Name: De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 10 s
Description: Aprenda a medir a lei de difusão de lipídios e proteínas em membranas celulares vivas usando microscopia de fluorescência por reflexão interna total. Este método permite analisar a dinâmica molecular com equipamentos padrão.

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Este trabalho é apoiado em parte pelo NIH-P41 P41-RRO3155 e NIH P50-GM076516 (bolsa para EG) e Fondazione Monte dei Paschi di Siena (bolsa para FB).

Calibração do sistema 1. <ol><li> Espalhe Ponto de Função (PSF) de calibração <ol><li> Dilui-se 10 ul de solução de 30 nm talão fluorescente (cerca de 5 mM) em 90 mL de água destilada e, em seguida, sonicar a solução durante 20 min. Corte um quadrado (1 cm x 1 cm) de gel de agarose a peça (3%) e de depósito de 10 ul da solução sobre a superfície do gel. Derrubar o pedaço de gel no vidro de fundo de uma placa de Petri de dois centímetros e espremer a gota sobre o vidro. </li><li> Ligue a configuração de aquisição, colocar a amostra no suporte, definir a exposição da câmera e EMgain (100 ms e 1000 são bons parâmetros, mas otimizar acordo com o sistema) e esperar que a câmara arrefecer. </li><li> Defina a exposição da câmera para 100 ms, câmera EMgain para 1000, o modo de aquisição para o Quadro de Transferência, 100 repetição e auto definição de poupança. </li><li> Usando a ocular e transmitida foco de luz, na fronteira com o gel e depois passar o objetivo para o centro do gel, ajustar o foco e start o procedimento de alinhamento a laser (em LAS AF, selecione &#39;setup TIRF &quot;e siga o procedimento de alinhamento automático). </li><li> Encontre um campo de visão com pontos isolados simples, precisa se concentrar no local mais brilhante (que geralmente representa contas agregado) como referência, adquirir 100 quadros e repita o passo 5-6 vezes, a fim de adquirir vários pontos individuais. </li><li> Importe a série adquiriu a um programa de processamento de dados e, em média, a pilha no tempo (Figura 1A) e selecionar um único grânulo isolado. Tome o cuidado de selecionar os mais pequenos para evitar agregados de partículas. </li><li> Coloque a distribuição selecionada intensidade (um exemplo único perfil contas é apresentado na Figura 1B) com uma função de Gauss usando o comando &quot;gaussfit&quot; (nas ferramentas ICS-Matlab nos Materiais em Matlab). Verificar a qualidade do ajuste, inspecionando os resíduos obtidos (um exemplo de perfil Gaussian equipada com os resíduos correspondentes é apresentado in Figura 1B). </li></ol></li><li> Calibração da câmara <ol><li> Ligue a câmera e espere que a câmara arrefecer. Defina a configuração de aquisição da câmera (ou seja, para a câmera usada montamos a exposição a 0,5 ms, câmera EMgain de 1000, o modo de aquisição de modo recortada, o tamanho do ROI de 32 x 128, 10.000 repetições) e começar a aquisição do fundo da câmara sinal. </li><li> Importação adquirido série de quadros para um programa de processamento de dados. Calcule e verifique a intensidade média em cada pixel, a fim de verificar se o fundo da câmara é de aproximadamente plana na região selecionada do chip. No modo recortado, remover a primeira e as últimas linhas horizontais (3 a 10, dependendo do tamanho do ROI) para cada quadro, pois o fundo da câmara é normalmente enviesados ​​nas linhas de fronteira. </li><li> Criar um histograma dos valores (também definido Nível Digital, DL) em imagens adquiridas pilha (usando o comando &#39;hist&#39; em Matlab) e traçar o logaritmoresultando de frequência (usando o comando semilogy em Matlab). Um exemplo de distribuição DL para o fundo da câmara é apresentado na Figura 2. NOTA: Se a câmara está a funcionar bem, a trama vai mostrar um pico de cerca de Gauss (um perfil parabólico no diário de escala) representa a distribuição dos valores associados a zero fóton seguido de um decaimento exponencial (uma linha com inclinação negativa no log escala ) que representa a distribuição de valores associados a um fotão (Figura 2). Em particular, o centro e a variância da função de Gauss representam o deslocamento da câmara e erro, respectivamente, enquanto que a constante de decaimento exponencial da parte representa uma estimativa do DL atribuído pela câmara para cada um único fotão. Em Matlab use a seção &quot;CalibrateCamera&quot; do Script em materiais de apoio. </li><li> Repita a operação para toda