Name: Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Aprenda a avaliar a conformação das glicoproteínas do envelope do HIV-1 usando um ensaio ELISA celular. Este método permite analisar a interação de anticorpos monoclonais com baixo consumo de reagentes e alta vazão.

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Agradecemos ao Dr. James Robinson, pelo seu dom generoso da A32, 17b, 48d, e C11 mAbs. PGT 121 foi obtido por meio do Programa de reagentes NIH AIDS, da Divisão de AIDS, NIAID, NIH (Cat # 12343). Este trabalho foi financiado pela Fundação Canadense para a Inovação Líder de Programa # 29866, por uma operação CIHR # 257792, por um FRQS Estabelecimento de Jovem Cientista conceder # 24639 para AF e por um subsídio contínuo CRCHUM, bem como por um CIHR concessão catalisador # 126630 a AF e MR. AF é o destinatário de uma FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 comunhão # 24639. MV foi apoiado por um Prêmio de Pesquisa de Doutorado CIHR # 291485.

1 Dia 1 - Cultura de Células <ol><li> Placa de 2 x 10 4 osteossarcoma humano (HOS) células por poço de uma, placa de 96 poços de cultura de células opaco adequado para leitura de luminescência. Use de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% soro fetal bovino (FBS) e 100 U / ml de penicilina-estreptomicina. Incubar até ao dia seguinte a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 2 Dia 2 - polietilenimina (PEI) transfecção <ol><li> Preparar a mistura de transfecção de acordo com os passos subsequentes. Ajustar reagentes e quantidades de DNA de acordo com o número de poços a serem transfectadas com o mesmo Env. </li><li> O tubo A: Adiciona-se 10 ng de plasmídeo que codifica Tat (tais como PTAT III-27) e 150 ng de plasmídeo que codifica Env-5 ul de DMEM suplementado com HEPES 25 mM. </li><li> O plasmídeo Tat-codificação só é necessária quando se utiliza plasmídeos Tat-dependente ENV-codificam como pSVIII. </li><li> Tubo B: Adicionar 450 ng PEI (a partir de um 1ug / solução ul) a 5 mL de DMEM. </li><li> Adicionar o conteúdo do tubo B do tubo A. Misturar completamente em vortex durante 10 seg e incubar mistura de transfecção de 10 min à temperatura ambiente (22 ° C). </li><li> Adicionar 10 ml da mistura de transfecção por poço da placa de 96 poços. Incubar durante 48 horas a 37 ° C, 5% de CO 2. </li></ol> 3 Dia 4 - ELISA <ol><li> Realizar todos os experimentos à temperatura ambiente para minimizar possível endocitose de env / anticorpos complexos. </li><li> Preparar 250 ml de tampão de lavagem por cada placa ser utilizados ao mesmo tempo. Tampão de Lavagem é solução salina 1x com Tris (TBS) pH 7.5 (50 mM Tris-Cl, pH 7,5; NaCl 150 mM), suplementado com 1 mM de MgCl 2 e 1,8 mM de CaCl 2. </li><li> Prepare 125 ml de tampão de bloqueio por placa, adicionando leite em pó desnatado 1% e 5 mM Tris pH 8,0 e tampão de lavagem. </li><li> Remover o meio de cultura de células e mistura de transfecção (sobrenadante) a partir de placa de 96 poços. </li><li> Adicionam-se 100 μ; L de tampão de bloqueio por po e incubar 20 min a RT. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 50 uL de anticorpo (ou soro) por poço, diluiu-se a concentração apropriada em tampão de bloqueio. Tipicamente, utilizar uma concentração de 1 ug / ml. Incubar 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3x com 100 ul tampão de bloqueio e repita 3x processo de lavagem com 100 mL tampão de lavagem. </li><li> Remover o sobrenadante, adiciona-se 100 ul tampão de bloqueio, e incuba-se 5 minutos à TA. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 50 uL de anticorpo secundário, diluídos 1/3000 em tampão de bloqueio. Varie diluição do anticorpo ideal de acordo com as diferenças fabricante. Incubar 40 min a RT. </li><li> Lavar 3x com 100 ul tampão de bloqueio e repita 3x processo de lavagem com 100 mL tampão de lavagem. </li></ol> 4 Aquisição de Dados <ol><li> Remover o sobrenadante a partir da placa e adicionar 30 ul de 1x quimioluminescência aumentada (ECL) de substrato por poço. </li><li> Adquirir chemiluminescence sinal por 1 segundo / po num leitor de placas apropriado de acordo com as instruções do fabricante. O tempo de leitura pode variar de acordo com as diferenças de hardware. </li></ol>

<ol><li>Bures, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+recombinant+canarypox+vectors+expressing+membrane-anchored+glycoprotein+120+followed+by+glycoprotein+160+boosting+fails+to+generate+antibodies+that+neutralize+R5+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Immunization with recombinant canarypox vectors expressing membrane-anchored glycoprotein 120 followed by glycoprotein 160 boosting fails to generate antibodies that neutralize R5 primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> AIDS Res. Human Retroviruses. 16, 2019-2035 (2000).</li>
<li>Koff, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+vaccine+development%3A+challenges+and+opportunities+towards+solving+the+HIV+vaccine-neutralizing+antibody+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">HIV vaccine development: challenges and opportunities towards solving the HIV vaccine-neutralizing antibody problem.</a> Vaccine. 30, 4310-4315 (2012).</li>
<li>Mascola, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+envelope+subunit+vaccine+products+elicits+neutralizing+antibodies+against+laboratory-adapted+but+not+primary+isolates+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+National+Institute+of+Allergy+and+Infectious+Diseases+AIDS+Vaccine+Evaluation%22%5BJournal%5D)">Immunization with envelope subunit vaccine products elicits neutralizing antibodies against laboratory-adapted but not primary isolates of human immunodeficiency virus type 1.</a> The National Institute of Allergy and Infectious Diseases AIDS Vaccine Evaluation. 173, 340-348 (1996).</li>
<li>Rerks-Ngarm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccination+with+ALVAC+and+AIDSVAX+to+prevent+HIV-1+infection+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand.</a> N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).</li>
<li>Roederer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+virological+mechanisms+of+vaccine-mediated+protection+against+SIV+and+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological and virological mechanisms of vaccine-mediated protection against SIV and HIV.</a> Nature. 505, 502-508 (2014).</li>
<li>Fennie, C., Lasky, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+for+intracellular+folding+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Model for intracellular folding of the human immunodeficiency virus type 1 gp120.</a> J. Virol. 63, 639-646 (1989).</li>
<li>Willey, R. L., Bonifacino, J. S., Potts, B. J., Martin, M. A., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+cleavage%2C+and+degradation+of+the+human+immunodeficiency+virus+1+envelope+glycoprotein+gp160%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis cleavage, and degradation of the human immunodeficiency virus 1 envelope glycoprotein gp160.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 9580-9584 (1988).</li>
<li>Bosch, V., Pawlita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+env+gene+product+proteolytic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the human immunodeficiency virus type 1 env gene product proteolytic cleavage site.</a> J. Virol. 64, 2337-2344 (1990).</li>
<li>Hallenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+furin-mediated+cleavage+activation+of+HIV-1+glycoprotein+gp160%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160.</a> Nature. 360, 358-361 (1038).</li>
<li>Li, Y., Luo, L., Thomas, D. Y., