homeostase redox 13. O segundo produto de splicing do gene, RdCVFL é uma enzima que protege o seu objectivo, a proteína TAU contra oxidativo dAmage 14. A administração de RdCVF impede a degeneração secundária de cones e a perda de sua função visual em um recessivo, e modelo dominante de RP 12,15. Isso demonstra dois aspectos importantes desta estratégia terapêutica inovadora 16. Em primeiro lugar, ela pode ser aplicada na maioria dos casos de PR de uma forma independente do gene. Em segundo lugar, ao contrário do factor de sobrevivência de CNTF concorrente, RdCVF está associada com a manutenção da função visual 17. A ausência de efeito funcional pode explicar a razão da ausência de benefícios clínicos da administração de CNTF a pacientes RP 18. RdCVF é mais provável que um dos sinais de sobrevivência importante entre os cones e bastonetes desde resgate cone in vitro é inibida por RdCVF imunodepleção 12. Além disso, a ruptura do gene de viabilidade cone derivado de haste conduz a disfunção fotoreceptoras e susceptibilidade ao estresse oxidativo 19. O uso decamada de fotorreceptores está na origem da identificação de RdCVF e de um sinal de redox novo envolvido em doenças neurodegenerativas 20. Este manuscrito descreve o protocolo utilizado para o isolamento e cultura de células a partir da camada de fotorreceptores para caracterizar a actividade de RdCVF. Os fotorreceptores podem ser mantidas em cultura durante 5 a 7 dias 21. Esta técnica também pode ser utilizada para estudar a expressão de genes específicos fotorreceptoras.

<table><tbody><tr><td>Citidina 5&prime;-difosfocolina*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0256</td><td>4.7 &micro; M Citidina 5&prime;-difosfocolina</td></tr><tr><td>Citidina 5&prime;-difosfoetanolamina*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0456</td><td>2.7 &micro; M Citidina 5&prime;-difosfoetanolamina</td></tr><tr><td>Linole&iuml; ácido c/ albumina de soro bovino (BSA)*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8384</td><td>100 &micro; g/ml de linole; ácido c/ albumina de soro bovino (BSA)</td></tr><tr><td>Triiodo-L-thyronine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td>0.03 &micro; Placas de 96 poços de triiodo-L-tironina</td></tr><tr><td></td><td>Greiner bio-one</td><td>655-095</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio binocular</td><td>Leica</td><td>MZ-75</td><td></td></tr><tr><td>CO2 independente (CO2-i)</td><td>Life Technologies</td><td>18045054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps n&deg; 5 Dumont</td><td>Bionic</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de pele porcin tipo A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td></td></tr><tr><td>GeneChip&nbsp;</td>Solução de Gentamicina <td>Affymetrix</td><td>U74v2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies</td><td>15710049</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>0.55 &micro; M hidrocortisona</td></tr><tr><td>Insulina* (I)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0,86 &micro; M insulina (I)</td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Worthington-biochem</td><td>WOLS03124</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6407</td><td></td></tr><tr><td>Progesterona*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7556&nbsp;</td><td>2.0 &micro; M progesterona</td></tr><tr><td>Prostaglandina*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5172</td><td>0.28 &micro; M prostaglandina</td></tr><tr><td>Putrescina *</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P5780</td><td>182 &micro; M putrescine</td></tr><tr><td>Bisturi Albion</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura</td><td>Moria</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>1 mM piruvato de sódio</td></tr><tr><td>Selenito de sódio* (S)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0.29 &micro; M Na2SeO3&nbsp; &nbsp; (S)</td></tr><tr><td>Taurina*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td>3 mM taurina</td></tr><tr><td>Transferrina* (T)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1884 (ITS)</td><td>0.07 &micro; M transferrina (T)</td></tr><tr><td>Aparelho vibratomo</td><td>Leica</td><td>VT1000-S</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Suplementos</td></tr></tbody></table>

