Name: Manipulando o Murino lacrimais Gland (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Aprenda a dissecar e cultivar glândulas lacrimais de embriões de camundongo para análise ex vivo do desenvolvimento glandular. Este método permite manipular vias de sinalização e estudar expressão proteica por imunofluorescência.

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Os autores gostariam de agradecer financiamento concedido pelo Programa de Alocação de Recursos UCSF.

Todo o trabalho animal foi realizada sob estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Universidade da Califórnia, em San Francisco. 1. embrionárias de camundongos lacrimais Glândulas (LG): Colheita e Microdissection <ol><li> Seguindo os procedimentos aprovados pelos Animais institucionais para a comissão de Ética de Pesquisa Científica, eutanásia cronometrado CD-1 (ou transgênicos) fêmeas grávidas com o aumento da inalação de CO 2, seguido de confirmação por deslocamento cervical para colheita de embriões no dia embrionário adequado. Designar o dia da vaginal e0 ficha descoberta. Nota: glândulas lacrimais (LGS) podem ser colhidas a partir da e14 único broto fase em diante. No entanto, e16 (5-10 gomos) embriões dar os resultados mais consistentes para ex vivo da cultura. </li><li> Esterilizar a vlado entral do mouse usando etanol 70%. Aperte a pele e fazer uma incisão na linha média com tesouras cirúrgicas estéreis; cortar através da pele e do peritoneu para expor a cavidade abdominal. Retirar as duas trompas uterinas por corte ao longo da mesométrio no topo de cada trompa uterina e em lugar frio PBS (Tampão fosfato salino) ou meio DMEM F12 suplementado com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina. </li><li> Utilizando uma pinça (# 5), remova os embriões dos sacos amniótico e coloque em uma segunda placa de Petri estéril contendo PBS frio. Tenha cuidado para não tocar os olhos ou a área da cabeça. </li><li> Coloque embrião em um microscópio de dissecação com uma base de transiluminação. Se o embrião é &lt;e17, execute os passos 1,5-1,7. Se os embriões são&gt; e17, estes passos podem ser úteis, mas não são essenciais, portanto, siga para o passo 1.8. </li><li> Cortar a cabeça do tronco imediatamente abaixo da mandíbula inferior (passo 1, Figura 2) usinga bisturi estéril (# 10 lâmina). Gire a cabeça para que a mandíbula está agora na placa de dissecação. Use uma pinça para estabilizar a cabeça e um bisturi para remover cerca de ¼ do lado dorsal do cérebro (passo 2, 1º corte, Figura 2) - isto é especialmente importante uma vez que a cartilagem endurece em torno e15. </li><li> Orientar a cabeça para que o bisturi pode furar o nariz entre os olhos. Fazer um corte através do centro da cabeça, de modo que os olhos estão agora em metades separadas (etapa 2, 2 nd corte, Figura 2). </li><li> Usando dois # 5 fórceps, tomar a metade da cabeça e retire o excesso de tecido (veja o passo 3, Figura 2). Certifique-se de orientar a cabeça para que a LG (localizado no canto inferior posterior do olho) não está perdido neste processo de remoção. Remover o excesso cerebral, cartilagem e tecido circundante nasal e abaixo do olho. Uma vez que a glândula é pouco visível neste momento, garantir o olho está devidamente orientado após o excesso de tecido remoção to evitar perder a localização da LG. </li><li> Cuidadosamente agarrar a pele do posterior, canto inferior do olho com as duas pinças. Retire a pele puxando cuidadosamente aberta com a pinça para expor a LG. Use iluminação adicional acima e abaixo do tecido para ajudar a visualizar o LG. Nota: A LG, distinguível por sua aparência como um botão em um duto dentro, um mesênquima condensado mais escuro, deve