a câmera selecionada EMGain e Gain. </li></ol></li></ol> 2. RotuladoPreparação celular <ol><li> Para preparar os lipossomas necessários para a incorporação de lípido 36, dissolver separadamente 1 mg de DOPE (1,2-dioleoyl- sn-glicero-3-fosfoetanolamino), 1 mg de DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamónio-propano), e 1 mg de EPI-ATTO488 em 1 ml de clorofórmio. Misture 0,5 ml de solução de DOPE, 0,5 ml de solução de DOTAP, e 25 ul de solução de EPI-ATTO488 e seco sob vácuo durante 24 horas. Adicionar 0,5 ml de tampão HEPES 20 mM, vortex durante 15 min e sonicado durante 15 minutos a 40 ° C. </li><li> Para preparar a célula, lavar 3 vezes com PBS, um prato p100 confluente de células CHO-K1 (ovário de hamster chinês), adicionar 1 ml de tripsina e armazenar na incubadora durante 5 min. Suspender as células isoladas adição de 9 ml de meio DMEM / F12 suplementado com 10% de FBS e semear 150 mL de solução de células em uma placa de Petri contendo 800 ul do mesmo meio. </li><li> Loja na incubadora durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. Para a incorporação de lípidos, substitua com meio de células 500ul de meio isento de soro; depois de 30 min, adicionar 2 ml de solução de lipossomas; após 15 minutos de lavagem com PSB e adicionar novo meio DMEM / F12 para geração de imagens. </li><li> Para a transfecção, as células transfectar acordo com o protocolo Lipofectamina (as instruções do fabricante), utilizando TfR-GFP plasmídeo e loja 24 horas na incubadora antes de imagem. </li></ol> 3 Aquisição de Dados <ol><li> Preparação Setup <ol><li> A fim de o termostato microscópio, 24 h antes do experimento de ligar a incubadora. </li><li> A fim de aplicar o tempo de aquisição mais rápido possível, trabalhar em modo Sensor recortada (ver introdução) e usar uma primeira câmera para imagens (câmera 1) e segunda câmera para selecionar a célula (câmera 2). Um esquema da configuração de instalação é apresentado na Figura Suplementar S1. Então, para alinhar a vez duas câmeras no microscópio e esperar que as câmeras para esfriar. </li><li> Situado em ambas as câmaras os parâmetros para transmissão de imagens de luz (ou seja, </em&gt;, 20 ms para o tempo de exposição, 1 para EM Gain) e colocar o microscópio no modo brilhante Field. </li><li> Coloque as amostras no suporte e focar através da ocular, envie a luz para a câmera 1 e empurre as fendas permitindo que a luz apenas no ROI usado para imagens de células (aqui um ROI de 32 x 32 pixels). </li><li> Mover uma célula na região seleccionada e enviar a luz para a câmara 2, então desenhar um ROI no software que controla câmara 2, a fim de ter uma referência. </li></ol></li><li> Imagem (Figura 3A) <ol><li> Primeiro de tudo, alinhe o laser TIRF de acordo com o procedimento de sua configuração. Em nossa configuração, selecione o &#39;setup TIRF&#39; e iniciar o procedimento de alinhamento automático. Quando o laser é alinhado configurado 70 nm de profundidade de penetração (cerca de 70 °). </li><li> Definir o tempo de exposição a 70 ms e EMGain a 100 em ambos câmera 1 e câmera de 2; em seguida, selecione uma célula usando a câmera 1, em seguida, enviar a luz na câmera 2 e focar com precisão a membrana celular. Defina a exposição mínima em caMera 2, 1000 EMGain, Modo Sensor Curta, 10 5 repetições e definir autosave como arquivos FITS (Flexible Image Transport System, um formato que pode ser facilmente gerenciado). </li><li> Comece a aquisição de gravar a série imagem. Solte o ganho eo Modo cortada para permitir a estabilização da temperatura antes de adquirir um novo celular, em seguida, repita as duas últimas etapas, a fim de adquirir 8-10 células. </li></ol></li></ol> 4 Cálculo do Mean Square Deslocamento de Imagem (i MSD) NOTA: O protocolo a seguir podem ser aplicados diretamente aos dados brutos. Ao mesmo tempo, todo o protocolo é válido para aquisição de dados simulados tanto em Matlab e em SimFCS. O link para os tutoriais correspondentes podem ser encontradas na seção &quot;Materiais&quot;. <ol><li> Cálculo pelo Matlab <ol><li> Importe a série adquiriu ao Matlab utilizando roteiro ImportImageSeries. Calcula-se a média de intensidade de cada imagem em tempo utilizando o command dizer sobre as duas primeiras dimensões e usar complô para ver o vetor resultante. </li><li> Se mais do que 10% de foto-branqueamento se encontra presente, a série descartar ou remover a primeira parte