vibratome seccionamento rato retina de preparar culturas fotorreceptoras

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

A retina é uma parte do sistema nervoso central que tem organizado arquitectura, com neurónios nas camadas de fotorreceptores, ambos os cones e bastonetes em contacto com o epitélio pigmentado da retina, na parte mais distante na retina, considerando a direcção da luz, ea as células ganglionares da distância mais proximal. Esta arquitectura permite que o isolamento da camada de fotorreceptores por vibratome seccionamento. A retina neural dissecado de um rato com idade entre 8 dias é flat-incorporado em 4% de gelatina em cima de uma fatia de 20% de gelatina camada de fotorreceptores voltado para baixo. Usando um vibratome e uma lâmina de barbear de dois gumes, o 100 um retina interna de espessura é segmentado. Esta secção contém as células ganglionares e a camada interna com nomeadamente as células bipolares. Uma seção intermediária de 15 mm é descartada antes de 200 mm da retina exterior que contém os fotorreceptores é recuperado. A gelatina é removido por aquecimento a 37 ° C. Pedaços de camada externa são incubated em 500 ul de solução de Ringer com 2 unidades de papaína activada durante 20 minutos a 37 ° C. A reacção é parada pela adição de 500 ul de 10% de soro fetal de vitelo (FCS) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), em seguida, 25 unidades de ADNase I é adicionado antes da centrifugação à temperatura ambiente, lavou-se várias vezes para remover o soro e as células são ressuspensas em 500 ul de DMEM e semeadas a 1 x 10 5 células / cm2. As células são cultivadas até 5 dias in vitro e a sua viabilidade registados com vivo / morto ensaio. A pureza da cultura é determinado em primeiro lugar por meio de observação microscópica durante a experiência. A pureza é validada por semeadura e que fixa as células em uma lâmina histológica e análise utilizando um policlonal de coelho anti-SAG, um marcador de fotorreceptores e rato monoclonal anti-RHO, um marcador específico para fotorreceptores. Alternativamente, a camada de fotorreceptores (97% de bastonetes) pode ser usado para a análise da expressão do gene ou de proteína e de transplante.