ser visível neste momento. </li><li> Cuidadosamente começam a dissecar a LG e mesênquima associado (veja o esquema e imagens) de distância do tecido circundante usando uma pinça, tomando cuidado para não pegar a LG ou a sua conduta de associado. Uma vez que a glândula está livre a partir do tecido circundante, remover cuidadosamente toda a glândula agarrando o epitélio circundante do olho na base da conduta de LG. Ter o cuidado de preservar a mesênquima em torno do epitélio, o que pode ser observado como um mesênquima condensada em que os invagina epitélio. NOTA: Algumas remoção adicional de tissue (quaisquer pequenos fragmentos de osso, músculo e tecido conjuntivo) pode ser necessário para evitar factores de sinalização / crescimento do tecido vizinho. </li><li> Para a cultura, a colheita 4-5 glândulas e mesênquima associado por placa (GL são banhados imediatamente após a dissecção); recolher um mínimo de 14 glândulas por 100 ul de tampão de lise de ARN para RT-PCR 6. </li></ol> 2. preparar as placas para Ex Cultura vivo Este procedimento é baseado no sistema utilizado para o desenvolvimento da glândula salivar 7,8. <ol><li> Adicionar 200 ul de DMEM F12 (suplementado com 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina), meios de cultura com 50 ug / ml de ácido ascórbico e 50 ug / mL de holo-transferrina a um micropoço 50 milímetros de diâmetro prato de vidro de fundo 7. Nota: DMEM F12 foi escolhido como nós anteriormente achei que maximizar morfogênese na glândula salivar embrionário. </li><li> Flutuar um polycarb 13 milímetrosfiltro de membrana onate com 0,1 mm poros no topo da mídia. </li><li> Passo opcional: Diluir 3-D laminina 1: 1 com DMEM / F12 para fazer uma concentração final de 3 mg / ml (200 ul usar pipeta para misturar suavemente; centrifugar durante 1 min, se aparecerem bolhas). Adicionar 15 ul desta diluída laminina 3-D para filtrar. Nota: Esta diluição foi encontrado para ser óptima para a manutenção da LG no seu estado 3D sem comprometer a ramificação do epitélio. No entanto, não é essencial para a cultura de LG. </li><li> Colocar 4-5 LG para um filtro ou em laminina. Cultura GL ex vivo para 24-48 hr (Figura 3) ou fixar com PFA a 4% durante 20 min, para posterior análise por qPCR ou imunocoloração (Figura 4). Para a análise de qPCR de tecido glandular embrionário, consulte Rebustini et al., 2011. Para a análise de imunofluorescência de tecidos glandulares embrionárias, por favor consulte as seguintes citações: Hoffman et al, (2002) e Steinberg e.t al., (2005). </li></ol> 3. Rato pós-natal e Adultos lacrimais Glândulas (LG): Dissection <ol><li> Euthanize o mouse pós-natal de acordo com os padrões adequados da comissão ética animal. Para filhotes pós-natais dia 8 ou mais jovens, eutanásia, cortando a cabeça com uma tesoura esterilizada. Para o dia pós-natal 8 anos ou mais, spray de pele com etanol 70%. </li><li> Para localizar a LG, coloque o mouse laterais lado sob um microscópio de dissecação com iluminação de cima. Nota: O LG pós-natal e adulto estão cercados pela artéria carótida, o músculo masseter e da derme (ver Figura 5). </li><li> Com uma tesoura pequena de dissecação, fazer pequena incisão na epiderme lateralmente de onde a LG deve ser localizado. </li><li> Utilizando uma pinça, abra a epiderme em direção à orelha para expor a LG. </li><li> Use uma pinça para soltar suavemente LG do tecido circundante. </li><li> Uma vez que a LG é liberado do tecido circundante, retire cuidadosamente a LG pelo duto,por onde agarrar a conduta e o epitélio circundante do olho conectar (Figura 1). </li><li> Colocar GL em tampão de lise de ARN para RT-PCR, ou fixar com PFA a 4% durante 20 min para imunocoloração. </li></ol>

