A transfecção altamente eficiente de THP-1 por macrófagos humanos Nucleofection

O objetivo geral deste procedimento é transfectar de forma confiável macrófagos humanos THP one com alta viabilidade celular e sem ativação celular. Isso é feito primeiro pré-diferenciando monócitos THP um por 48 horas. O segundo passo do procedimento é separar os macrófagos prematuros de TP um.

O terceiro passo é transfectar as células com IRNA ou DNA plasmidial, usando a tecnologia de fator nucleo de lonza. As etapas finais são semear novamente e diferenciar ainda mais as células. Em última análise, o knockdown ou superexpressão de genes bem-sucedido pode ser mostrado por meio de PCR quantitativo em tempo real, Western blot back e assim por diante.

A principal vantagem desta técnica em comparação com outras abordagens de transfecção, como a lipofecção, é que podemos alcançar alta eficiência de transfecção juntamente com alta viabilidade celular, e que não alteramos a função e o comportamento dos micrófagos. Infelizmente, esta técnica não é adequada para aplicações de alto teor de putação, pois nenhuma transfecção mais intensa pode ser realizada por vez Para este protocolo. Ter cultivado células THP um em RPMI 1640 com 10% FCS e com 1% de glutamina L estreptocócica 24% antes da transfecção dividir as células e fornecer-lhes meios frescos.

No dia seguinte. Pré-diferencie as células semeando 10 a 15 milhões de células em um frasco de tecido de 75 centímetros quadrados com as seguintes adições ao meio RPMI suplementado, 1% de aminoácidos não essenciais, 1% de piruvato de sódio, 10 nanogramas por mililitro, PMA e 50 micromolar beta mercaptoetanol após 48 horas, aspire o meio e substitua-o por seis mililitros de Accutane. Um aqueceu a 37 graus Celsius para separar as células.

Incube-os por 30 minutos durante a incubação. Preparar meio de transfecção e meio de cultivo suficientes para o cuidado pós-núcleo das células. Após 30 minutos, verifique se as células estão separadas e olhe em volta.

Se algumas células ainda estiverem presas, bombeie suavemente o frasco com uma micropipeta ou use agitação simples para soltá-las. Não use um raspador. Transferir a suspensão para um tubo de 15 mililitros e centrifugá-los durante cinco minutos a 300 Gs e à temperatura ambiente, remover o sobrenadante por aspiração e ressuspender o sedimento celular.

Em um mililitro de RPMI, pré-aquecimento médio a 37 graus Celsius, conte as células e faça alíquotas de micro tubos de lixo contendo dois a dois milhões e meio de células para transfecção imediata. Uma execução rápida deste protocolo é essencial. Para evitar a perda de fatalidade celular, certifique-se de ter todos os materiais preparados com antecedência Primeira centrífuga, todas as alíquotas de transfecção por 10 minutos a 250 GS e à temperatura ambiente enquanto estão girando, carregue todos os veterinários efetores de núcleo com meio micrograma de DNA de plasmídeo ou um micrograma de RNA SI Use diluição altamente concentrada para que ocupem um volume mínimo do veterinário.

Agora aspire o sobrenadante de apenas uma das alíquotas celulares resus. Suspenda as células a 100 microlitros em solução de fator nucleo. Não deixe as células expostas à solução por mais de 15 minutos.

Transfira as células para o veterinário Q e misture-as com batidas suaves. Em seguida, transfecte as células usando o programa Y 0 0 1 em um fator de núcleo B modelo dois. Usando uma pipeta descartável, mova as células eletroporosas para um frasco de reação e adicione imediatamente meio mililitro de meio de transfecção pré-avisado às células.

Agora continue repetindo o processo com cada alíquota de células, uma a uma, até que todas sejam transfectadas. Depois de completar a afecção do núcleo, transfira cada transfecção de células para um poço de uma placa de seis poços com 2,5 mililitros de meio de transfecção quente. Misture bem cada poço com uma micropipeta.

Depois de deixar todas as placas carregadas incubarem por quatro horas, verifique o status das células ao microscópio. Após quatro horas, a maioria das células deve ser aderida à placa, se necessário. No máximo.

Outra hora de incubação fornecerá sahe suficiente trabalhando bem um de cada vez. Aspire o meio de transfecção das células aderidas e substitua-o por um volume igual de meio de cultivo quente. Tenha cuidado para evitar separar as células durante esta etapa.

Agora, incube as células pelo tempo que for necessário. Se necessário, substitua os meios a cada 48 horas e planeje aplicar os tratamentos para que terminem quando o DNA ou RNA transfectado estiver em seu efeito máximo. Ao tratar as células com efetores, use um meio livre de soro sem PMA e sem beta mercaptoetanol.

Tenha cuidado para não deixar as células incubarem por mais de 24 horas sem soro. O protocolo foi utilizado para transfecto, foram avaliados macrófagos THP um com morfologia celular IRNA. De acordo com a medição por citometria de fluxo.

A taxa de apoptose e necrose nas células foi baixa nas culturas transfectadas e controle. No entanto, contagens cuidadosas revelaram que tanto a apoptose quanto a necrose foram ligeiramente maiores para as amostras transfectadas. Isso pode ser porque os macrófagos THP one transfectados eram mais difíceis de se separar das placas do que as células transfectadas UNT.

No geral, as taxas de transfecção estavam acima de 90%, conforme analisado por citometria de fluxo. O uso da eficiência de transfecção fluorescente S-I-R-N-A também foi confirmado por microscopia de fluorescência. A funcionalidade da transfecção foi demonstrada pelo knockdown genético da expressão de IL 10 RB.

Usando RNA de interferência curto Uma vez dominado, o transfecto pode ser realizado em uma a uma hora e meia se for realizado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o meio de cultura tem uma influência considerável no desempenho. Isso é descrito no protocolo de texto.