Name: Uma Experimental e Bioinformática Protocolo de Análises de RNA-seq de fotoperiódicas diapausa no Tigre Asiático Mosquito, Aedes albopictus (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: Explore análises de RNA-seq computacionais para identificar genes diferencialmente expressos em Aedes albopictus durante diapausa fotoperiódica. Este protocolo integra bioinformática e biologia molecular para estudar adaptações ecológicas em organismos não-modelo.

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health grant 5R21AI081041-02 e pela Universidade de Georgetown.

1. larval criação de duas A. Grupos albopictus à Idade Adulta <ol><li> Definir dois armários de fotoperíodo com iluminação programável a 21 ° C para a expressão diapause óptima 16 e cerca de 80% de umidade relativa. <ol><li> Programa de um gabinete para a 16L: luz 8D: ciclo escuro (a não diapausa induzindo LD fotoperíodo). Defina o segundo armário para um 8L: 16D luz: ciclo escuro (diapausa induzindo) 13. </li><li> &#39;Luzes sobre&#39; programa ao mesmo tempo em ambos os armários para sincronizar o tempo circadiano entre fotoperíodo. </li></ol></li><li> Calcular a quantidade de ovos necessários para a realização da experiência. Apontar para 300-500 ovos por gaiola. Pelo menos três réplicas gaiolas diapausa e três réplicas de diapausa gaiolas não são necessários para a produção de ARN. Isso totaliza até cerca de 1,800-3,000 ovos por experimento. <ol><li> Chocar os ovos, submergindo papéis de ovos em cerca de 500 ml de H 2 O. deionizada </li><li> Adicionar &lt;em&gt; ca. 1 ml suspensão alimento que consiste em alimentos para cães chão e camarão de água salgada, como descrito anteriormente 24. Cubra o recipiente com malha, e manter a malha no lugar com um elástico. </li><li> Coloque no gabinete LD fotoperíodo durante cerca de 24 horas. </li></ol></li><li> Transferência larvas eclodidas de 10 x 10 x 2 cm, de Petri pratos cheios com cerca de 90 ml de água desionizada H 2 O. <ol><li> Manter cerca de 30 larvas por prato. Larvas de limpar pratos a cada 48-72 hr transferir, por exemplo, todas as segundas, quartas e sexta-feira (MWF) 24. </li><li> Alimentação de cerca de 1 ml suspensão alimento que consiste em alimentos para cães chão e camarão de água salgada em água deionizada cada MWF como descrito anteriormente 24. </li></ol></li><li> Configurar 3-4 gaiolas adultos para cada tratamento fotoperíodo, onde cada gaiola compreende uma réplica biológica. <ol><li> A partir de lados opostos de 9,5 L baldes, cortar um 10-a-14 centímetros buraco, e um outro furo, com 15 cm de diâmetro. CoVer o primeiro com malha. Cortar aproximadamente um comprimento de um pé da meia ortopédica, e cola uma extremidade em torno do interior do outro furo. </li><li> Corte a ponta do pé da meia off e nó fechado - aberto apenas quando o acesso ao interior da gaiola é necessário. Para a tampa gaiola, cortar todo o interior, deixando apenas o aro, e substituir o plástico interior com malha 24. </li><li> Observe o fotoperíodo, replicar número, gaiola data de início, e outras informações relevantes para o experimento com marcador permanente no lado da gaiola. </li></ol></li><li> Alinhar a parte inferior das gaiolas adultos com papel de filtro molhado. Humedecer o papel de filtro com água desionizada suficiente H2O para aumentar a humidade local na gaiola, mas evite a água de pé, que pode estimular a oviposição sobre o papel de filtro 24. Verifique o filtro de papel por dia, durante a secagem, re-molhado quando necessário. </li><li> Para produzir ovos suficientes para uma biblioteca de RNA, incluir, pelo menos 100 mulheres / 9.5 L cage, com não mais de 500 mosquitos por gaiola. </li><li> Recolha MWF pupas e coloque em um copo pequeno de H 2 O limpo a uma densidade de não mais de 50 pupas por 25 ml de H 2 O. Transfira o copo pupas de uma gaiola de adulto. Coloque as gaiolas no respectivo gabinete de fotoperíodo - A. albopictus pupas são fotossensíveis 15. </li><li> Certifique-se de diário que H 2 O em copos é limpo e claro, e remover pupas morto, porque a acumulação de pupas mortos pode causar mortalidade em massa. Retirar H 2 O copos depois de todos pupas emergir. </li><li> Coloque passas orgânicas na parte superior da gaiola de malha para fornecer açúcar para adultos emergiram. Monitorar passas, e alterá-las a cada 3-5 dias para evitar o acúmulo de mofo. </li></ol> 2. Manutenção de Adultos para Permitir acasalamento e produção de ovos <ol><li> Manter gaiolas com alta umidade (aprox. 