Além de transplante, as camadas fotorreceptoras também têm sido utilizados para estudar a sinalização celular por sementeira de células para fazer as culturas de fotorreceptores 12,22. Além disso, eles são utilizados para estudar a expressão de genes e ritmo circadiano 23,24. Usámos a camada de fotorreceptores célula de um ratinho de tipo selvagem ao dia pós-natal 8 para preparar culturas de fotorreceptores na ausência de FCS e as células mantidas durante 5 dias a 37 ° C numa incubadora com 5% de CO 2 (Figura 1E ). As células foram então fixadas com 4% e, em seguida, procedeu paraformadehyde para análise imunocitoquimica utilizando métodos proporcionados pelos fornecedores de anticorpos quer com anticorpo monoclonal anti-RHO (1: 250, Millipore Mab5316) ou anticorpo policlonal de coelho anti-SAG (1: 200, uma generosa dom de Igal Gery e David Hicks). Usamos anti-RHO e anti-SAG (embora anti-SAG cones de etiqueta e varetas), devido ao fato de que o anti-SAG é um marcador mais precoce, do que anti-RHO. A proporção de cells positivos para o anticorpo anti-RHO é menor do que daqueles positivos para os anticorpos anti-SAG (Figura 2). Isto pode ser explicado pelo fato de que a SAG, a haste arrestina é também expresso por cones que tornam 3% de fotorreceptores na camada isolado, ou, alternativamente, pelo facto de durante a maturação pós-natal da retina, a expressão de SAG que precede de RHO 25,26. A camada de fotorreceptores foi também utilizado para controlar a expressão de genes específicos por fotorreceptores do tipo selvagem retina e do cérebro de animais com 35 dias de ARN foram preparadas utilizando ultracentrifugação em CsCl 27 e hibridaram com chip de ADN de matriz de rato. Os mensageiros de rodopsina (Rho), S-arrestina (Sag) e cone-transducina (Gnat2) são especificamente expressos na retina, em comparação com o cérebro (Figura 3A). A expressão é proeminente na camada de fotorreceptores (PR) do que em toda a retina, que englobaa camada interna da retina, mostrando que estes genes são expressos na verdade por fotorreceptores. Para Gnat2, a expressão relativa, em comparação com Rho e Sag mostra que ela é expressa por cones contidos na camada de fotorreceptores isolado. A expressão de recoverin (Rcvrn) na camada de fotorreceptores, em comparação com toda a retina é aumentada (Figura 3B). A camada de fotorreceptores foi também utilizado para controlar a expressão de RHO e western blotting utilizando GNAT2 seguinte métodos proporcionados pelos fornecedores de anticorpos e para comparar com a camada interior da retina (Figura 4). Observe a ausência de RHO e GNAT2 28, os marcadores de cones e bastonetes, respectivamente, em toda a retina e na retina do RD1 mouse no dia pós-natal 35. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig1highres.jpg"> Figura 1. Representação esquemática do corte vibratome de rato retina. (A) Montagem da retina plana montada com o foto-receptor voltado para baixo sobre a fatia de gelatina. (B) Secção da retina interna com a lâmina vibratome. (C) Secção da retina externa adicional de gelatina. (D) Controlo de a presença de fotorreceptores na extremidade do fragmento de retina após o isolamento da camada de fotorreceptores. Barra de escala utilizada para fluorescência verde é usado de um microscópio de luz branca. Os fotorreceptores estão localizados na margem da figura. (E) células fotorreceptoras Cultivadas (pós e cinco dias). (F) Maior ampliação de painel E. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" width="550"> Figura 2. A expressão diferencial de RHO e SAG na cultura do mouse fotorreceptores. (A) A coloração de núcleos (azul), (B) coloração SAG (verde), (C) coloração RHO (vermelho). (D) Mesclado imagem. Porque coloração da SAG é expresso mais cedo do que a coloração RHO, apenas duas células são duplamente marcada SAG e RHO (veja *). Barra de escala:. 23 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig3highres.jpg"> Figura 3. Comparação da expressão de três genes em cérebro inteiro e retina e fotorreceptores dos animais de tipo selvagem com idades compreendidas entre 35 dias. (A) A rodopsina (Rho), S-arrestin (Sag) e cone-transducina (Gnat2). (B) Calbindina (Calb1) e Recoverin (Rcvrn). Os dados são apresentados como a expressão relativa. A expressão relativa é um valor da expressãoobtido a partir de dados de microarranjos após normaliszation com o software robusto multi-array Average (RMA) disponíveis no banco de dados de conhecimento KBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" width="400"> Figura 4. Expressão de RHO e GNAT2 na retina externa a partir de uma retina do tipo selvagem no dia pós-natal 35. Ausência de sua expressão na retina interna e na retina do rato RD1 em pós-natal dia 35. ACTB, beta actina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Retina neural de um rato com idade entre 8 dias é em cima de um bloco de gelatina 4%. Após o isolamento da camada de fotorreceptores (200 mm) por vibratome, as células fotorreceptoras são cultivadas após dissociação enzimática e mecânica para a cultura. A camada de fotorreceptores pode ser utilizado para análises moleculares, bioquímicas ou transplante.