deles. Se for inferior, tentar corrigir o efeito sobre a função de correlação, subtraindo a cada imagem sua intensidade média, como mostrado antes de 37. </li><li> Calcule a intensidade média de cada pixel, utilizando média na terceira dimensão e ver imagem resultante. É necessária uma atenção especial para evitar correlações de artefatos: NOTA. De fato, como demonstrado anteriormente por técnicas semelhantes 38, os contornos das células, bem como de vesículas foco poderia introduzir uma correlação forte. Se a inspecção da imagem média revela os contornos das células ou de vesículas de foco, tente excluir a região envolvida caso contrário descartar a aquisição. Para corrigir o efeito destas estruturas imóveis subtrair a intensidade média temporal de cada pixel 39. </li><li> Calcule tele correlação espaço-temporal (G (ξ, χ, τ)) usando a função CalculateSTICScorrfunc. Remover G (ξ, χ, 0), porque a correlação devido ao ruído tiro no regime de pouca luz domina G (0,0,0); a correlação devido ao detector domina o L (± 1,0,0), e o movimento das partículas durante o tempo de exposição pode deformar-se L (ξ, χ, τ) para τ = 0 através do aumento da cintura medida (este efeito desaparece para τ &gt; 0) 34. </li><li> Média G (ξ, χ, τ&gt; 0), utilizando um time-bin logarítmica para reduzir o ruído usando a função &quot;LogBinStack&quot; no material de apoio e, em seguida, encaixar o G resultante (ξ, χ, τ), utilizando a função &quot;gaussfit&quot; de as ferramentas ICS-Matlab em Materiais para recuperar o i MSD (a segunda coluna da matriz resultante). </li><li> Traça-se a σ obtido cintura (τ) 2 (i RIA) como uma função do tempo. Se os dados são muito barulhento, tentar aumentar o número de acququadros IRED, aumentar a potência do laser, a média mais G (ξ, χ, τ) juntos. </li></ol></li><li> Cálculo por SimFCS <ol><li> Abra os arquivos adquiridos com ImageJ usando BioFormat importador plugin e salvar séries adquiridas como Tiff sequência. </li><li> Abrir ferramenta SimFCS e selecionar RICS e selecione Arquivo&gt; Importar várias imagens (Figura S2 Suplementar). </li><li> Selecione Fit, inserir os parâmetros de aquisição corretos e fechar a janela fit (Figura S3 Suplementar). </li><li> Selecione Tela&gt; Intensidade Média&gt; CH1 e verificar a presença de fotodegradação (Figura S4 Suplementar). </li><li> Se mais do que 10% de fotobranqueamento está presente descarte da série ou, se é possível a carga de novo a sequência de imagens de remover a primeira parte da série. </li><li> Se o clareamento é inferior a 10% selecione Ferramentas&gt; i MSD&gt; Definir parâmetros, marque &quot;Use média móvel &#39;, situado no painel de ROI na esquerda umúmero de moldura para o pagamento de média móvel atenção que o tempo correspondente for maior do que o tempo de difusão característica (para partículas movendo-se a 1 mM 2 seg -1 um ​​tempo de 10 segundos é um bom média móvel) </li><li> Selecione Ferramentas&gt; iMSD&gt; Calcule i MSD (Figura Suplementar S5) e apto e exportar o i MSD a partir do bloco de notas (Figura Suplementar S6). </li></ol></li></ol> 5 Cálculo da Lei de Difusão do i MSD <ol><li> Coloque os primeiros pontos para extrapolar a interceptação (σ 0 2) (5 pontos são geralmente suficiente, mas mais pontos podem ser montados se mostram um comportamento linear) e comparar esse valor com o PSF medido anteriormente 2. Se eles são comparáveis, a dinâmica de fluoróforos isolados estão sendo seguidas. Por outro lado, se σ 0 2 2 &gt;&gt; PSF tentar adquirir mais rápido para garantir quedinâmica não ocultas estão presentes 34. </li><li> Calcule a difusividade aparente (app D) eo deslocamento médio (R), utilizando equações 3 e 4 (ver Introdução). </li><li> App Lote D como uma função de R para se obter uma lei de difusão comparável com o que é medido com variação local baseada FCS 12 (Figura 3D). </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

Rastreamento de partículas Individual (SPT) representa uma das estratégias mais comuns para o estudo da dinâmica molecular e tem a grande vantagem de medir as trajetórias das partículas. Isto por sua vez permite que o comportamento de sondagem até poucas partículas marcadas em um sistema complexo. No entanto, para chegar a esta vantagem SPT normalmente precisa de uma baixa densidade da sonda e rótulos muito brilhantes. Em particular, para obter alta resolução temporal (gama ms) sonda inorgânico são normalmente necessári...