80%), forrando o fundo da gaiola com um papel de filtro umedecido, e fornecer acesso a passas não mofados, como descrito acima (Sections 1,5 e 1,9). </li></ol> 3. Sangue-feeding <ol><li> Prepare-se para as fêmeas de sangue de alimentação entre dois a seis dias após a eclosão de garantir que as fêmeas foram expostos a pelo menos oito dias curtos inequívocas antes oviposição começa por quase 100% dos ovos de diapausa 14. </li><li> Prepare o sistema de alimentação Hemotek membrana. Ligue as unidades de alimentação à fonte de alimentação. Ajustar a temperatura de cada unidade a 37 ° C, utilizando o parafuso de ajustamento. Usar um termómetro electrónico e sonda para medir a temperatura da unidade de alimentação durante a calibração. </li><li> Prepare o reservatório de alimentação. Estique uma praça de alimentação membrana de colágeno sobre a abertura do reservatório de alimentação e fixe-a com um anel-O. Retire cuidadosamente os cantos para remover rugas; aparar o excesso de membrana com uma tesoura. NOTA: membrana de colagénio pode não funcionar bem para todas as espécies de mosquitos, e pode ser necessário tentar vários tipos para encontrar a membrana óptima se trabalhar com umexceto A. espécies albopictus. Parafilm funciona bem com o Culex pipiens. <ol><li> Se o sangue é armazenado congelado, descongelar à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hr antes de usar. </li><li> Mantenha o reservatório de modo a membrana está voltada para baixo, sem suporte e os orifícios de enchimento estão voltados para cima. Usar uma pipeta ou uma seringa para encher o reservatório com cerca de 3 ml de sangue total a partir de galinhas que tem o citrato de sódio como anti-coagulante. Selar orifícios de enchimento com tampões de plástico. </li></ol></li><li> Anexar o reservatório preparado para o alimentador rodando no pino na placa de transferência de calor na parte inferior do alimentador. Inverta o alimentador e coloque-o em cima da gaiola, lado membrana para baixo, de modo que os mosquitos podem se alimentar através da malha da gaiola. Mantenha o alimentador na gaiola durante cerca de 45 minutos para maximizar a alimentação. </li></ol> 4. Estimular a oviposição <ol><li> Quatro a cinco dias após a farinha de sangue, equipar cada gaiola com uma cor escura 50 ml c-se forrada com papel não branqueado a germinação das sementes (papel de ovo) ou com texturas toalha não-branqueada de papel e encha até a metade com água deionizada 9. Se mais de 250 mosquitos estão em uma gaiola, use dois copos. NOTA: Para pequenas gaiolas ou frascos single-fêmea &quot;, infusão de feno&quot;, em recipientes de oviposição pode aumentar oviposição devido ao odor da flora microbiana 25. </li></ol> 5. coletar e armazenar ovos <ol><li> Começar a coleta de ovos dentro de 4-5 dias de alimentação de sangue, porque a produção de ovos tipicamente pico cerca de cinco dias após a alimentação de sangue, e depois desaparece ao longo da próxima semana. </li><li> Varie freqüência de coleta de ovos em necessidades do experimento. Para fins gerais, recolher papéis de ovos em uma programação MWF. Remova papéis de ovos de cada gaiola e substituir por papel novo. Coloque papéis removido recentemente em placas de Petri e guardar no armário fotoperíodo SD para evitar efeitos de confusão de armazenamento de ovos. </li><li> Permitir papéis de ovo para re<html> principal molhado por 2 dias pós-oviposição para permitir a formação da cutícula serosa, o que aumenta a resistência à dessecação ovo 26. </li><li> Posto de Arrecadação aproximadamente 48 hr, ovos secar ao ar livre. Seca-se o papel de tal forma que é mole e ligeiramente húmido ao toque, mas não de modo que o papel molhado é escuro a partir de H 2 O ou estimula a eclosão dos ovos. NOTA: A &quot;x 4&quot; papel 6.5 pode demorar cerca de 3,5 horas para secar. Tenha cuidado para não sobre-seco papéis de ovos, pois isso irá resultar em ovo dessecação 27. </li><li> Reservar ovos adicionais, tanto LD e SD fotoperíodo para avaliar a diapausa e interpretar o efeito photoperiodic (ver medição diapausa, Seção 6). </li><li> Para armazenamento a longo prazo, tenha papéis de ovos a 21 ° C e cerca de 80% de humidade em placas de Petri. Manter pratos de Petri em um recipiente de armazenamento Tupperware com um frasco de água para manter a humidade local como o desenvolvimento embrionário leva quatro a cinco dias a 21 ° C. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6. Meça diapausa Incidência <ol><li> Use embriões reservados adicionais (ver Estimular oviposição, secção 4), que são 7-20 dias de idade para quantificar a resposta diapausa. </li><li> Anote o número de ovos presentes em cada papel ovo. </li><li> Estimular os ovos para chocar, submergindo completamente papéis individuais de ovos em um prato de 90 ml Petri com aproximadamente 80 ml ​​de H 2 O. deionizada Adicionar aproximadamente 0,25 ml de suspensão de alimentação. </li><li> Após 24 h contar o número de larvas eclodidas primeiro instar. Colocar a placa de Petri sobre uma superfície preta para visualizar larvas e colocar uma fonte de luz de um lado do prato. As larvas irão mover-se para longe da fonte de luz, o que permite uma contagem de larvas claro indivíduo. Remover larvas indivíduo com uma