<ol><li>Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmunity+in+the+pathogenesis+and+treatment+of+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Current+allergy+and+asthma+reports%22%5BJournal%5D)">Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca.</a> Current allergy and asthma reports. 14, 403(2014).</li>
<li>Makarenkova, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF10+is+an+inducer+and+Pax6+a+competence+factor+for+lacrimal+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF10 is an inducer and Pax6 a competence factor for lacrimal gland development.</a> Development. 127, Cambridge, England. 2563-2572 (2000).</li>
<li>Dartt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regulation+of+lacrimal+gland+secretory+processes%3A+relevance+in+dry+eye+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+retinal+and+eye+research%22%5BJournal%5D)">Neural regulation of lacrimal gland secretory processes: relevance in dry eye diseases.</a> Progress in retinal and eye research. 28, 155-177 (2009).</li>
<li>Nigam, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+can+the+intrinsic+power+of+branching+morphogenesis+be+used+for+engineering+epithelial+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Concise review: can the intrinsic power of branching morphogenesis be used for engineering epithelial tissues and organs.</a> Stem cells translational medicine. 2, 993-1000 (2013).</li>
<li>Qu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan-dependent+restriction+of+FGF+diffusion+is+necessary+for+lacrimal+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan-dependent restriction of FGF diffusion is necessary for lacrimal gland development.</a> Development. 139, Cambridge, England. 2730-2739 (2012).</li>
<li>Rebustini, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MT2-MMP-dependent+release+of+collagen+IV+NC1+domains+regulates+submandibular+gland+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+cell%22%5BJournal%5D)">MT2-MMP-dependent release of collagen IV NC1 domains regulates submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental cell. 17, 482-493 (2009).</li>
<li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Profiles+of+Mouse+Submandibular+Gland+Development%3A+FGFR1+Regulates+Branching+Morphogenesis+in+Vitro+Through+BMP-+and+FGF-Dependent+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Profiles of Mouse Submandibular Gland Development: FGFR1 Regulates Branching Morphogenesis in Vitro Through BMP- and FGF-Dependent Mechanisms.</a> Development. 129, 24-5778 (2002).</li>
<li>Steinberg, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2b+signaling+regulates+ex+vivo+submandibular+gland+epithelial+cell+proliferation+and+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGFR2b signaling regulates ex vivo submandibular gland epithelial cell proliferation and branching morphogenesis.</a> Development. 132, Cambridge, England. 1223-1234 (2005).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnox%2C+SM+%22Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis%22">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis</a>. 329, Science. New York, N.Y. 1645-1647 (2010).</li>
<li>Magenheim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+restrain+pancreas+branching%2C+differentiation+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, Cambridge, England. 4743-4752 (2011).</li>
<li>Jaskoll, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF10%2FFGFR2b+signaling+plays+essential+roles+during+in+vivo+embryonic+submandibular+salivary+gland+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">FGF10/FGFR2b signaling plays essential roles during in vivo embryonic submandibular salivary gland morphogenesis.</a> BMC developmental biology. 5, 11(2005).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature cell biology. 16, 118-126 (2014).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasympathetic+stimulation+improves+epithelial+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration.</a> Nature communications. 4, 1494(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A versatilidade de cultura e manipular o LG ex vivo proporciona vantagens significativas para estudar o seu desenvolvimento. Isto inclui a velocidade a que o pesquisador é capaz de testar hipóteses e a multiplicidade de perturbações que podem ser realizados para avaliar a forma como epitelial, neuronais, células endoteliais e mesencyhmal interagem para formar o órgão. No entanto, há um número de advertências para a utilização deste modelo. Em primeiro lugar, em virtude de seu isolamento a glândula não está mais...

