Único plano Iluminação Módulo e Abordagem Micro-capilar por um microscópio Wide-campo

O objetivo geral deste procedimento é realizar microscopia de iluminação de plano único usando um módulo de excitação de folha de luz para microscópios invertidos e aplicá-lo a esferoides de células tridimensionais. Isso é feito primeiro usando uma pipeta para transferir um esferóide celular do poço de uma placa de microtitulação para um segundo poço para incubar após a lavagem. O esferóide S é então introduzido em um capilar retangular.

O segundo passo é montar o módulo de iluminação da folha de luz na placa de base da mesa de posicionamento do microscópio invertido. Em seguida, o capilar contendo o esteróide é colocado em um suporte de amostra especial para microscopia. A etapa final é definir a correspondência entre a folha de luz e o plano focal da lente objetiva do microscópio no caminho de detecção.

Em última análise, as medições de fluorescência tridimensionais podem ser realizadas pela variação do plano focal dentro do esferóide celular para obter informações de imagens únicas ou Zacks sobre a absorção de drogas ou a estrutura do esferóide S. A principal vantagem desta técnica sobre os microscópios de folha de luz existentes é que ela é econômica e altamente versátil, pois consiste em um módulo que pode ser adaptado a um microscópio existente e oferece um grande grau de liberdade para pesquisa. As implicações desta técnica se estendem à pesquisa de drogas e agentes usados para terapia e diagnóstico, em particular, uma vez que a adaptação do sistema microfluídico permite a investigação de processos rápidos sob condições de fluxo.

Agora, esse método de excitação em combinação com qualquer técnica de detecção pode fornecer informações sobre esteróides de células vivas em doses de pouca luz. Também pode ser aplicado a outros sistemas vivos, como peixes cipro, embriões de artila, bem como amostras ópticas de tecido CLE. Para começar, adicione 50 microlitros de 1,5 aeros aquecido em meio de cultura em cada poço de uma placa de 96 poços e deixe solidificar por uma a duas horas.

Em seguida, semeie cerca de 150 MCF sete células de câncer de mama em cada poço da placa de 96 poços preparada bruta S por cinco a sete dias, até um diâmetro de cerca de 200 a 300 micrômetros em uma incubadora a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius. Em seguida, incube os esteróides celulares com o antibiótico antraciclina cloridrato de doxorrubicina por seis horas em uma concentração variando entre dois micromolares e oito micromolares em cultura. Meio Após a incubação, lave as células OID com cultura, meio ou solução salina de equilíbrio de Earl antes da microscopia.

Use um microscópio invertido e monte a microscopia de iluminação de plano único ou o módulo de excitação SPM na placa de base da mesa de posicionamento. Equipe o microscópio com uma lente objetiva de microscópio de ampliação de 10 ou 20 vezes e um filtro passa-longo apropriado no caminho de detecção do microscópio. Em seguida, monte uma câmera de integração na porta de detecção do microscópio.

Use um feixe paralelo de um laser ou um diodo laser com um comprimento de onda de excitação de preferência de 470 nanômetros e aplique-o ao módulo de rotação. Em seguida, gire a lente cilíndrica em 90 graus, o que transfere a folha de luz para a posição vertical para um ajuste axial da cintura do feixe da folha de luz. Coloque um capilar contendo um líquido com um corante fluorescente no porta-amostras.

Fixe o porta-amostras com o capilar à mesa de posicionamento do microscópio. Alinhe a posição do capilar de forma que fique centralizado e a cintura do feixe da folha de luz esteja em foco. Ajuste a cintura do feixe pela variação da posição axial da própria lente cilíndrica.

Volte a colocar a lente após o ajuste. Coloque o esteróide celular separadamente ou em grupos dentro de capilares retangulares de vidro de silicato bo com uma seção transversal interna de 600 por 600 micrômetros e uma espessura de parede de 120 micrômetros. Para conseguir isso, pegue o capilar vazio na posição vertical com o polegar e o dedo médio e sele a abertura superior com o indicador.