pipeta, contando para evitar recontando larvas individual. </li><li> Papers lugar de ovos em uma nova placa de Petri e re-seco. Re-ovos eclodem depois de ~ 1 semana e novamente concordância ovos eclodidos usando o método acima. </li><li> Papers lugar de ovo com o restante u<html> ovos n-eclodidos em novos 90 ml placas de Petri com solução de branqueamento de aproximadamente 80 ml ​​28. Certifique-se de que os papéis de ovos estão completamente submerso na solução de branqueamento e deixe durante a noite sob uma coifa para evitar o odor de água sanitária. NOTA: Branqueamento solução pode ser armazenada durante ~ 1 semana a 4 ° C, mas de outro modo deve ser feita. </li><li> Inspecione ovos usando um microscópio de luz como o branqueamento irá limpar o chorion e permitir a visualização de embrionados, ovos un-chocados. Se o ovo é embrionados, o ovo terá uma cor off-white com os olhos aparecem como dois pequenos pontos pretos opostos um ao outro na face dorsal. Contar o número de un-chocado, ovos embrionados 13. </li><li> Determinar a diapausa com a seguinte fórmula:% diapausa = nenhum. ovos embrionados un-nascidos / (no. ovos eclodidos + não. ovos un-eclodidas embrionados) x 100 13. </li></ol> 7. Extração de RNA a partir de ovos / larvas pharate ontent &quot;&gt; NOTA: Use Trizol em uma capela de fluxo laminar. <ol><li> Ovos do mosquito da escova contendo embriões em desenvolvimento ou larvas pharate em momentos distintos do desenvolvimento de trabalhos de ovos para moedores de vidro usando um pincel de pêlo de camelo. Triture os ovos em Trizol (1 ml por 50-100 mg de tecido) até que esteja completamente pulverizada. Utilize pelo menos 400 ovos per biblioteca para produzir RNA suficiente. <ol><li> Alternativamente, encaixe ovos congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C em tubos de microcentrífuga de até um mês antes da moagem em Trizol. </li></ol></li><li> Realizar a extracção de ARN em Trizol seguido por precipitação com isopropanol de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Tratar o banco com solução RNase descontaminação ou outros agentes para remover quaisquer nucleases residuais para evitar a degradação do RNA. <ol><li> Tratar o RNA extraído com DNase. De acordo com as instruções do fabricante, incubar as amostras de ARN com DNase durante 30 min a 37 ° C. Use 1 &amp; #181; l de ADNase para até 10 ug de RNA numa reacção de 50 ul. Aumentar a quantidade de ADNase, se houver mais do que 10 ug de RNA em uma reacção. </li><li> Inactivar ADNase por adição de 5 ul de reagente de inactivação de DNase suspenso. Incubar 5 min à temperatura ambiente, a mistura três vezes durante o período de incubação (vortex suave). </li><li> Centrifugar a 10.000 xg por 1,5 min. Transferir o sobrenadante contendo as amostras de RNA tratada para tubos frescos para as etapas subsequentes. </li></ol></li><li> Avaliar a qualidade das amostras de ARN totais por fluorometria. Enviar as amostras para uma instalação de especialidade com o instrumento adequado para esta tarefa. A facilidade vai efectuar a electroforese em gel em chips, para determinar os tamanhos de espécies de RNA presentes na amostra, visualizadas por coloração fluorescente instilada no chip. Os resultados serão retornados como um electroferograma. <ol><li> Determinar a integridade das amostras de ARN total por a presença ou ausência de produtos de degradação, tal como evidenciado pela presença of os picos entre 18S e 5S picos de ARN ribossomal no electroferograma resultante (Figura 1B). </li></ol></li></ol> 8. RNA Sequencing <ol><li> Enviar amostras de ARN totais com qualidade suficientemente elevada (Figura 1A) e da quantidade (geralmente&gt; 3 ug por biblioteca) para um centro de sequenciação comercial para a construção de bibliotecas enriquecidas emparelhado-finais de ARNm e a sequenciação de ARNm, seguindo protocolos padrão. </li><li> Se mais de uma faixa está sendo usado para sequenciar um único experimento, dividir bibliotecas individuais em duas pistas de sequenciamento para explicar variação técnica entre pistas durante o seqüenciamento. </li></ol> 9. lllumina Leia Limpeza NOTA: A Figura 2 resume a porção bioinformática deste protocolo. Para obter uma lista completa de todos os programas e recursos usados ​​na seção bioinformática deste protocolo, consulte a Tabela 1. EmAdicionalmente, Suplementar Arquivo 1 contém exemplos de linha de comando para cada uma das seguintes etapas do protocolo de bioinformática. <ol><li> Use ssaha2 29 (Tabela 1) para identificar as correspondências com 95% de identidade ou superior para a base de dados do NCBI UniVec núcleo (Tabela 1), A. albopictus sequência rRNA (GenBank # L22060.1) e adaptadores de seqüenciamento (exemplos detalhados de linha de comando fornecidas em Suplementar Arquivo 1). Remover pares de leitura com jogos usando Perl ou uma ferramenta de scripting semelhante, por