De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

O objetivo geral deste procedimento é medir a lei de difusão de lipídios e proteínas em membranas celulares vivas para fazer isso. Primeiro, a função de propagação de pontos do microscópio é calibrada por imagens de esferas fluorescentes nanoscópicas. Em seguida, vetores baseados em lipossomas, incluindo uma molécula de interesse marcada com fluorescência, são preparados e introduzidos em células vivas por transfecção ou incorporação direta.

A imagem rápida da membrana plasmática de células vivas é realizada por microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Finalmente, a função de correlação é calculada e a lei de difusão molecular é extraída por ajuste gaussiano. Os dados resultantes.

Identifique o modo de movimento do lipídio ou proteína sob investigação. A principal vantagem desta técnica sobre a recuperação de fluorescência convencional após a abordagem de fotobranqueamento ou espectroscopia clássica de correlação de fluorescência de ponto único é que ela permite medir a lei de difusão molecular. Conhecemos um conhecimento prioritário do sistema.

Também contrário às metodologias clássicas de rastreamento de partículas únicas. Aqui, o deslocamento mular é medido sem a necessidade de extrair trajetórias de partículas. Como consequência, esse metal pode ser facilmente usado em combinação com moléculas relativamente densas e consideradas como, por exemplo, proteínas fluorescentes geneticamente codificadas.

No geral, este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia molecular celular, como como o movimento de proteínas ou lipídios regula a estrutura da membrana plasmática e a organização funcional, a resposta a essas e outras questões relacionadas será disponibilizada a todos e, usando apenas um microscópio comercial, a demonstração do procedimento geral será realizada por zo, um estudante de doutorado do laboratório. Comece este protocolo calibrando a função de propagação de pontos do sistema de imagem. Comece diluindo 10 microlitros de uma solução de esferas fluorescentes em 90 microlitros de água destilada previamente adicionada a um tubo de centrífuga de 500 microlitros.

Sonicar a solução por 20 minutos em sauna com bisturi, cortar um pedaço quadrado de um centímetro de gel de rosa 3%AGA e colocá-lo em uma placa de Petri. Deposite 10 microlitros da solução diluída de esferas fluorescentes na parte superior do gel. Em seguida, usando uma pinça, inverta o pedaço de gel em uma placa de Petri de vidro de dois centímetros.

Novamente, usando fórceps. Empurre o pedaço de gel para dispersar a gota. Em seguida, ligue a configuração de aquisição, que consiste em um microscópio comercial de fluorescência de reflexão interna total.

Equipado com uma incubadora e uma câmera EMCD rápida conectada a um computador executando um conjunto de aplicativos, software fluorescente avançado e / ou software de aquisição de imagem Solis. Coloque a amostra no suporte na platina do microscópio usando a peça I e a luz transmitida. Concentre-se na borda do gel.

Em seguida, centralize o gel sobre a objetiva e ajuste o foco para iniciar o procedimento de alinhamento a laser no conjunto de aplicativos Leica, o software fluorescente avançado seleciona o alinhamento automático e segue o procedimento de alinhamento automático. Depois que o laser tiver sido alinhado no software de aquisição e/ou Solis, clique no botão de configurações. Uma janela será aberta.

Defina a exposição da câmera para 100 milissegundos, o EM ganho para 1000, a repetição para 100 e marque a caixa de seleção de transferência de quadros. Em seguida, clique na janela de salvamento automático e insira o nome do experimento. Encontre um campo de visão com pontos únicos isolados.

Concentre-se em um ponto brilhante, que geralmente representa um agregado de contas. Em seguida, adquira 100 quadros. Repita esta etapa de cinco a seis vezes para adquirir imagens de vários pontos únicos.

Importe as séries adquiridas para um programa de processamento de dados, como o MATLAB, e calcule a média da pilha no tempo. Em seguida, exiba a imagem de intensidade média medida. Amplie um pequeno ponto fluorescente brilhante e identifique aproximadamente o centro como o pixel mais brilhante do ponto.

Por fim, selecione o tamanho da região de interesse que você deseja desenhar ao redor da partícula, normalmente um mícron próximo para ajustar a distribuição de intensidade selecionada com uma função gaussiana. Selecione o comando gause fit. Inspecione os resíduos obtidos para verificar a qualidade do ajuste.

Por fim, calibre a câmera conforme descrito no documento anexo. Uma vez calibrado o sistema, é hora de rotular as células para aquisição de imagens. Comece a preparar os lipossomas necessários para a incorporação de lipídios dissolvendo um miligrama de DOPE, um miligrama de DOPE e um miligrama de PPE ADO 4 88 cada um em um tubo de microcentrífuga separado contendo um mililitro de clorofórmio.

Em seguida, combine 0,5 mililitros de cada uma das soluções DOPE e DOTAP com 25 microlitros de solução PPE ATO 4 88. Coloque o tubo em um evaporador centrífugo e inicie a centrifugação a 280 gs. Ligue a bomba de vácuo e deixe-a girar por 24 horas.

No dia seguinte, adicione 0,5 mililitros de tampão heis 20 milimolar ao tubo e vortex por 15 minutos. Em seguida, coloque o tubo em um banho de alimentação sônica e sonice por 15 minutos a 40 graus Celsius. Para preparar as células, lave um prato P 100 de ovário de hamster chinês confluente ou CHOK uma célula três vezes com 10 mililitros de PBS.

