Análise da migração celular dentro de uma matriz de colagénio tridimensional
5 de outubro de 2014
A migração celular é um fenómeno biológico que está envolvido numa variedade de parâmetros fisiológicos, tais como a cicatrização de feridas e de respostas imunes, e processos patofisiológicos, como o cancro. O ensaio de migração matriz 3D-colagénio é um instrumento versátil para analisar as propriedades migratórias de diferentes tipos de células dentro de um ambiente fisiológico semelhante a 3D.
O objetivo geral deste procedimento é analisar o comportamento migratório das células dentro do ambiente tridimensional. Primeiro, incorpore as células de interesse em uma rede de colágeno tridimensional. Em seguida, registre o movimento das células por microscopia de vídeo com lapso de tempo em seguida, delineie os parâmetros de migração por rastreamento celular assistido por computador e analise os dados de rastreamento de células usando um aplicativo de software de planilha.
Em última análise, este método pode ser usado para investigar quais fatores e vias de transdução de sinal regulam a migração de células cancerígenas ou células normais como leucócitos, linfócitos e células-tronco no contexto do câncer. Portanto, o conhecimento da migração celular, fatores moduladores e vias de transecção de sinal associadas podem ser úteis para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para prejudicar a migração de células tumorais e a disseminação metastática. Para as câmaras de migração, escove rapidamente duas camadas de cera de parafina derretida, mistura de vaselina no meio de uma lâmina de vidro, adicione uma tampa, deslize e sele com duas camadas de cera de parafina, mistura de vaselina.
Em seguida, coloque as câmaras de migração na posição vertical em um rack para tubos de reação de 1,5 mililitro. Adicione 20 microlitros da suspensão celular para a suspensão de colágeno. Combine 50 microlitros de 10 XMEM e 27 microlitros de solução de bicarbonato de sódio a 7,5% misture bem.
Em seguida, adicione 375 microlitros de suspensão de colágeno líquido e misture bem para obter uma cor roxa clara, indicando um pH de 7,5. Agora adicione 100 microlitros da suspensão final de colágeno a 50 microlitros da suspensão celular e misture bem, observando o início da fibra de colágeno. Polimerização. Em pH 7,5, transfira a mistura para as câmaras de migração.
Bata suavemente na câmara de migração para distribuir igualmente a mistura de células de suspensão de colágeno na parte inferior da câmara da cadeia de migração. Coloque as câmaras de migração na posição vertical na prateleira e incube por 30 minutos. Quando a rede de colágeno polimerizada estiver ligeiramente turva, mas ainda com uma cor roxa clara, encha as câmaras de migração com o meio apropriado e sele a câmara de migração com cera de parafina.
Mistura de vaselina. Ajuste o aquecedor da platina do microscópio para 37 graus Celsius usando uma ampliação de 10 x na câmara de migração. Concentre aproximadamente 50 células ou mais no campo de visão.
Grave a migração celular no modo de lapso de tempo usando um aplicativo de software de vigilância por vídeo com várias câmeras. Salve os filmes de migração de células em um formato de arquivo apropriado. Vincule os arquivos de filme de migração de célula a um banco de dados contendo informações de suporte, como tipo de célula e condições experimentais.
Em seguida, analise os filmes de migração celular usando um aplicativo de software de rastreamento de células apropriado para uma análise imparcial. Selecione aleatoriamente as células para análise sem saber se as células são migratórias ativas no total, determine cerca de 60 coordenadas XY por célula em um experimento típico de migração celular. Em caso de divisão celular, escolha aleatoriamente uma célula-filha para seguir no rastreamento.
Analise os dados de rastreamento de células usando um aplicativo de software apropriado, como um programa de planilha, para calcular a distância total que uma célula migrou. Multiplique a soma dos valores numéricos de pixel por um fator de correção para conversão em mícrons. Defina as células que migraram menos do que o limite de 25 mícrons como células que não se movem e substitua os valores numéricos por uma vírgula.