exemplo, adaptando o script Perl fornecida (Suplementar Arquivo 2). </li><li> Limpe restante lê com o pacote SolexaQA 30 (Tabela 1; Suplementar Arquivo 1): aparar as regiões com uma pontuação equivalente Phred inferior a 20 usando as configurações padrão de DynamicTrim.pl. <ol><li> Remover lê mais curto do que 25 bp com LengthSort.pl em ambos frente e verso lê simultaneamente. Avaliar a qualidade dos arquivos limpos fastq com FastQC (Tabela 1 </strong&gt;) - em particular, verificar se a qualidade sequência per-base e os índices de qualidade per-seqüência estão acima de 20. </li></ol></li></ol> 10. Digital Normalização <ol><li> Execute uma rodada de normalização digital no limpos lê usando a ferramenta khmer 31 (Tabela 1; Suplementar Arquivo 1), especificamente normalize-by-median.py (usando tamanho k-mer 20, uma cobertura de corte de 20, e x = 1e10). </li><li> Como alternativa, se uma máquina com alta RAM disponível (centenas de GBs), usar o script normalize_by_kmer_coverage.pl de Trinity (Tabela 1). </li></ol> 11. De Assembléia transcriptoma Novo <ol><li> Obter acesso a um grupo de computadores ou computador com até 256 Gb de RAM e CPUs 24, dependendo do tamanho do conjunto. </li><li> Use Trinity 32 (Tabela 1; Suplementar Arquivo 1) para montar a leitura digital normalizado definido em contigs. Para reduziruso de memória, use --min_kmer_cov 2. </li></ol> 12. Avaliação Assembleia <ol><li> Execute assemblathon_stats.pl do projeto Assemblathon2 33 na saída contig Trindade. Este script executa cálculos básicos relevantes para a avaliação da qualidade de montagem, tais como número de andaimes, N50, composição de montagem, e mais (Tabela 1; Suplementar arquivo 1). </li></ol> 13. Anotação do transcriptoma montado <ol><li> Execute Blastx (Tabela 1) do conjunto contra um conjunto de proteínas de referência; para os mosquitos, Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, Culex pipiens, e Aedes aegypti são referências adequadas. Especificamente, formatar o arquivo fasta proteína de referência para a explosão, seguida de blastx (Suplementar Arquivo 1). </li></ol> 14. Mapa Lê à Assembléia Usando RSEM 34 (Tabela 1) <ol><li> Criar um arquivo &#39;transcrição-to-gene-map&#39;, em que oprimeira coluna contém os IDs de genes de referência, e a segunda coluna os IDs contig. Em um editor de planilhas, trocar as primeira e segunda colunas a partir da saída Blastx, e escrever estas colunas em um arquivo .txt. Use o programa LineBreak para converter as quebras de linha no arquivo .txt resultante para formato Unix. </li><li> Criar um conjunto de dados de referência a partir do arquivo fasta transcriptoma usando o script rsem-prepare-referência, fornecido no pacote RSEM (Suplementar Arquivo 1). </li><li> Calcular os valores de expressão separadamente para cada biblioteca usando o comando rsem-calcular-expressão, fornecido no pacote RSEM (Suplementar Arquivo 1). Como lê, utilizar os ficheiros emparelhados fastq resultantes do passo de limpeza de leitura (passo 9.2). <ol><li> Se RNA a partir de uma réplica biológica foi dividida em duas pistas para o seqüenciamento, incluem ambos os arquivos fastq no cálculo expressão para gerar um único arquivo. </li></ol></li><li> Converter os resultados de expressão de cada biblioteca a uma matriz facilmente processados ​​por outro pROGRAMAS usando o rsem-gerar-data-matriz do script fornecido, fornecido no pacote RSEM (Suplementar Arquivo 1). </li></ol> 15. Análise da expressão diferencial <ol><li> Instale R e aparador (Tabela 1). </li><li> Use read.delim para carregar os resultados RSEM da etapa 14.3 (Suplementar Arquivo 1). Se necessário, completar a contagem para o número inteiro mais próximo. NOTA: O guia facetadora recomenda limitar o conjunto de dados de genes com expressão elevada o suficiente para detectar significado. </li><li> Para formatar os dados para facetadora, gerar um objeto DGEList do arquivo de dados carregado (Suplementar Arquivo 1). Em seguida, normalizar os dados usando TMM normalização (Suplementar Arquivo 1). Estimar as dispersões comuns e tagwise dos dados (Suplementar arquivo 1). </li><li> Identificar genes diferencialmente expressos com um Benjamini-Hochberg corrigido p &lt;0,05 (File Suplementar 1). Traça-se a distribuição de log-fold-change vs. abundância (Suplementar Arquivo 1). </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo apresenta métodos para descobrir genes diferencialmente expressos, devido à photoperiodically diapausa induzida em A. albopictus. O protocolo é significativo na medida em que combina de forma única de criação do mosquito e técnicas de bioinformática para fazer todos os aspectos experimentais de um programa de fisiologia molecular acessível a usuários novatos - em especial para as que incidam sobre a resposta ao fotoperíodo diapausa. Os métodos existentes, a nosso conhecimento, não forneça o máxim...

