Name: Preparação de uma Cultura Pellet sangue para rápida identificação bacteriana e Antibiótico Teste à Susceptibilidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Aprenda a preparar culturas pellet de sangue para identificação bacteriana rápida por MALDI-TOF e testes de susceptibilidade antibiótica. Este método reduz o tempo de diagnóstico em horas cruciais.

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Agradecemos aos técnicos do laboratório de bacteriologia do Hospital Central de Lausanne University por sua ajuda para implementar as técnicas no laboratório.

Este protocolo foi desenvolvido e validado seguindo os processos de pesquisa e desenvolvimento e as normas éticas da nossa instituição antes de ser implementado como uma ferramenta de rotina. 1 Preparação de uma Cultura de sangue bacteriana Pellet por Amônio Procedimento Chloride Erythrocyte-lise <ol><li> Preparação de uma hemocultura positiva para posterior centrifugação. <ol><li> Esterilizar a tampa hemocultura. Adicionar 70% de etanol na tampa da garrafa e queimá-lo. NOTA: Não execute este passo debaixo de uma capela de fluxo laminar. </li><li> Mover o frasco para uma câmara de fluxo laminar. Recolha 5 ml da cultura de sangue com uma seringa 20 G. </li><li> Adicionar os 5 ml de cultura de sangue em um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 45 ml de água estéril (H 2 O) e agitar a amostra. </li></ol></li><li> Preparação de uma cultura de sangue pelete bacteriana por centrifugação a lise. <ol><li> Centrifuga-se a amostra a 1000 xg durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Remove-se o sobrenadante (que contém principalmente H2O e células do sangue) com uma bomba de vácuo de laboratório. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de cloreto de amónio caseira solução (0,15 M NH 4 Cl, 1 mM KHCO 3) de lise. Quebrar o sedimento por raspagem e em vortex do tubo e centrifugar a amostra a 140 xg durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Rejeitar o sobrenadante, que contém principalmente detritos de células vermelhas do sangue. <ol><li> Se o sedimento permaneceu hemorrágico, ressuspender o sedimento em 2 ml de solução estéril destilada e H 2 0 para lisar os glóbulos vermelhos mais residuais e para lavar o sedimento. Centrifuga-se a amostra a 140 xg durante 10 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. </li></ol></li><li> Ressuspender o sedimento em 200 ul de H2O </li></ol></li><li> Subcultura da cultura de sangue em vários meios de ágar seletivo e não seletivo. <ol><li> Recolha de 1 ml da cultura de sangue com uma seringa 20 G. </li><li> Inocular uma gota de hemocultura into quatro quadrantes em ágar-sangue, ágar chocolate, ágar McConkey e ágar Schaedler. </li><li> Incubar a 37 ° C, o agar de sangue e as placas de ágar de chocolate em uma atmosfera de CO2 a 5%, o agar McConkey em atmosfera normal e a placa de ágar Schaedler em condições anaeróbicas. </li><li> Siga o crescimento bacteriano na mídia diferente. </li><li> Verifique se há pureza bacteriana. </li></ol></li></ol> 2 Identificação por MALDI-TOF MS <ol><li> Identificação direta do sedimento sangue. <ol><li> Transferir 1 mL da pelota de sangue em uma placa-alvo MALDI e deixe secar sobre uma plataforma de aquecimento de 42 ° C. </li><li> Sobreponha a amostra com ácido fórmico 1 ml de 70% e deixe secar sobre uma plataforma de aquecimento de 42 ° C. </li><li> Sobreponha a amostra com 1 ml de matriz MALDI e deixe secar sobre uma plataforma C de aquecimento 42 ° (solução de α-ciano-4-hidroxicinâmico em 50% de acetonitrilo-2.5% de ácido trifluoroacético saturada). </li><li> Vá para a MALDI-TOF MS a análise com um sistema de MALDI-TOF MS, como descrito pelos fabricantes. </li><li> Se a pontuação de identificação não é válido a nível de espécie (por exemplo, com um score &lt;2), realizar uma extração de proteínas da amostra de sedimento sangue. </li></ol></li><li> Identificação após a extracção de proteínas a partir do sedimento da cultura do sangue. <ol><li> Misturar 20 ul do sedimento com 1 ml de etanol a 70% e centrifuga-se a 13.000 xg durante 2 min à temperatura ambiente. </li><li> Descartar o sobrenadante e adicionar 25 ul de ácido fórmico a 70% e 25 mL de 100% de