Em seguida, calcule a atividade locomotora como uma porcentagem de células da população de células rastreadas que se moveram entre dois pontos de tempo. Além disso, calcule o tempo de movimento ativo como uma porcentagem do tempo total que uma célula migrou em relação ao período de tempo do período de observação. Em seguida, calcule a significância estatística usando o teste U de man Whitney e exiba os dados de migração celular.
Um arquivo de dados de rastreamento de célula típico se assemelha a uma tabela em que cada coluna representa uma célula rastreada. As linhas contêm as informações posicionais sobre o movimento da célula. Ao longo do tempo, o comportamento locomotor das células pode ser caracterizado pela atividade locomotora média da população celular analisada e também pelo tempo de movimento ativo.
Este exemplo mostra as atividades migratórias de 120 células de quatro experimentos independentes. Cada losango indica que uma célula se moveu entre pelo menos dois pontos de tempo. As linhas cinzas diferenciam as células móveis e não móveis.
O parâmetro da atividade locomotiva pode ser exibido como um diagrama XY ou um gráfico de caixa. Para visualizar a dinâmica da população de células analisada, um histograma mostra efetivamente o tempo ativo dessas mesmas células. Esta análise do comportamento migratório das linhagens celulares de câncer de mama MDA HER2 e M-D-A-N-E-O indica que ambas as linhagens celulares exibiram atividade locomotora espontânea semelhante.
O parâmetro tempo ativo revelou um número ligeiramente maior de células M-D-A-H-E-R em movimento espontâneo em comparação com as células de câncer de mama M-D-A-N-O. A estimulação com 100 nanogramas por mililitro de EGF resultou em um aumento significativo da atividade migratória do MDA HER2, medido pelo número de células em movimento e pelo tempo de movimento ativo. Curiosamente, as células M-D-A-N-E-O migraram em resposta à estimulação do EGF e exibiram um tratamento de padrão ativo no tempo deslocado com o inibidor da fosfolipase c gama um uc 3 1 22 reduziu a migração espontânea e induzida por EGF de M-D-E-E-R dois e MDAN.
Células EEO. A análise do parâmetro tempo ativo revelou que o tratamento de células MDAN EEO com dois micromolares de U 7 3 1 2 2 resultou em uma atividade locomotora acentuadamente diminuída, atribuída principalmente a um aumento da quantidade de células imóveis. Uma vez dominada, a migração de linfócitos e leucócitos para um colágeno tridimensional pode ser registrada em cerca de duas horas, onde as células tumorais são registradas durante a noite.
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Visão Geral
Este artigo discute a análise da migração celular dentro de uma matriz tridimensional de colágeno, um aspecto crucial de diversos processos fisiológicos e patológicos. O método permite a investigação de fatores que influenciam o movimento celular, particularmente na pesquisa sobre câncer.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Neurociência
- Pesquisa sobre Câncer
Contexto
- A migração celular é essencial para a cicatrização de feridas e respostas imunes.
- Desempenha um papel significativo na metástase do câncer.
- Compreender os mecanismos de migração pode auxiliar no desenvolvimento de estratégias terapêuticas.
- A matriz de colágeno 3D fornece um ambiente mais fisiológico para o estudo do comportamento celular.
Objetivo do Estudo
- Analisar o comportamento migratório de diversos tipos celulares em um ambiente tridimensional.
- Identificar fatores e vias que regulam a migração celular.
- Aprimorar o conhecimento para o desenvolvimento de terapias contra a disseminação tumoral.
Métodos Utilizados
- Imersão de células em uma matriz tridimensional de colágeno.
- Gravação do movimento celular utilizando microscopia de vídeo com intervalo de tempo.
- Delimitação dos parâmetros de migração por meio de rastreamento assistido por computador.
- Análise dos dados com software de planilha eletrônica.
Resultados Principais
- Rastreamento bem-sucedido da migração celular em uma matriz 3D.
- Identificação dos fatores-chave que influenciam o movimento celular.
- Informações sobre as vias de transdução de sinal relacionadas à migração.