Avanços rápidos nas tecnologias de sequenciamento de próxima geração (NGS) estão oferecendo oportunidades empolgantes para investigar os fundamentos moleculares de uma ampla gama de adaptações ecológicas geneticamente complexas em uma ampla diversidade de organismos não modelo1–3. Essa abordagem é extremamente poderosa porque estabelece uma base para estudos genômicos populacionais e funcionais de organismos com uma ecologia ou história evolutiva especialmente interessante e/ou bem descrita, bem como organismos de preocupação prática, como pragas agrícolas e vetores de doenças. Assim, as tecnologias NGS estão levando a rápidos avanços nos campos da ecologia e têm o potencial de resolver problemas como a compreensão das bases mecanicistas das respostas biológicas às rápidas mudanças climáticas contemporâneas4, a disseminação de espécies invasoras5 e as interações patógeno-hospedeiro6,7.
O extraordinário potencial das tecnologias NGS para abordar questões básicas e aplicadas em ecologia e biologia evolutiva deve-se em parte ao fato de que essas abordagens podem ser aplicadas a qualquer organismo a um custo moderado que é viável para a maioria dos laboratórios de pesquisa. Além disso, essas abordagens fornecem informações de todo o genoma sem a necessidade de recursos genéticos a priori, como um chip de microarray ou sequência completa do genoma. No entanto, maximizar a produtividade dos experimentos NGS requer uma consideração cuidadosa do projeto experimental, incluindo questões como o tempo de desenvolvimento e a especificidade do tecido da amostragem de RNA. Além disso, as habilidades técnicas necessárias para analisar as enormes quantidades de dados produzidos por esses experimentos, muitas vezes até várias centenas de milhões de leituras de sequências de DNA, têm sido um desafio particular e limitaram a implementação generalizada de abordagens NGS.
Estudos recentes de RNA-Seq sobre as bases transcricionais da diapausa no mosquito invasivo e medicamente importante Aedes albopictus fornecem um exemplo útil de alguns dos protocolos experimentais que podem ser empregados para aplicar com sucesso a tecnologia NGS ao estudo da base molecular de uma adaptação ecológica complexa em um organismo não modelo8–10. A. albopictus é uma espécie altamente invasora nativa da Ásia, mas recentemente invadiu a América do Norte, América do Sul, Europa e África11,12. Como muitos insetos temperados, as populações temperadas de A. albopictus sobrevivem durante o inverno entrando em um tipo de dormência conhecida como diapausa fotoperiódica. Em A. albopictus, a exposição de fêmeas pupais e adultas a dias curtos (outonais) leva à produção de ovos diapausa nos quais o desenvolvimento embriológico é concluído, mas a larva farata dentro do córion do ovo entra em uma parada de desenvolvimento que torna o ovo refratário ao estímulo de eclosão15-17. Os ovos diapausados são mais resistentes à dessecação5,18 e contêm mais lipídios totais19 do que os ovos não diapausados. A diapausa fotoperiódica em A. albopictus é, portanto, uma plasticidade fenotípica adaptativa e controlada maternalmente, essencial para sobreviver às duras condições do inverno em ambientes temperados. Apesar do significado ecológico bem compreendido da diapausa fotoperiódica em uma ampla gama de insetos20,21, a base molecular dessa adaptação crucial não é bem caracterizada em nenhum inseto22. Em organismos como A. albopictus que sofrem uma diapausa embrionária no estágio larval farato, continua sendo um desafio particularmente convincente entender como o sinal fotoperiódico recebido pela mãe é passado para a prole e persiste ao longo do desenvolvimento embrionário para causar parada no estágio larval farato.
Este protocolo descreve a criação de mosquitos, o desenho experimental e as análises de bioinformática para experimentos NGS (sequenciamento do transcriptoma) realizados para elucidar os componentes transcricionais da diapausa fotoperiódica em A. albopictus. Este protocolo pode ser usado para estudos adicionais de diapausa em A. albopictus, pode ser adaptado para investigar a diapausa em outras espécies intimamente relacionadas, como outros mosquitos aedine que sofrem diapausa de ovo23, e também é mais geralmente relevante para empregar abordagens NGS para estudar as bases transcricionais de qualquer adaptação complexa em qualquer inseto.