acetonitrilo ao sedimento. Vortex vigorosamente, para voltar a suspender as pelotas. Ressuspender pelotas duras ao dividi-los com pontas de pipeta antes de vórtex. </li><li> Centrifuga-se a 13000 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Transferir 1 mL do sobrenadante (que contém proteínas extraídas) em uma placa-alvo MALDI e deixe secar sobre uma plataforma de aquecimento de 42 ° C. Proceda como descrito no ponto 2.1.2. </li></ol></li></ol> 3. bacteriana Identificação e Antibiótico Suscetibilidade Testes com um sistema automatizado Microbial <ol><li> Preparação de uma suspensão bacteriana para a identificação de bactérias e a AST, com um sistema automatizado microbiana. <ol><li> Preparar um tubo de plástico contendo 3 ml de solução estéril de 0,45% de NaCl compatível com o sistema microbiano automatizado. </li><li> Adicionar um volume suficiente da pelete da cultura de sangue em solução de NaCl a 0,45% para se obter uma suspensão bacteriana correspondente para uma turbidez de McFarland de 0,6 a 0,8. Medir a turvação, utilizando um densitómetro de máquina. Nota: O volume do sedimento bacteriano, cultura do sangue varia de 50 a 200 ul para atingir uma turbidez de McFarland de 0,6 a 0,8. </li></ol></li><li> Inocular as bactérias Gram-positivas (GP) ou Gram-negativa (GN) cartões automáticos de identificação e os cartões AST automatizadas para testes de susceptibilidade antimicrobiana de cocos Gram-positivos e Gram-negativas, como descrito pelo fabricante. NOTA: identification com GP ou cartões de GN não é aplicada se MALDI-TOF MS valor pontuação identificação é&gt; 2. Verifique a pureza da suspensão bacteriana por subcultura a suspensão bacteriana em agar de sangue (GP e GN) e ágar de MacConkey (GN) placas. </li></ol> 4. Antibiótico Teste à Susceptibilidade pelo Disk Diffusion Assay O ensaio de difusão em disco é descrito pelo Comité Europeu para os testes de susceptibilidade antimicrobiana (EUCAST, versão 3.0, em abril de 2013, www.eucast.org). <ol><li> Preparação de uma suspensão bacteriana para realizar testes de susceptibilidade antimicrobiana pelo método de difusão em disco. <ol><li> Preparar um tubo de vidro contendo 3 ml de solução estéril de NaCl a 0,9%. </li><li> Adicionar um volume suficiente da pelete da cultura de sangue em solução de NaCl 0,9% para obter uma suspensão bacteriana correspondente para uma turbidez de McFarland de 0,5. Medir a turvação, utilizando um densitómetro de máquina. NOTA: O volume da cultura de sanguesedimento bacteriano varia de 50 a 200 ul para atingir uma turbidez de McFarland de 0,6 a 0,8. </li><li> Vortex a suspensão bacteriana. </li></ol></li><li> Inoculação de suspensão bacteriana em agar Mueller-Hinton (MH) ou de Mueller-Hinton agar-agar de organismos fastidiosos (MHF) (MH suplementado com 5% de sangue de cavalo desfibrinado e 20 mg / L de β-nicotinamida adenina dinucleótido). <ol><li> Mergulhar uma mecha de algodão estéril na suspensão bacteriana e cuidadosamente remover o excesso de fluido, rodando a mecha na parede interior do tubo de vidro. </li><li> Espalhar a suspensão bacteriana uniformemente sobre toda a superfície da placa de agar MH / MHF por raspagem em três direcções, ou por meio de um rotor placa automatizado. </li></ol></li><li> Aplicação de discos antimicrobianos em placas de ágar inoculadas. <ol><li> Aplicar perto os discos na superfície das placas de agar inoculadas secas manualmente ou utilizando um dispensador de disco de sensibilidade. </li><li> Incubar a placa na tempe apropriadoratura e atmosfera, conforme descrito no teste de suscetibilidade método de difusão em disco EUCAST antimicrobiana (Versão 3.0, em abril de 2013, www.eucast.org). </li></ol></li></ol> Baseado em PCR 5. automatizado de teste de diagnóstico para a detecção do MRSA <ol><li> Usando uma micropipeta, transferir 50 ul do sedimento de cultura de sangue para dentro do frasco de reagente de amostra fornecido com o MRSA baseada em PCR kit de teste de diagnóstico e automatizado vórtice durante 20 seg. </li><li> Usando uma micropipeta 1 ml, distribuir a amostra na porta espécime do cartucho. Inserir o cartucho dentro do sistema de PCR automatizado e iniciar o ensaio, tal como descrito pelo fabricante. </li></ol>