A partir do "mosaico fluido" modelo original por Singer e Nicolson, a imagem da membrana plasmática celular tem sido continuamente atualizado durante as últimas décadas, a fim de incluir o papel emergente do citoesqueleto e lipídios domínios 1,2. As primeiras observações foram obtidos por recuperação de fluorescência após a fotodegradação (FRAP) revelação de que uma fração significativa de proteínas de membrana é imóvel 3-5. Estes estudos pioneiros, embora muito informativo, sofreu com a relativamente baixa resolução no espaço (microns) e de tempo (segundos) de setups FRAP. Além disso, sendo uma medição de média conjunto, FRAP falta em dar informações sobre o comportamento única molécula. Neste contexto, a possibilidade de marcar especificamente uma única molécula com marcações muito brilhantes (permitindo o estudo do processo de difusão de uma molécula de cada vez), tem sido muito bem sucedida. Particularmente, empurrando otempo de resolução da abordagem única partícula Tracking (SPT) para a escala de tempo microssegundos, Kusumi, et al. acesso ganhou a recursos desconhecidos de lipídeos e proteínas dinâmica que muito contribuíram para o reconhecimento do papel do esqueleto da membrana à base de actina na fisiologia da membrana 6 , 7. Essas descobertas geraram a chamada do "piquete e cerca 'modelo, em que lipídios e proteínas difusão é regulada por esqueleto à base de actina. No entanto, a fim de ter acesso à enorme quantidade de informações fornecidas pelo SPT muitas questões experimentais têm de ser abordadas. Particularmente, o processo de marcação é tipicamente composta por várias etapas, como produção, purificação e introdução das espécies marcadas no sistema. Além disso, grandes gravadoras, como pontos quânticos ou nanopartículas de metal, muitas vezes são necessárias para alcançar a escala de tempo sub-milissegundo ea reticulação das moléculas alvo pelo rótulo não pode ser evitado em muitos casos. Finalmente, muitas trajetóriaster de ser de forma a caber critérios estatísticos e concomitantemente uma baixa densidade da etiqueta é necessária para permitir o rastreamento. Comparado a SPT, espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), superando muitos destes inconvenientes, representa uma abordagem muito promissora para o estudo de dinâmica molecular. Na verdade, FCS funciona bem também com rótulos escuros e densos, permitindo estudar a dinâmica das moléculas marcadas em proteínas fluorescentes em células transfectadas transitoriamente. Além disso, permite alcançar altas estatísticas em uma quantidade limitada de tempo. Por fim, apesar da "alta" densidade de rótulos FCS fornece moléculas únicas informações. Graças a todas essas propriedades, FCS representa uma abordagem muito simples e tem sido amplamente utilizada no estudo da dinâmica de lipídeos e proteínas, tanto em membranas modelo e em células vivas 8-10. Muitas abordagens diferentes têm sido propostos para aumentar a capacidade de FCS para revelar os detalhes de difusão molecular. Por exemplo, foi shprópria, que através da realização FCS em áreas de observação de diferentes tamanhos pode-se definir uma "lei de difusão FCS" recursos escondidos esclarecedoras do movimento molecular 11,12. Além de ser variaram em tamanho, a área focal também foi duplicada 13, mudou-se no espaço ao longo das linhas 14-20 ou conjugadas com câmeras rápidas 21,22. Usando estes correlação 'espaço-temporal' abordagens, os parâmetros biológicos relevantes para vários componentes da membrana foram quantitativamente descrito em ambas as membranas modelo e as biológicas reais, portanto, uma visão rendimento em membrana de organização espacial. No entanto, em todas as aplicações e FRAP FCS descrito até agora, a dimensão da área focal representa um limite de resolução espacial, em que não podem ser ultrapassados. Vários métodos de imagem de super-resolução foram recentemente desenvolvidos para contornar este limite. Alguns são baseados em precisão de localização, tais como microscopia óptica reconstrução estocástica (STORM) &lt;sup&gt; 23,24, microscopia fotoativação localização (PALM) 25, PALM fluorescência (FPALM) 26 e de uma única partícula de rastreamento PALM (sptPALM) 27: a quantidade relativamente grande de fótons necessários em cada snapshot, no entanto, limita o tempo de resolução de estes métodos para, pelo menos, vários milissegundos, prejudicando assim a sua aplicabilidade in vivo. Em contraste, uma alternativa promissora para a resolução de imagem de super ter sido aberto por espacialmente modulando a emissão de fluorescência com os métodos de depleção de emissão estimulada (STED ou reversíveis transições saturáveis ​​óptica de fluorescência (RESOLFT)) 28,29. Estas abordagens combinar a formação de um volume de observação bem abaixo do limite de difracção, com a possibilidade de utilização de microscópios varrimento rápido e sistemas de detecção. Em combinação com a análise de variação de fluorescência, microscopia STED permissão para investigar diretamente a dinâmica espaço-temporais em nanoescala de lipídeos e proteins em membranas de células vivas 30,31. As mesmas quantidades físicas de microscopia-STED base pode ser obtida por uma espectroscopia modificado espaço-temporal correlação imagem (STICS 32,33) método que é adequado para o estudo da dinâmica das proteínas marcadas com fluorescência de membrana e / ou lípidos em células vivas e por um microscópio comercial. O protocolo experimental aqui apresentada é composta por poucos passos. O primeiro exige uma imagem rápida da região de interesse na membrana. Em seguida, a pilha resultante de imagens é usada para calcular as funções de correlação espaço-temporais médios. Ajustando-se a série de funções de correlação, a molecular "lei difusão" pode ser obtida directamente a partir de imagens na forma de