Uma Experimental e Bioinformática Protocolo de Análises de RNA-seq de fotoperiódicas diapausa no Tigre Asiático Mosquito, Aedes albopictus

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar os componentes transcricionais da resposta fotoperiódica à diapausa. Em um mosquito não-modelo dos anos oitenta, isso é conseguido produzindo primeiro amostras replicadas biologicamente de ovos diapausados e não diapausados por meio de diferentes tratamentos fotoperiódicos. Como segunda etapa, o RNA é extraído de cada réplica para sequenciamento de RNA de alto rendimento.

As sequências de RNA são então processadas computacionalmente para montá-las em congs e anotá-las. Em última análise, variações na expressão gênica em resposta a fotoperíodos indutores de diapausa versus não indutores de diapausa podem ser inferidas do MAP de Reeds para a montagem do RNA. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como uma análise de microraios, é que recursos genéticos anteriores, como a sequência do genoma ou um microarray, não são necessários para obter estimativas globais da expressão gênica em resposta às condições de diapausa.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da genômica ecológica, como qual é a base transcricional das DPOs ou outras adaptações ecológicas importantes em organismos não modelo. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades, pois pode ser difícil obter quantidades suficientes de ovos de diapausa e não DPOs e a análise de bioinformática a jusante pode ser desafiadora. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando percebemos que as tecnologias de sequenciamento de DNA de alto rendimento estavam se tornando mais acessíveis e ofereciam um método tratável para obter perfis de expressão do genoma completo em organismos não modelo antes de iniciar o procedimento.

Defina dois gabinetes de fotoperíodo com iluminação programável a 21 graus Celsius para uma expressão ideal de diapausa e aproximadamente 80% de umidade relativa Programe um gabinete para um período fotográfico não indutor de diapausa com um ciclo escuro claro de 16 oito e outro para um ciclo escuro claro de 16 induzindo diapausa com as luzes acesas ao mesmo tempo para ambos os gabinetes sincronizarem o tempo circadiano entre os períodos fotográficos. Em seguida, mergulhe os papéis de ovo para o número apropriado de ovos em 500 mililitros de água deionizada e adicione um mililitro de ração moída para cães e pasta de salmoura. Cubra o recipiente com malha, colocando um elástico ao redor da malha para mantê-la no lugar.

Em seguida, incube os ovos no armário de 16 oito dias claros e escuros por cerca de 24 horas. No dia seguinte, transfira cerca de 30 larvas eclodidas por grupo para placas de Petri individuais de 10 por 10 por dois centímetros cheias de 90 mililitros de água deionizada. A cada 48 a 72 horas, transfira as larvas para um prato limpo, alimentando-as com pasta de alimentos frescos a cada transferência.

Após cerca de seis dias, forre o fundo de três a quatro gaiolas adultas para cada tratamento de fotoperíodo com papel de filtro úmido e umedeça o papel de filtro com água deionizada suficiente para aumentar a umidade local na gaiola, evitando água parada. Anote o período da foto, a data de início da gaiola de número replicado e outras informações relevantes para o experimento com marcador permanente na lateral da gaiola. Em seguida, a cada dois dias, durante 10 dias, transfira o puy para pequenos copos de água limpa a não mais do que 50 puy por 25 mililitros de água para as gaiolas adultas apropriadas para o experimento e coloque passas orgânicas na malha superior da gaiola para fornecer açúcar para os adultos emergidos Para estimular a posição dos ovos quatro a cinco dias após a primeira refeição de sangue, Encha xícaras de 50 mililitros de cor escura forradas com uma toalha de papel texturizada não branqueada até a metade com água deionizada e coloque uma xícara em cada gaiola para coletar e armazenar os ovos.

Substitua os papéis de ovo em cada gaiola por papel novo, colocando os papéis recém-removidos em placas de Petri e armazenando-os no armário de oito fotoperíodos de 16 dias claros e escuros para evitar efeitos de confusão no armazenamento de ovos. Aproximadamente 48 horas após a coleta, secar os papéis de ovos ao ar livre de modo que fiquem moles e levemente úmidos ao toque, mas não tão úmidos que os papéis fiquem escuros devido à água ou estimulem a eclosão. Para medir os incidentes de diapausa, registre o número de ovos em cada papel de ovo.

Em seguida, mergulhe completamente os papéis individuais em uma placa de Petri de 90 mililitros com aproximadamente 80 mililitros de água deionizada. Para estimular a eclosão, adicione aproximadamente 0,25 mililitros de pasta de alimentos e, após 24 horas, transfira a placa de Petri para uma superfície preta. Agora coloque uma fonte de luz em um lado do, as larvas se afastarão da luz, permitindo uma contagem clara do primeiro indivíduo nas larvas da estrela.