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<li>Prod&34hom, G., Durussel, C., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+blood-culture+bacterial+pellet+preparation+for+faster+accurate+direct+bacterial+identification+and+antibiotic+susceptibility+testing+with+the+VITEK+2+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">A simple blood-culture bacterial pellet preparation for faster accurate direct bacterial identification and antibiotic susceptibility testing with the VITEK 2 system.</a> Journal of medical microbiology. 62, 773-777 (2013).</li>
<li>Clerc, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+and+PCR-based+rapid+diagnosis+of+Staphylococcus+aureus+bacteraemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry and PCR-based rapid diagnosis of Staphylococcus aureus bacteraemia.</a> Clin Microbiol Infect. , (2013).</li>
<li>Martiny, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+rapid+microbial+identification+directly+from+positive+blood+cultures+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+on+patient+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Impact of rapid microbial identification directly from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry on patient management.</a> Clin Microbiol Infect. 19, E568-E581 (2013).</li>
<li>Stoneking, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Would+earlier+microbe+identification+alter+antibiotic+therapy+in+bacteremic+emergency+department+patients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+emergency+medicine%22%5BJournal%5D)">Would earlier microbe identification alter antibiotic therapy in bacteremic emergency department patients.</a> The Journal of emergency medicine. 44, 1-8 (2013).</li>
<li>Nordmann, P., Dortet, L., Poirel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae.</a> J Clin Microbiol. 50, 3016-3022 (2012).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Comparado aos métodos diagnósticos hemocultura positiva convencionais, a rápida aquisição de um sedimento de bactérias, utilizando o cloreto de amônio lise abordagem centrifugação reduzir o tempo para relatar a identificação por 16 a 24 horas eo tempo para relatar AST por 24-48 horas (Figuras 1 e 3). A rápida introdução de antibioticoterapia adequada é fundamental para melhorar a evolução dos pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea. Assim, a identificação pre...