Vibratome Seccionamento Rato Retina de Preparar culturas Fotorreceptoras

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar a camada fotorreceptora do camundongo. Para a cultura, o primeiro passo é obter uma retina plana completa e selá-la em um bloco de gelatina. Em seguida, as camadas da retina são cortadas com sucesso para isolar a camada fotorreceptora.A etapa final é semear células fotorreceptoras purificadas em cultura. Em última análise, a pureza da camada fotorreceptora é confirmada por microscopia e imunofluorescência, seguida por teste de fator de viabilidade de cone derivado de bastonetes. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a micro dissecção a laser, é isolar com segurança a camada fotorreceptora.As implicações dessa tecnologia se estendem à terapia da degeneração retiniana hereditária. Como é muito conveniente estudar a biologia dos fotorreceptores, originalmente desenvolvemos esse método para estudar a interação celular entre os fotorreceptores bastonetes e frios. O transplante de fotorreceptores de camada no olho do início do primeiro ano levou à identificação de todos os fatores de viabilidade derivados.A demonstração visual desses métodos é crítica, pois a oportunidade da retina plana da montanha é difícil de executar porque é complicada. Antes de isolar a retina, prepare o vibrato. Comece com pratos de solução de gelatina a 20% retirados do armazenamento a quatro graus Celsius.Corte a gelatina com um bisturi, depois vire a fatia de gelatina e cole-a no disco de suporte preto do vibrador usando uma gota de super cola. Em seguida, quebre uma lâmina de barbear em duas metades e insira uma metade no vibrador. Em seguida, insira o disco de suporte preto no aparelho vibrador e gire o botão preto para a direita.Agora, prenda o receptáculo de retenção na cabeça do vibrato e cubra o bloco de gelatina com meio independente de CO2. Ligue o vibrato para testar a configuração. Corte três fatias de 100 mícrons até que o corte fique liso e as fatias planas sejam produzidas.Depois de colher os olhos de um camundongo e outras preparações, isole a retina. Primeiro, use uma agulha de calibre 18 para fazer um orifício no nível do membro do olho. Em seguida, para remover o corpo ciliar, insira uma tesoura reta através do orifício e no globo ocular e corte cuidadosamente a esclera abaixo da íris e, em seguida, ao longo do perímetro do globo ocular.Em seguida, mantenha a parte posterior do olho com a retina contígua à esclera e remova a córnea e o cristalino. Com duas alças finas, remova o vítreo, que está preso à retina sem danificar a retina para que a retina possa ser plana. Faça quatro cortes radiais nele.Agora vire o globo ocular e descasque-o como uma laranja. Em seguida, com muito cuidado com uma tesoura reta fina. Descole a retina da esclera e do epitélio pigmentado da retina.Ele deve permanecer preso ao nível do nervo óptico usando alças finas, destacar o vítreo restante começando na periferia e movendo-se em direção ao centro da retina. Com todo o vítreo completamente removido, a retina ficará achatada. Agora transfira a retina para uma placa de Petri de 35 milímetros de diâmetro.O processo de selagem da retina plana no bloco de gelatina é delicado e fundamentalmente o aspecto mais desafiador para seccionar o tecido. Em primeiro lugar, remova 20 a 30 mililitros de meio do tanque vibram. Em segundo lugar, transfira a retina para uma lâmina de vidro usando uma pipeta de plástico de diâmetro largo e aplique uma gota de meio independente de CO2 na lâmina.Em terceiro lugar, transfira a retina para uma fatia de gelatina com um fotorreceptor voltado para baixo. Em quarto lugar, anexe a retina ao bloco de gelatina. Injete suavemente gelatina quente a 4% em um lado do bloco entre a retina e o bloco de gelatina e expulse a gelatina para o outro lado.Por fim, aspire a gelatina com uma pipeta de vidro e espere de sete a 10 minutos enquanto a retina é selada no bloco. Agora adicione o meio independente de CO2 de volta ao tanque e mergulhe o bloco e a lâmina para seccionar a partir do topo do bloco de gelatina. Corte seções seriais de 100 mícrons até que a lâmina atinja a retina.Em seguida, usando uma velocidade muito lenta, como um ou dois cortes de seções de 100 a 120 mícrons da camada interna da retina. Dependendo da aplicação, essa camada pode ser descartada