<table><tbody><tr><td>Incubadora - Modelo 818</td><td>Thermo-Scientific</td><td>3751</td><td>120 V</td></tr><tr><td>Sala de ambiente controlado</td><td>Thermax Scientific</td><td>N/A</td><td>Sala de ambiente controlado walk-in construída de acordo com especificações personalizadas pela Thermax Scientific Products. Uma alternativa maior para uma incubadora. http://thermmax.com/</td></tr> <tr><td>Lâmpada fluorescente</td><td>fria Philips</td><td>392183</td><td>4 W</td></tr><tr><td>Placa de Petri 100 mm x 20 mm</td><td>Fisher</td><td>08-772-E</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro 20,5 cm</td><td>Fisher</td><td>09-803-6J</td><td></td></tr><tr><td>Balde de 9,5 L Plastican</td><td></td><td>Bway Products</td><td>http://www.bwayproducts.com/sites/portal/plastic-products/plastic-open-head-pails/117</td></tr><tr><td>Utility Tecido-Mosquiteiro Branco</td><td>Joann</td><td>10173292</td><td>http://www.joann.com/utility-fabric-mosquito-netting-white/10173292.html</td></tr><tr><td>Meias ortopédicas</td><td>Albahealth</td><td>23650-040</td><td>produto no. 081420</td></tr><tr><td>Passas Orgânicas</td><td>Newman's Own</td><td>UPC: 884284040255</td><td></td></tr><tr><td>Copos de oviposição (marrom)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-52</td><td>O produto é na verdade uma garrafa âmbar de 125 ml que vimos na tampa.</td></tr><tr><td>Toalhas de Papel Reciclado</td><td>Sétima Geração</td><td>30BPT120</td><td></td></tr><tr><td>Modular Mates Conjunto Tupperware Quadrado</td> Moedor de Vidro <td>Tupperware</td><td></td><td>http://order.tupperware.com/pls/htprod_www/coe$www.add_items</td></tr><tr><td></td><td>Corning Incorporated</td><td>7727-2</td><td>Estes moedores de tecido Tenbroeck quebram os ovos e liberam RNA no Reagente TRI.</td></tr><tr><td>Reagente TRI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9424</td><td>Aplique 1 ml de reagente TRI por 50-100 mg de tecido. Atenção &#8212; Este reagente é tóxico.</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free</td><td>Ambion/Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>Este kit gera maior rendimento do que o tratamento tradicional de DNase seguido de limpeza de fenol/clorofórmio, e é mais simples de usar.</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion / Life Technologies</td><td>AM9782</td><td>Aplique generosamente nas superfícies da bancada e em qualquer equipamento que possa estar em contato com as amostras de RNA. A solução é ligeiramente alcalina / corrosiva, pode causar irritação e é prejudicial quando ingerida.</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td>Coloque até 12 amostras de RNA em um chip.</td></tr><tr><td>Alimentador de Membrana</td><td>Hemotek Hemotek&nbsp;</td><td>5W1</td><td>Este sistema fornece 5 estações de alimentação que podem ser usadas simultaneamente. Inclui unidade de alimentação PS5 e cabo de alimentação; 5 Alimentadores FUI + Reservatórios de Refeição e O-rings; Plugues de plástico, membrana de alimentação de colágeno Hemotek; Ferramenta de ajuste de temperatura; e ferramenta de extração de plugue. O endereço de correspondência da empresa é: Hemotek Ltd; Unidade 5 Tribunal da União; Alan Ramsbottom Caminho; Grande Harwood; Lancashire, Reino Unido; BB6 7FD; Tel: +44 1254 889 307.</td></tr><tr><td>Termômetro Digital e Sonda</td><td>Hemotek&nbsp;</td><td>Termômetro MT3KFU</td><td>MicroT3 e sonda KFU. Isso é usado para definir a temperatura de cada unidade de alimentação FOI.</td></tr><tr><td>Sangue total de frango, não estéril com citrato de sódio</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>33130-1</td><td>Os 500 ml de sangue foram congelados e armazenados em alíquotas de 20 ml a -80 &#176; C por até 1 ano. Descongele o sangue em temperatura ambiente por pelo menos 1 hora antes de usar.</td></tr></tbody></table>

uma experimental e bioinformática protocolo de análises de rna-seq de fotoperiódicas diapausa no tigre asiático mosquito, aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

A diapausa fotoperiódica é uma adaptação importante que permite que os indivíduos escapem de ambientes sazonais hostis por meio de uma série de mudanças fisiológicas, principalmente a parada do desenvolvimento e a redução do metabolismo. O perfil de expressão gênica global via RNA-Seq pode fornecer informações importantes sobre os mecanismos transcricionais da diapausa fotoperiódica. O mosquito tigre asiático, Aedes albopictus, é um organismo notável para o estudo das bases transcricionais da diapausa devido à sua facilidade de criação, diapausa facilmente induzida e aos recursos genômicos disponíveis. Este manuscrito apresenta um fluxo de trabalho experimental geral para identificar diferenças transcricionais induzidas por diapausa em A. albopictus. Técnicas de criação, condições necessárias para induzir o desenvolvimento de diapausa e não diapausa, métodos para estimar a porcentagem de diapausa em uma população e extração de RNA e avaliação de integridade para mosquitos estão documentados. Um fluxo de trabalho para processar dados de RNA-Seq de sequenciadores Illumina culmina em uma lista de genes diferencialmente expressos. Os resultados representativos demonstram que este protocolo pode ser usado para identificar efetivamente genes regulados diferencialmente no nível transcricional em A. albopictus devido a diferenças fotoperiódicas. Com ajustes modestos, esse fluxo de trabalho pode ser prontamente adaptado para estudar as bases transcricionais da diapausa ou outras características importantes da história de vida em outros mosquitos.