Infecções da corrente sanguínea e septicemia em pacientes hospitalizados são uma das principais causas de morbidade e mortalidade. Assim, a mortalidade relacionada com a corrente sanguínea infecções é observada em cerca de 14% a 37% dos pacientes hospitalizados e pode aumentar para 35% em unidades de terapia intensiva de pacientes 1-3. A rápida identificação do agente infeccioso é fundamental para orientar o tratamento antimicrobiano ideal e aumentar o êxito da terapia antimicrobiana 4,5. A análise rápida da coloração Gram da hemocultura positiva já tem um impacto significativo sobre a adaptação da terapia antimicrobiana 6,7, mas a identificação precisa do agente infeccioso é obrigada a fornecer o tratamento antibiótico mais adequado às pacientes. Por exemplo, diferentes regimes de tratamento antibiótico devem ser implementadas após bacteremia com enterococos e estreptococos que são difíceis de distinguir pela coloração de Gram. Do mesmo modo, a identificação da espécie level é necessária para detectar bactérias Gram enterobactérias negativa que codifica um gene cromossómico ampC que conferem uma maior resistência à β-lactâmicos 8. Com uma hemocultura positiva, a abordagem convencional de diagnóstico é a subcultura do agente infeccioso em diferentes placas de ágar, que requer várias horas de incubação adicional identificação prévia com várias abordagens, incluindo testes bioquímicos, o crescimento em diferentes meios seletivos e sistemas de identificação microbiana automatizadas. O tempo para os resultados de um método de diagnóstico convencional é de cerca de 1 a 3 dias. O surgimento da tecnologia de matriz assistida por laser de dessorção / ionização por espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF), para a rápida identificação de microrganismos forneceu uma nova ferramenta para identificar rapidamente os microrganismos a partir de colónias que cresceram em placas de agar como também directamente a partir de sangue positiva culturas (Figura 1), 9-12. The uso de MALDI-TOF para identificar um agente infeccioso a partir de culturas de sangue tem reduzido significativamente o tempo para resultados de alguns minutos em vez de horas e dias exigidos por métodos tradicionais. Como discutido por Croxatto et al. 13, a eficiência de identificação de MALDI-TOF depende de diferentes parâmetros, incluindo a quantidade e pureza do microrganismo. Estes dois critérios são facilmente obtidos a partir de colónias discretas cultivadas em placas de agar, mas é necessária uma pré-tratamento analítico de enriquecimento bacteriana e purificação de amostras complexas, tais como a cultura de sangue, que contêm vários componentes celulares e de proteínas que podem interferir com a identificação de MALDI-TOF. Vários métodos de isolamento de microrganismos de cultura do sangue tenham sido utilizados num certo número de estudos, incluindo a saponina ou outro método de detergentes suaves para a extracção 9,14 bacteriana, método de separação de soro de 10, a lise métodos de centrifugação 12 </sse&gt; e soluções comercialmente, tais como o kit sepsityper. O nosso laboratório de diagnóstico bacteriológico desenvolveu um simples sangue-cultura preparação sedimento bacteriano à base de cloreto de amónio-lise dos eritrócitos, que permitem uma identificação rápida de bactérias e levedura por MALDI-TOF e sistemas de identificação automáticos (Figura 2) 15. Esta preparação de pelotas de sangue-cultura também fornecer uma amostra para outras aplicações diretas jusante, tais como coloração de Gram, testes de diagnóstico automatizado com base na PCR, como POCT-PCRs para a detecção rápida de resistente à meticilina Staphylococcus aureus (MRSA), e os testes de sensibilidade aos antibióticos com sistemas automatizados de AST e / ou por ensaios de difusão de disco em placas de agar (Figura 3). Neste trabalho, nós descrevemos os diferentes passos para a preparação do sedimento bacteriano sangue-cultura, tal como explicado por Prod&#39;hom et al. 15 (Figura 4). Nós também irá deescriba os protocolos de três das principais aplicações que podem ser executadas no pellet hemocultura: Identificação por MALDI-TOF 15, a identificação (ID) e teste de sensibilidade aos antibióticos (AST) com os sistemas automatizados 16 de Enterobacteriaceae e estafilococos e PCR-automatizado teste de diagnóstico baseado na detecção de MRSA 17.

<table><tbody><tr><td>Agulha de 20 g</td><td>Terumo, Leuven, Bélgica</td><td>NN-2038R</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Falcon tube</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>352070</td><td>Tubos de centrífuga de 50 ml Chlorure</td></tr><tr><td>de amônio</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>101145</td><td></td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de potássio</td><td>Fluka, St. Louis, MO, USA&nbsp;</td><td>60340</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA&nbsp;</td><td>F0507</td><td>Ácido inflamável, corrosivo</td></tr><tr><td>&#945;-ciano-4-hidroxicinâmico</td><td>Fluka, St. Louis, MO, EUA&nbsp;</td><td>70990</td><td>Toxicidade aguda</td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA&nbsp;</td><td>271004</td><td>Inflamável, toxicidade aguda</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA&nbsp;</td><td>T6508</td><td>Corrosivo, toxicidade aguda</td></tr><tr><td>Vitek 2 60 instrumento</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, França</td><td>27202</td><td>instrumento de sistema microbiano automatizado</td></tr><tr><td>Vitek 2 Gram-positive (GP) cartão</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, França</td><td>21342</td><td>cartão de identificação GP&nbsp; automatizado</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-P580 cartão</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, França</td><td>22233</td><td>sistema automatizado microbiano AST</td></tr><tr><td>Vitek 2 Gram-negativo (GN) cartão</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, França</td><td>21341</td><td>cartão de identificação GN&nbsp; automatizado</td></tr><tr><td>Vitek 2 AST-N242 cartão</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, França</td><td>413391</td><td>sistema AST microbiano automatizado</td></tr><tr><td>Xpert MRSA</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, EUA&</td><td>nbsp; Tecnologia de amplificação de ácidos nucleicos GXMRSA-100N-10</td><td>Instrumento MRSA</td></tr><tr><td>GeneXpert IV</td><td>Cepheid, Sunnyvale, Ca, EUA</td><td>Instrumento de tecnologia de amplificação de ácidos nucleicos</td><td>GXIV-4-D</td></tr><tr><td>Microflex LT MALDI-TOF MS instrumento</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>BDAL microflex LT/SH</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96 aço alvo BC</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>280799</td><td>placa alvo MALDI</td></tr><tr><td>Densitômetro Aparelho Densicheck</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, França</td><td>27208</td><td></td></tr><tr><td>MALDI Sepsityper kit 50</td><td>Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha</td><td>8270170</td><td></td></tr><tr><td>ágar Mac Conkey</td><td>Biolife, Milão, Itália</td><td>4016702</td><td></td></tr><tr><td>ágar Mueller-Hinton</td><td>Oxoid, Hampshire, Inglaterra</td><td>CM0337</td><td>ágar Mueller-Hinton (MH)&nbsp;</td></tr><tr><td>ágar MHF</td><td>Biom&eacute; rieux, Marcy-l'Etoile, França</td><td>43901</td><td>Ágar-ágar Mueller-Hinton organismos fastidiosos ágar (MHF)</td></tr><tr><td>BD ágar columbia III</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td>ágar</td><td>254071 sangue</td></tr><tr><td>BD ágar chocolate</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td>ágar</td><td>254089 chocolate</td></tr><tr><td>BD ágar schaedler</td><td>BD, Franklin Lakes, NJ, EUA</td><td>254084</td><td>ágar Schaedler</td></tr></tbody></table>