uma difusividade aparente (D app) - vs -Média plotagem de deslocamento. Este lote depende criticamente sobre o meio ambiente explorado pelas moléculas e permite reconhecer diretamente os modos de difusão reaisdo lípido / proteína de interesse. Em mais detalhes, como demonstrado anteriormente 34, a função de auto-correlação espaço-temporal da série imagem adquirida de forma crítica depende da dinâmica das moléculas em movimento na série de imagens coletadas (por favor, note que o mesmo raciocínio pode ser aplicado em uma aquisição de linha onde apenas uma dimensão do espaço é considerado). Em particular, podemos definir a função de correlação como: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230"> (1) onde <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50"> representa a intensidade da fluorescência medida, na posição x, y e no momento t, <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8"> e <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10"> representa a distância em x edireções y respectivamente, <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10"> representa o intervalo de tempo, e <img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20"> representa a média. Esta função pode ser expressa como: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230"> (2) onde "N" representa o número médio de moléculas na área de observação, <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10"> representa a operação de convolução no espaço, e <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50"> representa a autocorrelação da cintura instrumental. Este último pode ser interpretada como uma medida de como os fotões de um único emissor estão espalhados no espaço, devido à configuração óptica / gravação (o chamado ponto de propagação função, PSF, generali bem aproximada por uma função de Gauss). Finalmente, <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50"> representa a probabilidade de encontrar uma partícula a uma distância <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10"> e <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10"> depois de um tempo de atraso <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10"> . Se considerarmos uma dinâmica difusos, em que as partículas se movem aleatoriamente em todas as direções e fluxos líquidos não estão presentes, esta função também é bem aproximada por uma função de Gauss, onde a variância pode ser identificado como o Mean Square Deslocamento (MSD) da partícula em movimento . Assim, a cintura da função de correlação (também referida como <img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30"> ), Pode ser definido como a soma das perturbações músculo-esqueléticas e de partículas da cintura instrumental e pode ser medido por um ajuste de Gaussção da função de correlação, para cada intervalo de tempo. A medida MSD i pode ser utilizada para calcular uma difusividade aparente das moléculas que se deslocam <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40"> e uma média de deslocamento <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40"> como: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170"> (3) <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170"> (4) Algumas considerações sobre a configuração experimental utilizada pode guiar o leitor ao longo das próximas seções. A fim de estimular selectivamente os fluoróforos na membrana basal de células que irão utilizar uma iluminação de reflexão interna total (TIR), vivo, usando uma fluorescência TIR comercial (TIRF) microscópio (detalhes podem ser encontrados na secção de material). Além disso, a fim de recolher the fluorescência usaremos um objectivo ampliação elevada (100X NA 1,47, abertura numérica elevada é necessária para a iluminação TIRF) e uma câmara EMCCD (tamanho físico do pixel no chip 16 mm). Para chegar a um tamanho de pixel de 100 nm, aplicamos uma lente de ampliação adicional de 1.6X. Como discutido abaixo, uma resolução temporal inferior a 1 ms seria necessário para descrever adequadamente a dinâmica dos lípidos da membrana rápidos abaixo de 100 nm. Para chegar a esta resolução temporal, precisamos selecionar uma região de interesse (ROI) menor do que todo o chip da câmera (512 x 512). Desta forma, a câmara irá ler um número reduzido de linhas de aumentar a resolução de tempo. No entanto, neste regime de tempo de leitura do quadro seria limitada pelo tempo necessário para mudar as taxas de exposição ao chip de leitura na câmara e é geralmente da ordem de milissegundos para 512 x 512 pixels EMCCD. Para vencer esse limite, uma tecnologia emergente permite deslocar as linhas de ROI só que ao invés de todo o quadro, wom uma redução efetiva prática do tamanho do chip exposto (chamado Modo Sensor recortada em nosso EMCCD). Para esta configuração para ser eficaz, o chip de fora do ROI deve ser coberta por um par de fendas montadas no caminho óptico. Graças a esta configuração de uma resolução de tempo até 10 segundos -4 pode ser alcançado. Observe, porém, que esta abordagem pode ser acoplado com muitas montagens experimentais diferentes, como explicado na seção "discussão". Demonstração do método irá ser fornecida em células vivas, utilizando tanto uma ATTO488 identificada como 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (ATTO488-PPE) e uma variante marcada com GFP do Receptor de Transferrina (GFP TFT). No caso de ATTO488-PPE esta abordagem pode recuperar com sucesso um aplicativo D quase constante como uma função da média de deslocamento que indica uma difusão maior parte livre, como relatado anteriormente 30,35. Por contraste, o TfR-GFP demonstra uma diminuição D 6. Além disso, neste último caso, é possível quantificar a constante de difusão local, e a média da área ao longo de muitos micra confinamento no plano da membrana.