A glândula lacrimal (LG) é responsável pela secreção de lágrima aquosa crítica para a acuidade visual e a saúde, a manutenção e a protecção das células da superfície ocular. LG resultados disfunção em um dos distúrbios oculares mais comuns e debilitantes: doença de olho seco deficiente aquosa, o qual é caracterizado por irritação ocular, sensibilidade à luz e uma visão diminuída. No ser humano o LG reside na órbita acima da extremidade lateral do olho onde 3-5 excretores lágrimas condutas de depósito sobre a superfície ocular. O rato tem três pares de glândulas oculares, a mais estudada de que é a glândula lacrimal (LG) anterior localizado e ventral ao ouvido (exorbital) com lágrimas que viajam para o olho através de um único canal excretor. Semelhante a outros órgãos glandulares, a LG desenvolve através do processo de morfogênese epitelial ramificação em que um único broto epitelial dentro de um mesênquima condensado passa por várias rodadas de broto e formação de duto para asou uma intrincada rede interligada de ácinos e ductos de secreção (Figura 1) 2. Durante o desenvolvimento do epitélio torna-se vascularizado, bem como fortemente inervados por nervos parassimpáticos do gânglio pterigopalatina e, em menor grau pelos nervos simpáticos do gânglio cervical superior 3. As interacções entre as células de cada um destes tipos de células neuronais ou seja, epiteliais, endoteliais e mesenquimais, são essenciais para a função e manutenção do tecido adulto. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes coordenação LG desenvolvimento e regeneração, bem como a forma como tipo de comunicação inter-celular orienta esses processos ainda não está claro. O advento das embrionárias ex vivo técnicas de cultura permitiu a identificação de vias de desenvolvimento e regeneração em vários órgãos de ramificação 4. A cultura ex vivo dá o pesquisador a capacidade de manipular o órgão (memecânica, química ou genética) sob condições definidas, bem como para caracterizar o desenvolvimento de órgãos e as interacções célula-célula em tempo real. A LG exorbital do mouse é altamente favorável a esta técnica e estudos recentes têm definido sistemas que regulam seu desenvolvimento 2,5 sinalização. No entanto, apesar da necessidade de entender sinais moleculares subjacentes LG desenvolvimento e regeneração, que atualmente permanece pouco estudado, provavelmente devido às dificuldades técnicas de isolamento do órgão. Neste artigo, descrevemos como isolar e executar ex vivo da cultura do embrionário murino LG para definir programas de desenvolvimento.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 sem HEPES</td><td>SH3027101</td><td>Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>P0781</td> Solução de albumina <td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>de soro bovino</td><td>A9576</td> Solução de paraformaldeído <td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>16%</td><td>15710</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>Diluída a 4% em 1x Solução</td></tr> salina <tr><td>tamponada com fosfato PBS 10x</td><td>BP665-1</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 1x</td><td></td><td></td><td>Preparado a partir de 10x</td></tr><tr><td>estoque holo-Transferrin bovino</td><td>T1283</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&nbsp; mg/ml de solução-mãe em água. Congelar alíquotas de uso único em -20&nbsp; &deg;C. Adicionar ao meio DMEM/F12 até uma concentração final de 50&nbsp; &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico (Vitamina C)</td><td>A4544</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25&nbsp; mg/ml de solução-mãe em água. Congelar alíquotas de uso único em -20&nbsp; &deg;C. Adicionar ao meio DMEM/F12 até uma concentração final de 50&nbsp; &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Placas tratadas com cultura de tecidos BioLite 100 mm</td><td>130182</td><td>placas</td><td>não tratadas com cultura de tecidos da Thermo Scientific também podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Microscópio estéreo com iluminador de subestágio</td><td>Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>Qualquer microscópio de dissecação estéreo pode ser usado com uma base de luz transmitida.</td></tr><tr><td>Base do iluminador de subestágio para microscópio estéreo</td><td>TLB 4000</td><td>Diagnostics Instruments, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35&nbsp; mm Placas tratadas com cultura de tecidos</td><td>353001</td><td>Corning</td><td>Placas não tratadas com cultura de tecidos também podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Pratos de fundo de vidro não revestido de 50 mm</td><td>P50G-1.5-14-F</td><td>MatTek Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência de campo amplo</td><td>Axio Observer Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td>Qualquer microscópio de fluorescência (microscópio vertical, invertido ou de dissecação estéreo) pode ser usado para monitorar a expressão de GFP em baixa ampliação com uma câmera digital acoplada.</td></tr><tr><td>Microscópio Confocal</td><td>TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>A microscopia confocal é necessária para ver as estruturas celulares detalhadas. Qualquer microscópio confocal pode ser usado.</td></tr><tr><td>Pinça Micro-Fina SWISS, #5 (11.2&nbsp; cm)</td><td>17-305X</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td>São necessárias pontas finas para remover o mesênquima do epitélio. Agulhas de tungstênio também podem ser usadas.</td></tr><tr><td>Pinça de Ponta Padrão Dumont, #5 (11&nbsp; cm)</td> <td>91150-20</td><td>Ferramentas de Belas Ciências (EUA), Inc.</td><td>Ideal para a colheita de glândulas de embriões.</td></tr><tr><td>Alças de faca cirúrgica de plástico reutilizáveis, estilo nº 3.</td><td>4-30</td><td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas cirúrgicas estéreis de aço inoxidável, nº 10</td><td>4-310</td> Kit de isolamento de RNA total RNAqueous-Micro da <td>Integra LifeSciences Corporation</td><td></td></tr><tr><td></td><td>AM1931</td><td>Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I</td><td>3446-005-01</td><td>Trevigen</td><td>6 mg/ml diluído 1:1 com DMEM/F12</td></tr><tr><td>Gravidez cronometrada Crl:CD1(ICR) camundongos</td><td>Charles River</td><td>Labs Os embriões são colhidos no dia 14 (com o dia da descoberta do plugue designado como dia 0).</td><td></td></tr><tr><td>Membranas Hidrofílicas Gravadas com Trilha de Nucleóporos, 0.1&nbsp; &mu; m tamanho do poro, 13&nbsp; mm</td><td>110405</td><td>Whatman</td><td></td></tr><tr><td>Cronometrado Grávida Pax6-Cre, camundongos GFP</td><td>Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr</td><td>The Jackson</td><td>Laboratory Camundongos opcionais para aprender a localizar o LG.</td></tr></tbody></table>