preparação de uma cultura pellet sangue para rápida identificação bacteriana e antibiótico teste à susceptibilidade

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Infecções da corrente sanguínea e septicemia são uma das principais causas de morbidade e mortalidade. O êxito de pacientes que sofrem de bacteremia depende de uma rápida identificação do agente infeccioso para orientar o tratamento antibiótico ideal. A análise de manchas Gram de hemocultura positiva pode ser rapidamente realizada e já impactar significativamente o regime de antibióticos. No entanto, a identificação precisa do agente infeccioso ainda é necessário para estabelecer o melhor tratamento direcionado. Apresentamos aqui uma preparação pellet bacteriano simples e rápido de uma hemocultura positiva que pode ser usado como um exemplo para várias aplicações a jusante essenciais, como a identificação por MALDI-TOF MS, teste de sensibilidade aos antibióticos (AST) pelo método de difusão de disco ou sistemas automatizados AST e por PCR automatizados baseados em testes de diagnóstico. O desempenho desses sistemas de identificação e AST diferentes aplicados diretamente sobre as culturas de sangue pelotas bacterianas é muito siMilar para o desempenho, normalmente obtido a partir de colónias isoladas cultivadas em placas de agar. Em comparação com métodos convencionais, a rápida aquisição de um sedimento bacteriano, reduz significativamente o tempo de identificação e relatam tanto AST. Assim, seguindo a positividade da hemocultura, identificação por MALDI-TOF podem ser relatados em menos de 1 hora enquanto que os resultados de AST por sistemas automatizados ou AST difusão em disco dentro de 8 a 18 horas, respectivamente. Da mesma forma, os resultados de um ensaio baseado em PCR rápida podem ser comunicadas para os clínicos menos do que 2 horas após o relatório de uma bacteremia. Juntos, estes resultados demonstram que a preparação rápida de um sedimento de bactérias hemocultura tem um impacto significativo sobre o tempo de identificação e AST reviravolta e, portanto, sobre o sucesso de pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea.

No estudo realizado por Prod'hom et al. 15, peletes bacterianas obtidas por lise de cloreto de amónio a centrifugação de 122 cultura sanguínea positiva a partir de 78 doentes foram analisadas por MALDI-TOF MS. Fora de 122 hemocultura positiva, 95 (77,9%) foram corretamente identificados ao nível da espécie e um (0,8%) no nível de gênero. Os restantes 26 (21,3%) pelotas de hemocultura não deu nenhuma identificação confiável por MALDI-TOF. Entre esses, 21 eram bactérias gram positivas, incluindo estrep...

Uma preparação sedimento bacteriano rápida de uma cultura de sangue positiva pode ser utilizado como uma amostra para aplicações tais como a identificação por MALDI-TOF, a coloração de Gram, teste de susceptibilidade aos antibióticos e ensaios baseados em PCR. Os resultados podem ser rapidamente comunicados aos médicos para melhorar a evolução dos pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea.