Use uma pipeta para remover cada larva após a contagem para evitar a recontagem de indivíduos. Em seguida, coloque os papéis de ovo em uma nova placa de Petri para secar vermelho. Depois de contar um segundo lote de filhotes uma semana depois, coloque os papéis de ovo com os ovos não eclodidos restantes em novas placas de Petri de 90 mililitros com aproximadamente 80 mililitros de solução de branqueamento fresca, cuidando para que os papéis fiquem completamente submersos na solução de branqueamento.

Deixe os papéis sob uma capela de exaustão durante a noite e, no dia seguinte, use um microscópio óptico para contabilizar o número de ovos não eclodidos. Se um ovo for embrionado, ele exibirá uma cor esbranquiçada com os olhos aparecendo como dois pequenos pontos pretos opostos um ao outro no lado dorsal. Para começar, limpe cuidadosamente a bancada com solução de descontaminação de RNA para remover quaisquer nucleases residuais e evitar a degradação do RNA.

Em seguida, use uma escova de pêlo de camelo para escovar pelo menos 400 ovos de mosquito contendo embriões em desenvolvimento no momento do desenvolvimento. Ponto de interesse em moedores de vidro. Em uma capela de exaustão, adicione um mililitro de triol e triture os ovos até que estejam completamente pulverizados e, em seguida, faça a extração de RNA em triol, seguida de precipitação de isopropanol de acordo com as instruções do fabricante.

Agora use até um microlitro de D ns por até 10 microgramas de RNA em 50 microlitros de reação por 30 minutos a 37 graus Celsius de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, incubar a reação em cinco microlitros de reagente de inativação de DNA suspenso por cinco minutos à temperatura ambiente. Vórtice suave da suspensão três vezes durante o período de incubação.

Em seguida, centrifugue os extratos de RNA por 1,5 minutos a 10.000 vezes G e Eloqua, o RNA contendo sobrenadantes em tubos frescos para sequenciamento. Por fim, consulte o texto que acompanha para obter detalhes sobre como processar os dados de sequenciamento de próxima geração resultantes da leitura, preparação, montagem e anotação para análise de expressão diferencial. Nesta primeira figura, a fluorometria de duas amostras representativas de RNA mostra duas bandas em aproximadamente 2000 nucleotídeos.

O RNA ribossômico 28 s do inseto é composto por duas cadeias de polinucleotídeos mantidas juntas por ligações de hidrogênio que são facilmente interrompidas por aquecimento breve ou agentes que quebram as ligações de hidrogênio. Os dois componentes resultantes são aproximadamente do mesmo tamanho que um RNA ribossômico de 18 s na segunda amostra de RNA, altos níveis de degradação podem ser observados neste experimento representativo. O tratamento fotoperiódico de um grupo representativo de mosquitos albopictus resultou em altos incidentes de diapausa em mosquitos criados em dias curtos e baixos incidentes de diapausa em mosquitos criados em dias longos.

Embora tenha havido alguma variação entre as réplicas, por exemplo, o grupo do segundo dia curto exibiu um menor incidente de diapausa do que as outras replicações. Um conjunto Trinity de leituras normalizadas digitalmente resultou em 76.377 contigs com um comprimento médio de conig de 1020 3.1 e um comprimento máximo de Conti de 20.892. Observe que a distribuição dos comprimentos de Conti é fortemente inclinada para contigs mais curtos.

Isso é típico da montagem do transcriptoma de Denovo. Neste gráfico final, as análises de expressão diferencial de um fluxo de trabalho semelhante de embriões criados sob condições indutoras de diapausa aos 11 e 21 dias após a posição dos óvulos revelam 3.128 genes diferencialmente expressos entre esses dois períodos de tempo. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em seis a oito meses a partir da análise informática divina da geração de tecidos, se for realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o sucesso em cada etapa deve ser verificado antes de passar para a próxima etapa. Por exemplo, confirme se as condições experimentais produziram DPAs e ovos sem diapausa antes de testar a integridade do RNA Seguindo este procedimento. Outros métodos, como RTPC quantitativo ou análise genômica comparativa, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a expressão específica de tecidos ou desenvolvimento dos genes de interesse e/ou processos de evolução molecular.

Não se esqueça de que trabalhar com triol pode ser extremamente perigoso e que precauções como o uso de luvas, jaleco e exaustor devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.