manipulando o murino lacrimais gland

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

A glândula lacrimal (LG) segrega lágrimas aquosas necessárias para a manutenção da estrutura e função da córnea, um tecido transparente essencial para a visão. No ser humano uma única LG reside na órbita acima da extremidade lateral de cada olho entregar lágrimas para a superfície ocular através de 3-5 condutas. O rato tem três pares de glândulas oculares, a mais estudada de que é a glândula lacrimal exorbital (LG) anterior localizado e ventral ao ouvido. Semelhante a outros órgãos glandulares, o LG desenvolve através do processo de epitelial morfogénese de ramificação em que um único broto epitelial dentro de um mesênquima condensada é submetido a vários ciclos de gema e formação adesiva para formar uma intrincada rede interligada de ácinos secretora e condutas. Este processo elaborado tem sido bem documentado em muitos outros órgãos epiteliais, tais como o pâncreas e glândulas salivares. No entanto, a LG tem sido muito menos explorado e os mecanismos que controlam a morfogênese são mal sobse levantou. Suspeitamos que essa sub-representação como um sistema modelo é uma conseqüência das dificuldades associadas com a descoberta, dissecando e cultivando a LG. Assim, aqui descrevemos técnicas de dissecação para a colheita embrionário e pós-natal LG e métodos para a ex vivo da cultura do tecido.

O LG desenvolve através do processo de ramificação epitelial morfogénese. Imagens de campo claro de GL embrionárias dissecados em e14, e15, e16, e17, e P2 ilustrar este evento. <img alt="A Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51970/51970fig1highres.jpg" width="600"> Figura 1. A LG desenvolve através do processo de ramificação morfogênese epitelial. Imagens de campo claro de GL embrionárias recentemente dissecados em...

A glândula lacrimal (LG) é um órgão de ramificação que produz os componentes aquosos de lágrimas necessários para a manutenção da visão e saúde ocular. Aqui nós descrevemos murino LG dissecção e ex vivo de técnicas de cultura de decifrar as vias de sinalização envolvidas na LG desenvolvimento.

Manipulando o Murino lacrimais Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