Preparação de uma Cultura Pellet sangue para rápida identificação bacteriana e Antibiótico Teste à Susceptibilidade

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar um pellet bacteriano a partir de uma hemocultura positiva que pode ser usada como amostra para várias aplicações. Isso é feito misturando primeiro uma hemocultura positiva com água estéril Após a centrifugação. O pellet é ressuspenso em cloreto de amônio para piolhos nos glóbulos vermelhos após uma segunda rodada de centrifugação.O pellet é ressuspenso em água. A etapa final é usar o pellet obtido para identificação bacteriana por ionização de dessorção a laser assistida por matriz, tempo de voo, coloração de Gram, teste de suscetibilidade a antibióticos e/ou testes baseados em PCR. Em última análise, os resultados adquiridos podem ser rapidamente comunicados aos médicos para melhorar o resultado de pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea.A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a subcultura bacteriana de hemoculturas positivas, é reduzir a identificação bacteriana em cerca de seis a 24 horas e reduzir o tempo para resultados de resistência a antibióticos em cerca de 24 horas. Este método pode ajudar a adaptar rapidamente o tratamento com antibióticos e melhorar o resultado de pacientes que sofrem de infecções da corrente sanguínea. Embora este método possa ser aplicado a métodos de identificação de rotina, como OV e a abordagens convencionais de testes de sustentabilidade antimicrobiana, ele também pode ser aplicado a novas tecnologias visando a ificação de fatores VUL e/ou mecanismos de resistência, como atividades ESBL e CARBAPENEMASE.A demonstração visual deste método é importante, pois a preparação bacteriana de PAL é crucial para obter material microbiano suficiente para aplicações a jusante, demonstrando o procedimento estarão Christian Durel, Maria Cortesi, Maria ti e Kim Giza, todos técnicos de laboratório do meu laboratório para preparar uma hemocultura positiva para centrifugação subsequente. Esterilize a tampa da hemocultura adicionando 70% de etanol na tampa do frasco e queimando-a. Em seguida, mova a garrafa para uma capa de fluxo laminar.Colete cinco mililitros da hemocultura com uma seringa de agulha calibre 20. Em seguida, adicione os cinco mililitros de hemocultura a um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo 45 mililitros de água estéril e misture a amostra. Centrifugue a amostra a 1000 Gs por 10 minutos.À temperatura ambiente, remova o sobrenadante com uma bomba de vácuo de laboratório. Em seguida, ressuspenda o pellet em um mililitro de cloreto de amônio caseiro. Solução de lisagem.Quebrar o pellet raspando e vortexando antes da centrifusão da amostra a 140 gs durante 10 minutos À temperatura ambiente após a centrifugação, rejeitar o sobrenadante, que contém principalmente detritos de glóbulos vermelhos. Se o pellet permaneceu hemorrágico Resus, suspenda o pellet em dois mililitros de água estéril e destilada para piolhos ainda mais glóbulos vermelhos residuais e lave o pellet após centrifugar a amostra como antes, descarte o sobrenadante, em seguida, ressuspenda o pellet em 200 microlitros de água e vortex o tubo para identificação direta do pellet de sangue. Primeiro, transfira um microlitro do pellet para uma placa alvo MALDI e deixe secar em uma plataforma de aquecimento de 42 graus Celsius.Cubra a amostra com um microlitro de ácido fórmico a 70% e deixe secar na plataforma de aquecimento. Em seguida, cubra a amostra com um microlitro de Maldi Matrixx e, novamente, deixe secar na plataforma de aquecimento. Prossiga para a análise maldi TOF MS com um sistema MALDI TOF MS conforme descrito pelos fabricantes.Se a pontuação de identificação for inválida no nível da espécie, realize uma extração de proteína da amostra de pellet de sangue misturando primeiro 20 microlitros do pellet com um mililitro de etanol a 70%. Em seguida, centrifugue a amostra a 13.000 Gs por dois minutos à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e adicione 25 microlitros de ácido fórmico a 70% e 25 microlitros de aceto nitrilo a 100% ao vórtice de pellets vigorosamente para ressuspender o pellet após centrifugação a 13.000 Gs por dois minutos. À temperatura ambiente, transfira