Fluorometria de duas amostras de RNA representativos mostraram duas bandas a aproximadamente 2000 nt (Figura 1A, B). O ARN ribossómico 28S de insectos é composta de duas cadeias polinucleotídicas mantidas juntas por ligações de hidrogénio, que são facilmente rompidas por breve aquecimento ou agentes que perturbam a 35 ligações de hidrogénio. Os dois componentes resultantes são aproximadamente do mesmo tamanho que o ARN ribossómico 18S. A segunda amostra de RNA apresentaram altos níveis de deg...

RNA-Seq as análises estão se tornando cada vez mais importantes para identificar os fundamentos moleculares de características adaptativas em organismos não modelo. Aqui, um protocolo para identificar genes diferencialmente expressos entre mosquitos Aedes albopictus diapausados e não diapausados é descrito, desde a criação de mosquitos até o sequenciamento de RNA e análises de bioinformática de dados de RNA-Seq.

Uma Experimental e Bioinformática Protocolo de Análises de RNA-seq de fotoperiódicas diapausa no Tigre Asiático Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar os componentes transcricionais da resposta fotoperiódica à diapausa. Em um mosquito não-modelo dos anos oitenta, isso é conseguido produzindo primeiro amostras replicadas biologicamente de ovos diapausados e não diapausados por meio de diferentes tratamentos fotoperiódicos. Como segunda etapa, o RNA é extraído de cada réplica para sequenciamento de RNA de alto rendimento.As sequências de RNA são então processadas computacionalmente para montá-las em congs e anotá-las. Em última análise, variações na expressão gênica em resposta a fotoperíodos indutores de diapausa versus não indutores de diapausa podem ser inferidas do MAP de Reeds para a montagem do RNA. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como uma análise de microraios, é que recursos genéticos anteriores, como a sequência do genoma ou um microarray, não são necessários para obter estimativas globais da expressão gênica em resposta às condições de diapausa.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da genômica ecológica, como qual é a base transcricional das DPOs ou outras adaptações ecológicas importantes em organismos não modelo. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois pode ser difícil obter quantidades suficientes de ovos de diapausa e não DPOs e a análise de bioinformática a jusante pode ser desafiadora. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos que as tecnologias de sequenciamento de DNA de alto rendimento estavam se tornando mais acessíveis e ofereciam um método tratável para obter perfis de expressão do genoma completo em organismos não modelo antes de iniciar o procedimento.Defina dois gabinetes de fotoperíodo com iluminação programável a 21 graus Celsius para uma expressão ideal de diapausa e aproximadamente 80% de umidade relativa Programe um gabinete para um período fotográfico não indutor de diapausa com um ciclo escuro claro de 16 oito e outro para um ciclo escuro claro de 16 induzindo diapausa com as luzes acesas ao mesmo tempo para ambos os gabinetes sincronizarem o tempo circadiano entre os períodos fotográficos. Em seguida, mergulhe os papéis de ovo para o número apropriado de ovos em 500 mililitros de água deionizada e adicione um mililitro de ração moída para cães e pasta de salmoura. Cubra o recipiente com malha, colocando um elástico ao redor da malha para mantê-la no lugar.Em seguida, incube os ovos no armário de 16 oito dias claros e escuros por cerca de 24 horas. No dia seguinte, transfira cerca de 30 larvas eclodidas por grupo para placas de Petri individuais de 10 por 10 por dois centímetros cheias de 90 mililitros de água deionizada. A cada 48 a 72 horas, transfira as larvas para um prato limpo, alimentando-as com pasta de alimentos frescos a cada transferência.Após cerca de seis dias, forre o fundo de três a quatro gaiolas adultas para cada tratamento de fotoperíodo com papel de filtro úmido e umedeça o papel de filtro com água deionizada suficiente para aumentar a umidade local na gaiola, evitando água parada. Anote o período da foto, a data de início da gaiola de número replicado e outras informações relevantes para o experimento com marcador permanente na lateral da gaiola. Em seguida, a cada dois dias, durante 10 dias, transfira o puy para pequenos copos de água limpa a não mais do que 50 puy por 25 mililitros de água para as gaiolas adultas apropriadas para o experimento e coloque passas orgânicas na malha superior da gaiola para fornecer açúcar para os adultos emergidos Para estimular a posição dos ovos quatro a cinco dias após a primeira refeição de sangue, Encha xícaras de 50 mililitros de cor escura forradas com uma toalha de papel texturizada não branqueada até a metade com água deionizada e coloque uma xícara em cada gaiola para coletar e armazenar os ovos.Substitua os papéis de ovo em cada gaiola por papel novo, colocando os papéis recém-removidos em placas de Petri e armazenando-os no armário de oito fotoperíodos de 16 dias claros e escuros para evitar efeitos de confusão no armazenamento de ovos. Aproximadamente 48 horas após a coleta, secar os papéis de ovos ao ar livre de modo que fiquem moles e levemente úmidos ao toque, mas não tão úmidos que os