Aproxime a abertura inferior do esferóide da célula em seu líquido circundante, libere o dedo indicador do líquido da abertura superior com o esteróide dentro. Ele será absorvido imediatamente por forças capilares. Ajuste a posição do esferóide S dentro do capilar preenchido por gravitação.

Alternativamente, aplique o esteróide no capilar por meio de pipetagem. Tome cuidado para que a abertura da ponta da pipeta seja, por um lado, grande o suficiente para o tamanho do esferóide S e, por outro lado, menor ou igual em tamanho ao diâmetro interno do capilar. Em seguida, coloque o capilar contendo o esferóide S em um suporte de amostra especial de microscopia.

Anexe o porta-amostras com o capilar à mesa de posicionamento do microscópio e alinhe a posição do esteróide celular de forma que fique centralizado e focado. Defina a correspondência entre a folha de luz e o plano focal da lente objetiva do microscópio no caminho de detecção, ajustando a posição do espelho de reflexão e da lente cilíndrica. Encha o capilar com soro fetal de bezerro ou FCS por 30 minutos para apoiar a adesão celular posterior de um esteróide celular à superfície interna do vidro.

Deixe o revestimento FCS restante no capilar empobrecido secar por pelo menos 12 horas após a introdução do esteróide celular no capilar revestido com FCS. Como antes, deixe o capilar na incubadora por mais duas a quatro horas para causar a adesão celular do esteróide. Em seguida, configure a parte flx do sistema microfluídico, incluindo uma armadilha de bolhas.

Use uma bomba peristáltica para preencher o flx da tubulação com meio de cultura contendo o medicamento ou agente de corante fluorescente. Primeiro prenda o capilar sem bolhas na tubulação de efluxo e, em seguida, prenda o outro lado do capilar na tubulação de drenagem. Ajuste a temperatura do líquido do banho-maria para o valor desejado.

Em seguida, ajuste a bomba peristáltica para a velocidade desejada da bomba. Colete o líquido bombeado em um recipiente com uma configuração de circuito aberto para aquisição e análise de dados. Defina a potência do laser e o tempo de integração para a aquisição da imagem.

Defina o incremento da pilha ZS para um valor entre cinco e 10 micrômetros, o que é preferível para análise de dados tridimensionais. Como a espessura da folha de luz é de cerca de 10 micrômetros, prossiga para realizar medições de imagens únicas ou Zacks por variação do plano focal dentro do esteróide celular. Uma varredura Zack de um esteróide mc de sete células previamente incubado com oito doxorrubicina micromolar por seis horas é mostrada.

As imagens fornecem informações detalhadas sobre a captação e distribuição celular da doxorrubicina e sua degradação. O produto dentro da camada celular externa da doxorrubicina fluorescente vermelha esteróide está localizado principalmente no núcleo, enquanto nas áreas internas do sphe roid, a fluorescência verde submetida por um produto de degradação torna-se dominante na membrana celular. A absorção da droga quimioterápica doxorrubicina em células nativas de câncer de mama humano mc seven S é representada para uma única camada de células selecionada por spm.

Após a aplicação de dois micromolares e meio de cultura dentro do sistema de fluxo, a fluorescência vermelha e verde da doxorrubicina e seu produto de degradação aumentou continuamente após a aplicação de duas doxorrubicinas micromolares em meio de cultura dentro do sistema de fluxo, a fluorescência vermelha e verde da doxorrubicina e seu produto de degradação aumentaram continuamente. Uma vez masterizado, leva apenas alguns minutos desde a montagem do módulo de eliminação de folhas de luz até a gravação de imagens fluorescentes de amostras 3D. Ao medir a condição de fluxo, é mais importante garantir que a amostra adira à superfície interna do capilar e evitar que bolhas de ar atinjam a amostra que possam desprendê-la do capilar.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão da microscopia de iluminação de folha de luz com o módulo versátil adaptável a vários microscópios.