um microlitro do sobrenadante para uma placa-alvo MALDI e deixe secar em uma plataforma de aquecimento a 42 graus Celsius.Para realizar a identificação bacteriana e o teste de suscetibilidade a antibióticos ou um ST primeiro, prepare um tubo de plástico contendo três mililitros de solução estéril de cloreto de sódio a 0,45% compatível com o sistema microbiano automatizado. Adicione um volume suficiente do pellet de hemocultura à solução e ao vórtice para obter uma suspensão bacteriana correspondente a uma turbidez de McFarland de 0,6 a 0,8, medida usando uma máquina de densitômetro. Em seguida, inocule os cartões gram-positivos ou gram-negativos automatizados para identificação.Inocule também os cartões automatizados a ST para testes de suscetibilidade antimicrobiana de cocos gram-positivos e bactérias gram-negativas, conforme descrito pelo fabricante. Realizar testes de suscetibilidade antimicrobiana por ensaio de difusão em disco. Primeiro, prepare um tubo de vidro contendo três mililitros de solução estéril de cloreto de sódio a 0,9%.Em seguida, adicione um volume suficiente do pellet de hemocultura à solução para obter uma suspensão bacteriana correspondente a uma turbidez de McFarland de 0,5, medida por uma máquina de densitômetro. Vortex a suspensão bacteriana para inocular a suspensão bacteriana. Primeiro, mergulhe um cotonete estéril na suspensão bacteriana e remova suavemente o excesso de fluido girando o cotonete na parede interna do tubo de vidro.Em seguida, espalhe a suspensão bacteriana uniformemente em toda a superfície de Mueller. Dica e broca ou dica de Mueller e broca para organismos exigentes esfregando em três direções ou usando um rotador de placas automatizado para aplicação de discos antimicrobianos em placas helicoidais inoculadas. Primeiro, aplique os discos na superfície das placas helicoidais inoculadas secas manualmente ou usando um dispensador de disco de suscetibilidade.Em seguida, incube a placa na temperatura e atmosfera apropriadas, conforme descrito no método de difusão em disco do Comitê Europeu de Teste de Suscetibilidade Antimicrobiana para realizar o teste de diagnóstico automatizado baseado em PCR. Primeiro, use uma micropipeta para transferir 50 microlitros do pellet de hemocultura para o frasco de reagente de amostra fornecido com o kit de teste de diagnóstico baseado em PCR automatizado MSA. Em seguida, vortex o frasco para injetáveis por 20 segundos usando uma micropipeta de um mililitro.Dispense a amostra na porta de amostra do cartucho. Insira o cartucho no sistema de PCR automatizado e inicie o ensaio conforme descrito pelo fabricante no laboratório de Lausanne. O resultado é validado diretamente e transmitido aos médicos graças à conectividade do sistema de PCR automatizado usado com um sistema de interface laboratorial ou LIS.Se um resultado for inválido, recomendamos repetir o ensaio após diluição dez vezes maior do sedimento bacteriano. Como isso geralmente se deve a inibidores de PCR, a hemólise de cloreto de amônio produziu um pellet de hemocultura de alta qualidade com poucos detritos eritrocitários em comparação com o controle negativo sem cloreto de amônio. A coloração de Gram de hemocultura positiva de Escher Coli Coagulase Staphylococcus capita negativo e estreptococo disco EA foi realizada antes e após o preparo da hemocultura.A preparação bacteriana do pellet usando esta abordagem permite concentrar o microrganismo em cerca de 100 a 1000 vezes. No geral, existem várias aplicações a jusante que podem ser realizadas a partir do pellet de hemocultura, que se beneficiam de um tempo reduzido para resultados sem sensibilidade e especificidade reduzidas em comparação com ensaios feitos em colônias isoladas. Uma vez dominado o patê, a preparação pode ser feita em cerca de 30 minutos se for executada corretamente.Não se esqueça de que trabalhar com hemocultura pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar com luvas e sob o capuz de fluxo laina devem ser tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um protocolo rápido para a identificação directa de Enterococcus faecalis e Enterococcus outras espécies a partir de uma hemocultura positiva usando um ácido nucléico Peptide fluorescentes em ensaio de hibridização in situ (FISH PNA).