papéis fiquem escuros devido à água ou estimulem a eclosão. Para medir os incidentes de diapausa, registre o número de ovos em cada papel de ovo.Em seguida, mergulhe completamente os papéis individuais em uma placa de Petri de 90 mililitros com aproximadamente 80 mililitros de água deionizada. Para estimular a eclosão, adicione aproximadamente 0,25 mililitros de pasta de alimentos e, após 24 horas, transfira a placa de Petri para uma superfície preta. Agora coloque uma fonte de luz em um lado do, as larvas se afastarão da luz, permitindo uma contagem clara do primeiro indivíduo nas larvas da estrela.Use uma pipeta para remover cada larva após a contagem para evitar a recontagem de indivíduos. Em seguida, coloque os papéis de ovo em uma nova placa de Petri para secar vermelho. Depois de contar um segundo lote de filhotes uma semana depois, coloque os papéis de ovo com os ovos não eclodidos restantes em novas placas de Petri de 90 mililitros com aproximadamente 80 mililitros de solução de branqueamento fresca, cuidando para que os papéis fiquem completamente submersos na solução de branqueamento.Deixe os papéis sob uma capela de exaustão durante a noite e, no dia seguinte, use um microscópio óptico para contabilizar o número de ovos não eclodidos. Se um ovo for embrionado, ele exibirá uma cor esbranquiçada com os olhos aparecendo como dois pequenos pontos pretos opostos um ao outro no lado dorsal. Para começar, limpe cuidadosamente a bancada com solução de descontaminação de RNA para remover quaisquer nucleases residuais e evitar a degradação do RNA.Em seguida, use uma escova de pêlo de camelo para escovar pelo menos 400 ovos de mosquito contendo embriões em desenvolvimento no momento do desenvolvimento. Ponto de interesse em moedores de vidro. Em uma capela de exaustão, adicione um mililitro de triol e triture os ovos até que estejam completamente pulverizados e, em seguida, faça a extração de RNA em triol, seguida de precipitação de isopropanol de acordo com as instruções do fabricante.Agora use até um microlitro de D ns por até 10 microgramas de RNA em 50 microlitros de reação por 30 minutos a 37 graus Celsius de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, incubar a reação em cinco microlitros de reagente de inativação de DNA suspenso por cinco minutos à temperatura ambiente. Vórtice suave da suspensão três vezes durante o período de incubação.Em seguida, centrifugue os extratos de RNA por 1,5 minutos a 10.000 vezes G e Eloqua, o RNA contendo sobrenadantes em tubos frescos para sequenciamento. Por fim, consulte o texto que acompanha para obter detalhes sobre como processar os dados de sequenciamento de próxima geração resultantes da leitura, preparação, montagem e anotação para análise de expressão diferencial. Nesta primeira figura, a fluorometria de duas amostras representativas de RNA mostra duas bandas em aproximadamente 2000 nucleotídeos.O RNA ribossômico 28 s do inseto é composto por duas cadeias de polinucleotídeos mantidas juntas por ligações de hidrogênio que são facilmente interrompidas por aquecimento breve ou agentes que quebram as ligações de hidrogênio. Os dois componentes resultantes são aproximadamente do mesmo tamanho que um RNA ribossômico de 18 s na segunda amostra de RNA, altos níveis de degradação podem ser observados neste experimento representativo. O tratamento fotoperiódico de um grupo representativo de mosquitos albopictus resultou em altos incidentes de diapausa em mosquitos criados em dias curtos e baixos incidentes de diapausa em mosquitos criados em dias longos.Embora tenha havido alguma variação entre as réplicas, por exemplo, o grupo do segundo dia curto exibiu um menor incidente de diapausa do que as outras replicações. Um conjunto Trinity de leituras normalizadas digitalmente resultou em 76.377 contigs com um comprimento médio de conig de 1020 3.1 e um comprimento máximo de Conti de 20.892. Observe que a distribuição dos comprimentos de Conti é fortemente inclinada para contigs mais curtos.Isso é típico da montagem do transcriptoma de Denovo. Neste gráfico final, as análises de expressão diferencial de um fluxo de trabalho semelhante de embriões criados sob condições indutoras de diapausa aos 11 e 21 dias após a posição dos óvulos revelam 3.128 genes diferencialmente expressos entre esses dois períodos de tempo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em seis a oito meses a partir da análise informática divina da geração de tecidos, se for realizada corretamente.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o sucesso em cada etapa deve ser verificado antes de passar para a próxima etapa. Por exemplo, confirme se as condições experimentais produziram DPAs e ovos sem diapausa antes de testar a integridade do RNA Seguindo este procedimento. Outros métodos, como RTPC quantitativo ou análise genômica comparativa, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a expressão específica de tecidos ou desenvolvimento dos genes de interesse e/ou processos de evolução molecular.Não se esqueça de que trabalhar com triol pode ser extremamente perigoso e que precauções como o uso de luvas, jaleco e exaustor devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.

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