- Implicações potenciais para estratégias de tratamento do câncer.
Conclusões
- A matriz de colágeno 3D é eficaz para estudar a migração celular.
- Compreender a migração pode levar a abordagens terapêuticas inovadoras.
- São necessárias mais pesquisas para explorar mecanismos regulatórios específicos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise da migração celular em uma matriz tridimensional de colágeno fisiologicamente relevante fornece confiança preditiva na validação de alvos ao revelar como fatores pró-migratórios e inibidores modulam o comportamento locomotor. Esta abordagem auxilia na redução de riscos mecanicistas em pipelines de oncologia e imunologia ao quantificar parâmetros de migração que se correlacionam com o potencial metastático e o tráfego de células imunes. O método permite decisões baseadas em dados de avançar ou não avançar já nos estágios iniciais da descoberta, ao associar perturbações moleculares a respostas funcionais de migração.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a medição de como a estimulação por EGF ou a inibição de PLCγ1 alteram a migração celular em uma matriz tridimensional.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio do rastreamento quantitativo de parâmetros de migração, como distância total e atividade locomotora.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao identificar compostos que reduzem significativamente a atividade migratória em modelos de células cancerígenas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Produz dados padronizados e reprodutíveis de migração a partir de células embutidas em uma matriz fisiológica de colágeno.
- Saídas Quantitativas: Gera parâmetros mensuráveis, incluindo distância total de migração, porcentagem de atividade locomotora e tempo de movimento ativo.
- Escalabilidade para Triagem: Permite testes com múltiplas condições (por exemplo, estimulação com EGF, tratamento com inibidores) utilizando microscopia com captura de tempo e análise baseada em planilhas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Modela a disseminação metastática por meio da análise da emigração de células tumorais de esferoides para a matriz de colágeno.
- Continuidade Translacional: Conecta descobertas de migração na fase de pesquisa à validação pré-clínica de terapêuticas anti-migratórias.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de progressão ao demonstrar efeitos dependentes da dose de compostos como o U73122 sobre a atividade locomotora.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio de migração em colágeno 3D insere-se no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a identificação de compostos líderes, fornecendo leituras funcionais que interligam ensaios bioquímicos e triagem fenotípica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias ao associar moduladores da transdução de sinal (por exemplo, EGF, inibidores da PLCγ1) a alterações no comportamento migratório.
- Triagem: Fornece métricas quantitativas prontas para ensaios que permitem avaliação confiável de compostos em diferentes tipos celulares.
- Análise: Gera coordenadas XY rastreáveis e parâmetros calculáveis (distância total, atividade locomotora) para comparação estatística utilizando ferramentas como o teste U de Mann-Whitney.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se à continuidade pré-clínica ao modelar a emigração celular a partir de aglomerados, relevante para metástase e infiltração imune.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável para testar respostas migratórias em linfócitos, leucócitos, células-tronco e células tumorais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na modulação do alvo ao reduzir a ambiguidade mecanicista na regulação da migração.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de parâmetros definidos (por exemplo, limite de 25 mícrons para células não móveis) e rastreamento com imagens sequenciais.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de candidatos anti-migratórios antes de estudos in vivo onerosos.
- Impacto na Carteira: Facilita a priorização ajustada ao risco ao quantificar os efeitos do composto sobre a migração em modelos tridimensionais relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura celular, preparação de matriz de colágeno e configuração de microscopia com lapso de tempo.
- Depende de instrumentação para controle ambiental (aquecedor de estágio a 37 °C) e software de vigilância de vídeo com múltiplas câmeras.
- Necessita padronização entre equipes nos protocolos de rastreamento celular (por exemplo, seleção cega de células, 60 coordenadas XY por célula).
- Envolve considerações de adaptação para diferentes tipos celulares (por exemplo, migração de linfócitos registrada em cerca de 2 horas versus células tumorais durante a noite).
- Limitado pela necessidade de delimitação manual das câmaras de migração e vedação com mistura de parafina e vaselina.