Um Procedimento de 1,5 horas para a Identificação de Enterococcus Espécies Diretamente de hemoculturas

O desenho de um esquema de fluxo de trabalho simples de um dia para diagnóstico de patógenos bacterianos permite o reconhecimento rápido de infecções da corrente sanguínea. A inclusão de oito clinicamente relevantes alvos bacterianas e os seus perfis de resistência a antibióticos oferece a percepção um clínico inicial no mesmo dia, o que pode levar a uma terapia mais adequada.

Um dia-Esquema de fluxo de trabalho para detecção de patógenos de bactérias e de resistência antimicrobiana de hemoculturas

Recentemente, relatou uma nova abordagem para a geração de sondas DNAzyme fluorogênicos que podem ser aplicadas para criar um simples, "mistura-e-ler" teste de fluorescência para a detecção bacteriana. Estas sondas de DNA especiais catalisar a clivagem de um cromóforo-modificado substrato DNA-RNA quimérico, na presença de mistura extracelular em bruto (CEM) produzida por uma bactéria específica, assim, traduzindo a detecção de bactérias em geração do sinal de fluorescência. Neste relatório, irá...

Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

Fonte: Koeth, L. M., et. al., Um método de microdiluição de caldo de referência para teste de suscetibilidade in vitro de dalbavancina de bactérias que crescem aeróbicas. J. Vis. Exp. (2015).Este vídeo demonstra o método de microdiluição em caldo para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) de um antibiótico lipoglicopeptídico contra bactérias Gram-positivas. Abrange o isolamento de colônias bacterianas, diluição, inoculação de poços de microplacas com concentrações variadas de...

Um método de microdiluição em caldo para teste de suscetibilidade a antibióticos de bactérias Gram-positivas

A aplicação de matriz assistida por laser de dessorção / ionização por tempo de voo (MALDI-TOF), espectrometria de massa (MS) directamente ao caldo de cultura do sangue acelera a identificação de bactérias. O método apresentado é um método rápido e fiável para a identificação de bactérias Gram-negativas directamente do caldo de cultura do sangue.

Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

Antimicrobiana sinergia teste é usado para avaliar o efeito de dois ou mais antibióticos usados em combinação e é normalmente realizada por um dos dois métodos: a matriz do tabuleiro de damas ou o ensaio de matar tempo. Aqui, apresentamos um automatizado, jato de tinta impressora assistida quadriculado matriz sinergia técnica e um estudo clássico sinergia... matar tempo.

Antimicrobiana sinergia testes pela impressora jato de tinta-assistida matriz Checkerboard automatizado e o método Manual de tempo-kill

Antibióticos fluorescentes são ferramentas poderosas que podem ser usadas para estudar múltiplos aspectos da resistência antimicrobiana. Este artigo descreve a preparação de antibióticos fluorescentes e sua aplicação para estudar a resistência a antibióticos em bactérias. As sondas podem ser usadas para estudar mecanismos de resistência bacteriana (por exemplo, efflux) por espectrofotometria, citometria de fluxo e microscopia.

Visualização da resistência bacteriana usando sondas de antibióticos fluorescentes

Este protocolo apresenta ensaio rápido de suscetibilidade antimicrobiana (AST) em até 2,5 h por imagem de espalhamento Raman estimulado por célula única do metabolismo de D2O. Este método aplica-se a bactérias no ambiente urinário ou no sangue total, o que é transformador para AST fenotípica de célula única rápida na clínica.

Teste Rápido de Suscetibilidade a Antimicrobianos por Imagem de Dispersão Raman Estimulada da Incorporação de Deutério em uma Única Bactéria

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento e identificação de bactérias resistentes a antibióticos da água e a caracterização molecular de seus genes de resistência a antibióticos (ARGs). O uso de técnicas baseadas em cultura e não baseadas em cultura (análise metagenômica) fornece informações completas sobre a diversidade bacteriana total e o pool total de diferentes ARGs presentes em águas doces de Mumbai, Índia.

Isolamento e Identificação de Bactérias Resistentes a Antibióticos Transmitidos pela Água e Caracterização Molecular de seus Genes de Resistência a Antibióticos

A EUCAST desenvolveu um protocolo direto de teste de suscetibilidade antimicrobiana (AST) para hemoculturas automatizadas. No entanto, sua dependência da identificação microbiana baseada em espectrometria de massa pode ser evitada usando um protocolo de preparação direta de inóculo em um sistema automatizado de identificação microbiana. Essa abordagem pode fornecer relatórios de AST dentro de 24 horas após a coleta da amostra.

Identificação microbiana direta usando um sistema automatizado de identificação microbiana para facilitar o método EUCAST RAST sem espectrometria de massa

Aprenda a preparar culturas pellet de sangue para identificação bacteriana rápida por MALDI-TOF e testes de susceptibilidade antibiótica. Este método reduz o tempo de diagnóstico em horas cruciais.

Preparação de uma Cultura Pellet sangue para rápida identificação bacteriana e Antibiótico Teste à Susceptibilidade

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