Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

O objetivo geral do experimento a seguir é interrogar as glicoproteínas de um envelope do HIV RIC ou a confirmação de ENV com anticorpos monoclonais. Isso é conseguido primeiro transeccionando células de adesão para expressar proteínas quiméricas HIV one E NV na superfície celular. Como segunda etapa, as células são incubadas com anticorpos monoclonais anti-ENV, que se ligam ao ENV dependendo da exposição ao epítopo.

Em seguida, um anticorpo secundário conjugado com HRP é adicionado para quantificar a interação do anticorpo por um ensaio de quimioluminescência. São obtidos resultados que mostram níveis relativos de anticorpos ligados ao VNV com base nas unidades de luz relativas adquiridas para cada um. Bem, a principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a vinculação baseada em fatos, é que essa técnica pode ser feita com baixa quantidade de anticorpos e com alto rendimento, um pós-doutorado no laboratório realizará essa técnica.

As células de osteossarcoma humano são usadas neste experimento um dia antes da placa de transfecção, duas vezes 10 elevado a quarto células por poço. Em uma placa de cultura de células opaca de 96 poços adequada para leitura de luminescência. Usado meio de águia modificado delcos suplementado com soro fetal bovino e penicilina estreptomicina incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no dia seguinte.

Prepare a mistura de transfecção. Primeiro, coloque dois tubos, dois compartimentos e dois B para dois compartimentos. Adicione cinco microlitros de DMEM suplementados com 25 hippies milimolares, seguidos por 10 nanogramas de plasmídeo de tat e revestimento e 150 nanogramas de plasmídeo quimérico de glicoproteína de um envelope do HIV.

Observe que o plasmídeo que codifica TAT só é necessário ao usar o plasmídeo codificador de glicoproteína de um envelope do HIV dependente de tat para dois B a cinco microlitros de DMM e 450 nanogramas de polietilina ou PEI. As quantidades dos reagentes e DNA devem ser ajustadas de acordo com o número de poços que devem ser transfectados com a mesma glicoproteína de um envelope do HIV. Em seguida, adicione o conteúdo de dois B a dois compartimentos e misture bem por vórtice por 10 segundos.

Incube a mistura de transfecção por 10 minutos em temperatura ambiente. Após 10 minutos, adicione 10 microlitros da mistura de transfecção por poço da placa de 96 poços incubada por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de óxido de carbono. O Ali SA para estudar o reconhecimento da glicoproteína quimérica do HIV por um envelope por anticorpos monoclonais é realizado dois dias após a transfecção das células do osteossarcoma humano.

Prepare 250 mililitros de tampão de lavagem por placa que está sendo usada ao mesmo tempo. Prepare 125 mililitros de tampão de bloqueio por placa, adicionando 1% de leite em pó desnatado e cinco milimolares de tris pH 8,0 ao tampão de lavagem. Remova o meio de cultura celular e a mistura de transfecção da placa de 96 poços.

Adicione 100 microlitros de tampão de bloqueio por poço e incube por 20 minutos. À temperatura ambiente, remova o sobrenadante e adicione 50 microlitros de anticorpo por poço diluído à concentração apropriada no tampão de bloqueio. Incube por uma hora em temperatura ambiente.

Lave três vezes com 100 microlitros de tampão de bloqueio e repita o processo de lavagem três vezes. Lave três vezes com 100 microlitros de tampão de bloqueio e depois lave três vezes com 100 microlitros de tampão de lavagem após a última lavagem. Retire o sate.

Adicione 100 microlitros de tampão de bloqueio e incube por cinco minutos. À temperatura ambiente, remova o sobrenadante e adicione 50 microlitros de anticorpo secundário diluído um a 3000 no tampão de bloqueio. Incube por 40 minutos em temperatura ambiente após 40 minutos.

Lave três vezes com 100 microlitros de tampão de bloqueio, seguido de três lavagens com 100 microlitros de tampão de lavagem. Para preparar as amostras para aquisição de dados, remova o sobrenadante da placa de 96 poços e adicione 30 microlitros de um substrato de quimioluminescência aprimorado por poço. Adquira o sinal de quimioluminescência por um segundo por poço em um leitor de placas adequado.

De acordo com as instruções do fabricante, o impacto do CD quatro solúvel ou S CD quatro na exposição dos epítopos do CD quatro I nas glicoproteínas do envelope ou ENV foi ensaio A interação do CD quatro com o ENV induz alterações de confirmação do ENV que expõem os epítopos 17 B e 48 D que se sobrepõem ao local de ligação do co-receptor, mas não afeta o domínio externo que reconhece o anticorpo dois G 12. Para avaliar o impacto das mutações pontuais na confirmação da NV, foram utilizados dois mutantes ENV H 66 A, que tem uma propensão diminuída para amostrar espontaneamente a confirmação ligada ao CD quatro e S3 75 W, que predispõe o NV ao estado de ligação CD quatro. A normalização dos dados brutos de acordo com os níveis de expressão revela que H 66 A diminui o reconhecimento de CD quatro I 17 B, enquanto S3 75 W aumenta o sinal 17 B e é suficiente para restaurar o fenótipo do H 66.

Um ensaio mutante de células transfectado com quantidades crescentes de um expressor CD quatro. Juntamente com as barras azuis NV, revelaram sinais crescentes para anticorpos monoclonais CD quatro I, A três, dois e C 11, que reconheceram epítopos descontínuos no domínio interno da glicoproteína ENV. O reconhecimento de GP um 20 ENV pelos dois anticorpos G 12 não foi afetado.

Por fim, os dados brutos foram normalizados para dois G 12, a ausência de uma modulação 32 e C 11 quando o ENV foi transfectado com um mutante CD quatro com capacidade diminuída de interagir com o ENV indica que o aumento dos sinais dependia da interação E NV CD quatro Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em quatro horas.