O objetivo geral do experimento a seguir é analisar o desenvolvimento da glândula lacrimal usando uma abordagem ex vivo para a manipulação e análise de eventos de sinalização durante o desenvolvimento da glândula. Isso é conseguido dissecando primeiro as glândulas lacrimais dos embriões do dia 16. Como segunda etapa, as glândulas são colocadas em filtros, flutuando em cultura, meio contendo inibidores de pequenas moléculas ou fatores de crescimento que alteram o desenvolvimento da glândula lacrimal.Após 24 horas, as glândulas são fixadas e coradas imunologicamente para as proteínas de desenvolvimento de interesse. Em última análise, as mudanças na expressão proteica durante o desenvolvimento ex vivo da glândula lacrimal podem ser analisadas por microscopia imunofluorescente. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do desenvolvimento da glândula lacrimal.Por exemplo, quais são os mecanismos de sinalização que definem a glândula lacrimal? Morfogênese A demonstração visual deste método é crítica, pois a glândula lacrimal é difícil de reconhecer durante o desenvolvimento embrionário inicial sem alguma orientação visual e prática para localizá-la. Para colher a glândula lacrimal de um camundongo embrionário, use etanol a 70% para esterilizar o lado ventral de um dia embrionário, 14 a 16 camundongos prenhes.Em seguida, aperte a pele e corte a pele ao longo da linha média do animal para expor o peritônio, corte o peritônio para expor a cavidade abdominal e o miométrio e remova os dois chifres do miométrio e coloque em PBS frio. Em seguida, use a pinça número cinco para transferir os embriões dos sacos amnióticos para uma segunda placa de Petri estéril contendo PBS frio, tomando cuidado para não tocar nos olhos ou na área da cabeça. Depois de cortar a cabeça do tronco, logo abaixo da mandíbula inferior, gire a cabeça para que a mandíbula fique agora na placa de dissecação.Em seguida, use uma pinça para estabilizar a cabeça e um bisturi para remover cerca de um quarto do lado dorsal do cérebro, oriente a cabeça para que o bisturi possa perfurar o nariz entre os olhos e, em seguida, faça um corte no centro da cabeça para que os olhos estejam agora em metades separadas. Em seguida, usando a iluminação acima e abaixo, pegue a pele do canto inferior posterior do olho e puxe cuidadosamente a pele aberta com a pinça para expor a glândula lacrimal, que deve aparecer como um botão em um ducto dentro de um mesênquima condensado mais escuro. Disseque cuidadosamente a glândula lacrimal e o mesênquima associado longe do tecido circundante, tomando cuidado para não agarrar a glândula lacrimal ou seu ducto associado.Então, quando a glândula lacrimal estiver livre do tecido circundante, segure suavemente o epitélio ao redor do olho na base do ducto da glândula lacrimal e remova toda a glândula. Tome cuidado para preservar o Meen chi ao redor do epitélio, que pode ser observado como um tecido condensado no qual o epitélio invagina. Em seguida, cultive de quatro a cinco glândulas lacrimais por um filtro em uma placa de Petri contendo meio de cultura e inibidores de moléculas pequenas ou fatores de crescimento de interesse por 24 horas para colher a glândula lacrimal de um camundongo pós-natal ou adulto, primeiro pulverize a área dos olhos com 70% de etanol.Em seguida, coloque o lado lateral do animal para cima sob um microscópio de dissecação com iluminação de cima. Em seguida, use uma pequena tesoura de dissecção para fazer uma incisão na epiderme lateralmente de onde a glândula lacrimal deve ser localizada. Em seguida, abra a epiderme em direção à orelha para expor a glândula lacrimal, que no camundongo pós-natal e adulto é delimitada pela artéria carótida, o músculo macado e a derme Afrouxe suavemente a glândula lacrimal do tecido circundante com a pinça e, em seguida, uma vez que a glândula lacrimal é liberada do tecido circundante, aperto, onde o ducto e o epitélio ao redor do olho se conectam e removem cuidadosamente a glândula.Finalmente, fixe as glândulas lacrimais com 4% de formaldeído por 20 minutos antes da imunocoloração. Para as proteínas de desenvolvimento de interesse, a glândula lacrimal se desenvolve através do processo de morfogênese de ramificação epitelial. Essas imagens de campo claro de glândulas lacrimais embrionárias, dissecadas nos dias embrionários 14, 15, 16, 17 e no segundo dia pós-natal, ilustram esse processo.Observe que, à medida que o epitélio aumenta de tamanho, a quantidade de mesênquima diminui, conforme ilustrado nessas imagens. As glândulas lacrimais desenvolvem-se em condições de cultura in vivo de maneira semelhante às culturas de glândulas in vivo, e as glândulas lacrimais recém-dissecadas podem ser fixadas para análise imunofluorescente. Por exemplo, nesta imagem, a coloração dos nervos do epitélio e dos vasos sanguíneos.Em um embrionário, uma glândula lacrimal 16 de um embrião CD do tipo selvagem pode ser observada a expressão de GFP na glândula lacrimal por camundongos PAC seis CRE pós-natais ou adultos facilita uma rápida identificação e dissecção da glândula lacrimal desses animais transgênicos. Embora esse método possa fornecer informações sobre o desenvolvimento da glândula lacrimal, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como disfunção da glândula lacrimal devido a doença autoimune ou tratamento de irradiação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como localizar e isolar a glândula lacrimal murina para análise de cultura ex vivo.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo descreve o procedimento cirúrgico para remover as duas partes: palpebral e orbital da glândula lacrimal superior de um coelho para criar um modelo de doença do olho seco. Este modelo de coelho é adequado para estudos de homeostase da superfície ocular, fisiopatologia e terapêutica ocular.