ou armazenada em nitrogênio líquido, mantendo a velocidade lenta na interface entre a camada interna e externa. Pegue seções de 15 mícrons.Examine essas seções ao microscópio quanto à presença de vasos sanguíneos. Quando não há nenhum, a retina externa foi alcançada através da camada externa. Corte lentamente seções de 200 mícrons.Transfira essas fatias para um prato de 35 milímetros com três mililitros de meio frio independente de CO2 mantido no gelo. Prossiga com a coleta de todas as seções da camada fotorreceptora de todas as retinas a serem seccionadas para este prato. Comece transferindo os fotorreceptores fatiados para uma incubadora de 37 graus Celsius por 10 minutos.Em seguida, usando uma pinça, separe delicadamente cada camada fotorreceptora da gelatina e transfira-as para um novo prato cheio de três mililitros de solução de ringer em temperatura ambiente. Uma vez isolados todos os fotorreceptores da gelatina, combinar duas unidades de papaína com 25 microlitros de solução ativadora em um tubo estéril de polipropileno de cinco mililitros e incubado por 30 minutos. Para ativar a papaína durante esta incubação, corte as fatias da camada fotorreceptora em pedaços quadrados de dois milímetros e não muito menores.Transfira essas peças para um tubo de cinco mililitros com 1,5 mililitros de solução de campainha. Em seguida, aspire as campainhas e substitua-as por uma segunda lavagem. Aguarde até que todas as fatias assentem por gravidade, sedimentação e, em seguida, remova toda a solução de campainha restante do tubo.Em seguida, adicione 475 microlitros de solução de campainha ao tubo que contém a papaína ativada e misture. Transfira esta mistura para o tubo que contém as fatias e incube-as por 20 minutos. Após 20 minutos, interrompa a digestão da papaína adicionando um mililitro de 10% FCS em DMEM.Em seguida, adicione 25 unidades de D Ns.One para digerir o DNA das células fotorreceptoras que morreram, homogeneizar cuidadosamente a suspensão com pipetagem para palatinar as células fotorreceptoras. Girar o tubo a 115 Gs durante seis minutos à temperatura ambiente, rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em DMEM suplementado com uma pipeta de um mililitro. Repita isso, gire e susus suspensão. Uma vez.Agora, a partir do olho colhido, uma a 1,5 milhão de células devem estar prontas para semear. Semeá-los a 100.000 células por centímetro quadrado e cultivá-los por cinco dias antes das aplicações a jusante Usando os métodos descritos, culturas de células fotorreceptoras foram feitas de camundongos do tipo selvagem no oitavo dia pós-natal. Sem FCS, as células foram fixadas e coradas para anti-fileira ou um marcador anti-flacidez anterior.Menos células foram positivas para anti-fileira, uma vez que o SAG precede a expressão de ROE. Fotorreceptores também foram preparados a partir de camundongos de 35 dias de idade para examinar a expressão de mRNA, de RO sag e do cone transduzindo GA dois. Esses genes se expressam de forma mais proeminente nos fotorreceptores em comparação com todo o cérebro.G NAT dois é especificamente expresso por cones. A expressão proteica de RO e g. NAT dois nos fotorreceptores foi examinada comparando as células da camada fotorreceptora com as células da camada interna da retina.Isso foi feito com camundongos selvagens e com camundongos mutantes RD. Os camundongos mutantes não mostraram expressão de nenhuma das proteínas no dia 35. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter uma camada fotorreceptora purificada adequada.Esta técnica pode ser feita em cerca de cinco a seis horas por quatro a oito retinas se for realizada corretamente após este procedimento. Além disso, métodos como o sangue ocidental podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a expressão de proteínas durante a degeneração dos fotorreceptores após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia da retina estudarem o transcrito, o proteoma e o metabolismo de modelos animais relevantes.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui nós descrevemos uma técnica de custo-benefício para a cultura de retina organotípicas suína adulto por sete dias. Resumidamente, um papel estéril filtro foi utilizado para levantar a retina neural fora do RPE e do lado coloque fotorreceptoras em cima uma inserção levantadas por um carrinho feito por encomenda.