Em seguida, adicione um mililitro de tripsina e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco minutos. Após a incubação, adicione nove mililitros de D-M-E-M-F 12 suplementado com 10% de FBS para suspender as células semear 150 microlitros desta célula contendo solução. Em uma placa de Petri com fundo de vidro de 22 milímetros contendo 800 microlitros do mesmo meio.

Incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. Para a incorporação de lipídios, substitua o meio celular por 500 microlitros de meio livre de soro e incube por 30 minutos. Após a incubação, adicione dois microlitros de solução de lipossomas e incube por mais 15 minutos.

Em seguida, lave as células com PBS e adicione um novo DM EMF 12. Antes de fazer imagens pelo menos 12 horas antes do experimento, ligue a incubadora de microscópios para levar a platina do microscópio e os componentes ópticos à temperatura experimental. A etapa mais difícil desse procedimento é essa aquisição.

Para garantir o sucesso, certifique-se de otimizar todos os parâmetros de aquisição do sistema. Em estudo. No dia do experimento, ligue o microscópio, espere que as câmeras atinjam a temperatura de trabalho.

Para realizar o experimento, usaremos duas câmeras. A câmera um será usada para imagens e a câmera dois será usada para selecionar a célula. Essa configuração permitirá o tempo de aquisição mais rápido possível no software.

Para definir os parâmetros para imagens de luz transmitida. Insira 20 milissegundos Para o tempo de exposição, insira um para o ganho EM para ambas as câmeras. Em seguida, abra a janela do modo de contraste no software e à esquerda.

Clique em BF para selecionar a opção de campo claro. Coloque as amostras no suporte enquanto visualiza a amostra através das oculares. Traga o exemplo em foco.

Em seguida, envie manualmente a luz para a câmera um e empurre suavemente as fendas para que apenas a ROI a ser fotografada seja iluminada. Em seguida, mova uma célula para a região selecionada e, usando o software, envie a luz para a câmera dois. Em seguida, no software, desenhe um ROI para gerar uma referência.

Primeiro, para alinhar o laser por software, selecione alinhamento automático. Em seguida, para iniciar o procedimento de alinhamento automático, selecione ativar colimador. Em seguida, abra a incubadora na parte superior e colima o feixe de laser.

Quando o laser estiver alinhado no canto inferior esquerdo da janela do software, clique no botão 70 para definir a profundidade de penetração para 70 nanômetros. Isso corresponderá a um ângulo de incidência do laser no vidro inferior de cerca de 70 graus no conjunto de aplicativos Leica. Caixa de texto de tempo de exposição de software fluorescente avançado.

Insira 70 milissegundos na caixa de texto Ganho EM. Digite 1000 para fazer o mesmo na câmera dois. Abra a janela de configurações e insira os mesmos números nas caixas de texto correspondentes.

Em seguida, clique no botão ao vivo. A fluorescência será enviada para a câmera um e uma imagem da amostra aparecerá na tela. Mova a amostra até que uma célula fluorescente atinja a região de referência de interesse.

Em seguida, pressione o botão na frente do corpo do microscópio para enviar a luz para a câmera dois e mova a roda de posição Z com precisão para focar na membrana celular no software e/ou único. Abra a janela de configurações e defina o tempo mínimo de exposição alcançável 1000 EM ganho recortado modo de sensor 10 para a quinta repetição e defina a opção de salvamento automático para começar a adquirir a série de imagens. Clique no ícone da câmera do software e aguarde a conclusão da aquisição.

Em seguida, abra a janela de configurações, desative o ganho EM e remova a marca da opção de modo cortado. Durante a aquisição, a temperatura da câmera geralmente aumenta cerca de dois a três graus. Assim, antes de adquirir imagens de uma nova célula, aguarde até que a temperatura ideal de trabalho seja atingida.

Novamente, uma vez concluída a imagem, siga as instruções no documento que acompanha para calcular o deslocamento quadrado médio da imagem para obter uma variante marcada com fluorescência da molécula de interesse. As células CHOK one foram marcadas com ADO 4 88 PPE ou transfectadas com um receptor de transferência ou T-F-R-G-F-P e fotografadas por TIRF conforme descrito neste vídeo. Como pode ser visto aqui, a lei de difusão medida para ADO 4 88 PPE é plana, indicando uma difusão principalmente livre, conforme mostrado anteriormente por fluorescência de depleção de emissão estimulada, espectroscopia de correlação ou medições FCS constantes após a transfecção com o TFRGFP, a lei de difusão medida para TFRGPP é inicialmente plana, permanecendo abaixo de 100 nanômetros de deslocamento molecular médio com um coeficiente de difusão aparente médio de cerca de 0,7 mícron quadrado por segundo.

Isso é seguido por uma rápida diminuição na difusividade aparente até 0,2 mícrons ao quadrado por segundo. O valor normalmente medido por difração limitou o FCS. É interessante notar que, como mostrado por este último exemplo, a presente abordagem pode facilmente medir o deslocamento molecular médio com uma resolução de algumas dezenas de nanômetros, mesmo usando rótulos relativamente fracos e densos, como GFP.

Além disso, a escala espacial na qual o coeficiente de difusão aparente começa a diminuir define o tamanho característico do confinamento parcial da proteína pelo esqueleto da membrana em cerca de 120 nanômetros, de acordo com estimativas anteriores. Uma vez dominado o procedimento de análise de dados e essa aquisição pode ser realizada em poucos minutos. Acreditamos que esta técnica abrirá caminho para pesquisadores da área de biologia celular e molecular explorarem de forma fácil e quantitativa a regulação espaço-temporal da difusão de proteínas e lipídios em amostras de vida.