<table><tbody><tr><td>iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0</td><td></td></tr><tr><td>Solis</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>ATTO 488 rotulado PPE</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-151</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>850725</tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Lipídios Polares, Inc.</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicilina-Estreptomicina-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>SimFCS 3.0</td><td>Globals Software</td><td></td><td>o software pode ser baixado aqui: http://www.lfd.uci.edu/globals/</td></tr> <tr><td>DMI6000 com módulo TIRF</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Lipofectamine</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWork</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>C-terminal GFP marcado Receptor de tranferrina</td><td>OriGene</td><td>RG200980</td><td></td></tr><tr><td>Ágar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>528730</td><td></td></tr><tr><td>Grânulos de látex, verde-amarelo fluorescente, 30 nm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5155</td><td></td></tr><tr><td>Limpadores ultrassônicos SONICA</td><td>SOLTEC</td><td>ETH S3</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Willco</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>Importador de bioformato para ferramentas Matlab</td><td></td><td></td><td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td></tr> <tr><td>ICS-MatLab</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip</a></td></tr><tr><td>Simulação por Matlab Tutorial</td><td></td><td></td><td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td></tr><tr><td>Simulação por SimFCS Tutorial</td><td></td><td></td><td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td></tr></tbody></table>

de fast imagens de fluorescência com a lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Tornou-se cada vez mais evidente que a distribuição espacial eo movimento de componentes da membrana, como lipídios e proteínas são fatores-chave na regulação de muitas funções celulares. No entanto, devido à dinâmica rápida e as pequenas estruturas envolvidas, uma resolução espaço-temporal muito elevada é necessário para captar o comportamento real do moléculas. Aqui apresentamos o protocolo experimental para o estudo da dinâmica de proteínas e lipídios plasmáticos à membrana marcados com fluorescência em células vivas, com alta resolução espaço-temporal. Notavelmente, esta abordagem não é necessário para controlar cada molécula, mas calcula o comportamento população usando todas as moléculas numa dada região da membrana. O ponto de partida é uma imagem rápida de uma determinada região na membrana. Em seguida, uma função completa autocorrelação espaço-temporal é calculada correlacionando imagens adquiridas em aumentar os atrasos, por exemplo, a cada 2, 3, n repetições. É possível demonstrar que a largurado pico dos aumentos espaciais da função de autocorrelação em aumentar o tempo de atraso em função do movimento de partículas devido à difusão. Portanto, ajuste da série de funções de autocorrelação permite extrair a proteína real deslocamento médio quadrado de imagem (iMSD), aqui apresentada na forma de aparente diffusivity vs deslocamento médio. Isso gera uma visão quantitativa da dinâmica média de moléculas individuais com precisão nanométrica. Ao utilizar uma variante de GFP marcada com o Receptor de Transferrina (TfR) e uma ATTO488 identificada como 1-palmitoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (PPE), é possível observar a regulação espaço-temporal de proteína e lípido de difusão em regiões de membrana de tamanho micrometros de tempo na gama de micro-a-mili-segundo.

A fim de calibrar o instrumento de cintura, a imagem de um único nano-grânulo fluorescente pode ser medida como descrito no protocolo passo 1.1. A imagem de fluorescência típica destes grânulos é apresentada na Figura 1. O encaixe de distribuição de intensidade por uma função de Gauss 2D devolve boas resíduos e permite a medição da cintura instrumental a 270 nm. Este valor está em boa concordância com o limite de difracção esperado estimada pela equação de Rayleigh. Esta calibração não é necessário para...

A distribuição espacial e a dinâmica temporal das proteínas e lipídios da membrana plasmática são um tema quente na biologia. Aqui, esse problema é abordado por uma análise de flutuação de imagem espaço-temporal que fornece conceitualmente as mesmas quantidades físicas de rastreamento de partícula única, mas usa pequenos rótulos moleculares e configurações de microscopia padrão.