Remoção da glândula lacrimal superior: uma técnica cirúrgica para remover as partes palpebral e orbital da glândula lacrimal superior do modelo de coelho

Neste vídeo, descrevemos um procedimento cirúrgico para remover a grande glândula lacrimal inferior de um modelo de coelho para estudar o efeito na produção de lágrimas no animal.

Remoção da glândula lacrimal inferior do modelo de coelho: um procedimento cirúrgico para remover a glândula lacrimal inferior maior da órbita do olho do coelho

Este vídeo descreve o procedimento para induzir a doença do olho seco em um modelo de coelho por meio de uma injeção de Concanavalina A no lobo orbital da glândula lacrimal superior. O modelo desenvolvido é útil para estudar a eficácia de vários medicamentos no tratamento da doença do olho seco.

Realização de injeção no lobo orbital da glândula lacrimal superior: uma técnica para induzir a doença do olho seco em modelo de coelho

A glândula lacrimal (LG) tem dois tipos de células expressando α-actínio do músculo liso (αSMA): células mioepiteliais (MECs) e pericytes. Os MECS são de origem ectodérmica, encontrados em muitos tecidos glandulares, enquanto os pericitos são células musculares lisas vasculares de origem endodérmica. Este protocolo isola MECS e pericitos de LGS murino.

Isolamento de células mioepiteliais das glândulas lacrimal e submandibular de Murina adulta

Este artigo descreve o desenvolvimento de um método para induzir doenças agudas ou crônicas do olho seco em coelhos injetando concanavalina A a todas as porções do sistema de glândula lacrimal orbital. Esse método, superior aos já relatados, gera um modelo reprodutível e estável de olho seco adequado para o estudo de agentes farmacológicos.

Um modelo de coelho da doença aquosa-deficiente do olho seco induzida pela concanavalina Uma injeção nas glândulas lacrimal: aplicação a estudos de eficácia de drogas

Uma nova abordagem é apresentada para induzir doença ocular seca crônica em coelhos, removendo cirurgicamente todas as glândulas lacrimais orbitais. Este método, distinto daqueles relatados previamente, produz um modelo estável, reproduzível do olho seco deficiente aquoso bem serido para estudar a fisiologia do rasgo e a fisiopatologia e a terapêutica ocular.

Estabelecimento de um modelo severo do olho seco usando dacryoadenectomy completo nos coelhos

O método de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal adulta (LG) está bem estabelecido para a indução da formação organoide LG e diferenciação em células acinar ou ductais.

Sistema de cultura tridimensional e livre de soro para células-tronco da glândula lacrimal

Este protocolo descreve como estabelecer, manter, modificar geneticamente, diferenciar, caracterizar funcionalmente e transplantar organoides da glândula lacrimal derivados de tecido primário de camundongo e humano.

Estabelecimento, Manutenção, Diferenciação, Manipulação Genética e Transplante de Organoides de Glândulas Lacrimais de Camundongos e Humanos

Aqui, estabelecemos um modelo de disfunção da glândula lacrimal em ratos para fornecer uma base para o estudo do olho seco aquoso-deficiente.

Modelo de Olho Seco de Rato com Disfunção da Glândula Lacrimal Induzida por Escopolamina

Aqui, apresentamos um método para estabelecer um modelo de camundongo de olho seco deficiente em aquos, excisando as glândulas lacrimais extraorbital e infraorbital e avaliar as alterações na superfície ocular no olho seco por deficiência aquosa.

Estabelecimento de um modelo de camundongo de olho seco por deficiência aquosa

Aprenda a dissecar e cultivar glândulas lacrimais de embriões de camundongo para análise ex vivo do desenvolvimento glandular. Este método permite manipular vias de sinalização e estudar expressão proteica por imunofluorescência.

Manipulando o Murino lacrimais Gland

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