Cultura organotípicas de Full-espessura Retina Porcina Adulto

Este protocolo descreve uma maneira simples e barata para quantificar a atividade de cis-regulatórias elementos (ie, enhancer / promotores) na vida retinas do mouse via eletroporação explante. Preparação de DNA, a dissecção da retina, eletroporação, a cultura de explantes de retina, e pós-fixação análise e quantificação são descritos.

Quantificar a atividade de Cis Elements-Regulação na retina do rato por Eletroporação Remoção

Este vídeo demonstra uma técnica de patch-clamp de célula inteira para registro eletrofisiológico de uma retina de camundongo de montagem plana. Uma pipeta de vidro fina com um eletrodo é usada para abordar as células amácrinas starburst (SACs) dentro da retina. Depois de formar uma vedação, a sucção é aplicada para romper a membrana e formar a configuração de patch clamp de célula inteira. Finalmente, o fluxo de íons através dos receptores sinápticos SAC é medido usando a configuração.

Estabelecendo um grampo de remendo de célula inteira para registro eletrofisiológico de uma retina de camundongo de montagem plana

O protocolo descrito aqui é para avaliação estrutural de uma preparação retiniana de montagem total. Isso inclui descrições de dissecção tecidual, montagem em uma inserção de membrana de politetrafluoretileno (PTFE) hidrofilizada, carregamento em bolus com marcadores fluorescentes e uma comparação da fixação com carbodiimida e paraformaldeído para análise imuno-histoquímica de componentes celulares e sinápticos.

Protocolo otimizado para preparação de montagem total da retina para imagem e imuno-histoquímica

Demonstraremos como preparar fatias de retina do olho do camundongo e registrar as respostas à luz nos neurônios da retina. Todo o procedimento é realizado em condições adaptadas ao escuro.

Gravação Light-provocou respostas pós-sinápticos nos neurônios em Dark-adaptados, Preparações da retina do rato fatia usando técnicas Grampo patch

Nós descrevemos um protocolo para acompanhar a dinâmica de Ca2 + nos terminais do axônio de cones fotorreceptores, utilizando uma preparação fatia ex-vivo da retina mouse. Este protocolo permite que os estudos exaustivos sobre cone Ca 2+ sinalização em um importante sistema de modelo de mamífero, o rato.

Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

Nós desenvolvemos uma preparação fatia horizontal da retina de mamífero adulto com o plano de corte paralelo à superfície da retina. campos dendríticos de neurônios da retina orientados nonradially não foram truncados, permitindo o estudo do processamento de sinal com técnicas de patch-clamp e de imagem.

Preparação de horizontais Fatias de rato adulto Retina de Estudos eletrofisiológicos

Este protocolo apresenta duas técnicas para isolar os compartimentos subcelulares de fotorreceptores de haste murina para análise de proteínas. O primeiro método utiliza papel filtro de retina viva e celulose para separar segmentos externos da haste, enquanto o segundo emprega retina liofilizada e fita adesiva para descascar camadas internas e externas do segmento.

Dois métodos de descascamento para o isolamento de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas

Este trabalho apresenta uma preparação alternativa de retina flatmount na qual a remoção de corpos celulares fotorreceptores permite uma difusão mais rápida de anticorpos e um melhor acesso da pipeta de remendo aos neurônios internos da retina para experimentos de imunohistoquímica, hibridização in situ e eletrofisiologia.

Split Retina como uma Preparação Flatmount Melhorada para o Estudo de Neurônios da Camada Nuclear Interna na Retina de Vertebrados

Um protocolo para preparar criossecções de retina de camundongos e realizar imunocoloração em fotorreceptores é descrito. Este artigo permite que os pesquisadores produzam consistentemente seções congeladas de retina de camundongos com morfologia bem preservada e resultados de imunocoloração de alta qualidade.

Crioseccionamento e imunocoloração da retina de camundongos

A retina exibe uma organização espacial complexa em toda a sua estrutura laminar. As técnicas modernas de transcriptômica espacial e sequenciamento requerem seções de tecido &lt; 20 μm de espessura, limitando sua aplicabilidade na pesquisa da retina. Este método de crioseccionamento recém-congelado produz seções finas na face da retina do camundongo, preservando as relações espaciais planares, permitindo um mapeamento molecular abrangente entre as lâminas.

En face Crioseccionamento de retina de camundongo para análise molecular espacial de alta dimensão

Aprenda a isolar a camada de fotorreceptores da retina de camundongo usando vibratome para cultura celular. Este método confiável permite estudar biologia retiniana e explorar terapias para degeneração retiniana hereditária.

Vibratome Seccionamento Rato Retina de Preparar culturas Fotorreceptoras

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