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

O objetivo geral deste procedimento é medir a lei de difusão de lipídios e proteínas em membranas celulares vivas para fazer isso. Primeiro, a função de propagação de pontos do microscópio é calibrada por imagens de esferas fluorescentes nanoscópicas. Em seguida, vetores baseados em lipossomas, incluindo uma molécula de interesse marcada com fluorescência, são preparados e introduzidos em células vivas por transfecção ou incorporação direta.A imagem rápida da membrana plasmática de células vivas é realizada por microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Finalmente, a função de correlação é calculada e a lei de difusão molecular é extraída por ajuste gaussiano. Os dados resultantes.Identifique o modo de movimento do lipídio ou proteína sob investigação. A principal vantagem desta técnica sobre a recuperação de fluorescência convencional após a abordagem de fotobranqueamento ou espectroscopia clássica de correlação de fluorescência de ponto único é que ela permite medir a lei de difusão molecular. Conhecemos um conhecimento prioritário do sistema.Também contrário às metodologias clássicas de rastreamento de partículas únicas. Aqui, o deslocamento mular é medido sem a necessidade de extrair trajetórias de partículas. Como consequência, esse metal pode ser facilmente usado em combinação com moléculas relativamente densas e consideradas como, por exemplo, proteínas fluorescentes geneticamente codificadas.No geral, este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia molecular celular, como como o movimento de proteínas ou lipídios regula a estrutura da membrana plasmática e a organização funcional, a resposta a essas e outras questões relacionadas será disponibilizada a todos e, usando apenas um microscópio comercial, a demonstração do procedimento geral será realizada por zo, um estudante de doutorado do laboratório. Comece este protocolo calibrando a função de propagação de pontos do sistema de imagem. Comece diluindo 10 microlitros de uma solução de esferas fluorescentes em 90 microlitros de água destilada previamente adicionada a um tubo de centrífuga de 500 microlitros.Sonicar a solução por 20 minutos em sauna com bisturi, cortar um pedaço quadrado de um centímetro de gel de rosa 3%AGA e colocá-lo em uma placa de Petri. Deposite 10 microlitros da solução diluída de esferas fluorescentes na parte superior do gel. Em seguida, usando uma pinça, inverta o pedaço de gel em uma placa de Petri de vidro de dois centímetros.Novamente, usando fórceps. Empurre o pedaço de gel para dispersar a gota. Em seguida, ligue a configuração de aquisição, que consiste em um microscópio comercial de fluorescência de reflexão interna total.Equipado com uma incubadora e uma câmera EMCD rápida conectada a um computador executando um conjunto de aplicativos, software fluorescente avançado e / ou software de aquisição de imagem Solis. Coloque a amostra no suporte na platina do microscópio usando a peça I e a luz transmitida. Concentre-se na borda do gel.Em seguida, centralize o gel sobre a objetiva e ajuste o foco para iniciar o procedimento de alinhamento a laser no conjunto de aplicativos Leica, o software fluorescente avançado seleciona o alinhamento automático e segue o procedimento de alinhamento automático. Depois que o laser tiver sido alinhado no software de aquisição e/ou Solis, clique no botão de configurações. Uma janela será aberta.Defina a exposição da câmera para 100 milissegundos, o EM ganho para 1000, a repetição para 100 e marque a caixa de seleção de transferência de quadros. Em seguida, clique na janela de salvamento automático e insira o nome do experimento. Encontre um campo de visão com pontos únicos isolados.Concentre-se em um ponto brilhante, que geralmente representa um agregado de contas. Em seguida, adquira 100 quadros. Repita esta etapa de cinco a seis vezes para adquirir imagens de vários pontos únicos.Importe as séries adquiridas para um programa de processamento de dados, como o MATLAB, e calcule a média da pilha no tempo. Em seguida, exiba a imagem de intensidade média medida. Amplie um pequeno ponto fluorescente brilhante e identifique aproximadamente o centro como o pixel mais brilhante do ponto.Por fim, selecione o tamanho da região de interesse que você deseja desenhar ao redor da partícula, normalmente um mícron próximo para ajustar a distribuição de intensidade selecionada com uma função gaussiana. Selecione o comando gause fit. Inspecione os resíduos obtidos para verificar a qualidade do ajuste.Por fim, calibre a câmera conforme descrito no documento anexo. Uma vez calibrado o sistema, é hora de rotular as células para aquisição de imagens. Comece a preparar os lipossomas necessários para a incorporação de lipídios dissolvendo um miligrama de DOPE, um miligrama de DOPE e um miligrama de PPE ADO 4 88 cada um em um tubo de microcentrífuga separado contendo um mililitro de clorofórmio.Em seguida, combine 0,5 mililitros de cada uma das soluções DOPE e DOTAP com 25 microlitros de solução PPE ATO 4 88. Coloque o tubo em um evaporador centrífugo e inicie a centrifugação a 280 gs. Ligue a bomba de vácuo e deixe-a girar por 24 horas.No dia seguinte, adicione 0,5 mililitros de tampão heis 20 milimolar ao tubo e vortex por 15 minutos. Em seguida, coloque o tubo em um banho de alimentação sônica e sonice por 15 minutos a 40 graus Celsius. Para preparar as células, lave um prato P 100 de ovário de hamster chinês confluente ou CHOK uma célula três vezes com 10 mililitros de PBS.Em seguida, adicione um mililitro de tripsina e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco minutos. Após a incubação, adicione nove mililitros de D-M-E-M-F 12 suplementado com 10% de FBS para suspender as células semear 150 microlitros desta célula contendo solução. Em uma placa de Petri com fundo de vidro de 22 milímetros contendo 800 microlitros do mesmo meio.Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Para a incorporação de lipídios, substitua o meio celular por 500 microlitros de meio livre de soro e incube por 30 minutos. Após a incubação, adicione dois microlitros de solução de lipossomas e incube por mais 15 minutos.Em seguida, lave as células com PBS e adicione um novo DM EMF 12. Antes de fazer imagens pelo menos 12 horas antes do experimento, ligue a incubadora de microscópios para levar a platina do microscópio e os componentes ópticos à temperatura experimental. A etapa mais difícil desse procedimento é essa aquisição.Para garantir o sucesso, certifique-se de otimizar todos os parâmetros de aquisição do sistema. Em estudo. No dia do experimento, ligue o microscópio, espere que as câmeras atinjam a temperatura de trabalho.Para realizar o experimento, usaremos duas câmeras. A câmera um será usada para imagens e a câmera dois será usada para selecionar a célula. Essa configuração permitirá o tempo de aquisição mais rápido possível no software.Para definir os parâmetros para imagens de luz transmitida. Insira 20 milissegundos Para o tempo de exposição, insira um para o ganho EM para ambas as câmeras. Em seguida, abra a janela do modo de contraste no software e à esquerda.Clique em BF para selecionar a opção de campo claro. Coloque as amostras no suporte enquanto visualiza a amostra através das oculares. Traga o exemplo em foco.Em seguida, envie manualmente a luz para a câmera um e empurre suavemente as fendas para que apenas a ROI a ser fotografada seja iluminada. Em seguida, mova uma célula para a região selecionada e, usando o software, envie a luz para a câmera dois. Em seguida, no software, desenhe um ROI para gerar uma referência.Primeiro, para alinhar o laser por software, selecione alinhamento automático. Em seguida, para iniciar o procedimento de alinhamento automático, selecione ativar colimador. Em seguida, abra a incubadora na parte superior e colima o feixe de laser.Quando o laser estiver alinhado no canto inferior esquerdo da janela do software, clique no botão 70 para definir a profundidade de penetração para 70 nanômetros. Isso corresponderá a um ângulo de incidência do laser no vidro inferior de cerca de 70 graus no conjunto de aplicativos Leica. Caixa de texto de tempo de exposição de software fluorescente avançado.Insira 70 milissegundos na caixa de texto Ganho EM. Digite 1000 para fazer o mesmo na câmera dois. Abra a janela de configurações e insira os mesmos números nas caixas de texto correspondentes.Em seguida, clique no botão ao vivo. A fluorescência será enviada para a câmera um e uma imagem da amostra aparecerá na tela. Mova a amostra até que uma célula fluorescente atinja a região de referência de interesse.Em seguida, pressione o botão na frente do corpo do microscópio para enviar a luz para a câmera dois e mova a roda de posição Z com precisão para focar na membrana celular no software e/ou único. Abra a janela de configurações e defina o tempo mínimo de exposição alcançável 1000 EM ganho recortado modo de sensor 10 para a quinta repetição e defina a opção de salvamento automático para começar a adquirir a série de imagens. Clique no ícone da câmera do software e aguarde a conclusão da aquisição.Em seguida, abra a janela de configurações, desative o ganho EM e remova a marca da opção de modo cortado. Durante a aquisição, a temperatura da câmera geralmente aumenta cerca de dois a três graus. Assim, antes de adquirir imagens de uma nova célula, aguarde até que a temperatura ideal de trabalho seja atingida.Novamente, uma vez concluída a imagem, siga as instruções no documento que acompanha para calcular o deslocamento quadrado médio da imagem para obter uma variante marcada com fluorescência da molécula de interesse. As células CHOK one foram marcadas com ADO 4 88 PPE ou transfectadas com um receptor de transferência ou T-F-R-G-F-P e fotografadas por TIRF conforme descrito neste vídeo. Como pode ser visto aqui, a lei de difusão medida para ADO 4 88 PPE é plana, indicando uma difusão principalmente livre, conforme mostrado anteriormente por fluorescência de depleção de emissão estimulada, espectroscopia de correlação ou medições FCS constantes após a transfecção com o TFRGFP, a lei de difusão medida para TFRGPP é inicialmente plana, permanecendo abaixo de 100 nanômetros de deslocamento molecular médio com um coeficiente de difusão aparente médio de cerca de 0,7 mícron quadrado por segundo.Isso é seguido por uma rápida diminuição na difusividade aparente até 0,2 mícrons ao quadrado por segundo. O valor normalmente medido por difração limitou o FCS. É interessante notar que, como mostrado por este último exemplo, a presente abordagem pode facilmente medir o deslocamento molecular médio com uma resolução de algumas dezenas de nanômetros, mesmo usando rótulos relativamente fracos e densos, como GFP.Além disso, a escala espacial na qual o coeficiente de difusão aparente começa a diminuir define o tamanho característico do confinamento parcial da proteína pelo esqueleto da membrana em cerca de 120 nanômetros, de acordo com estimativas anteriores. Uma vez dominado o procedimento de análise de dados e essa aquisição pode ser realizada em poucos minutos. Acreditamos que esta técnica abrirá caminho para pesquisadores da área de biologia celular e molecular explorarem de forma fácil e quantitativa a regulação espaço-temporal da difusão de proteínas e lipídios em amostras de vida.

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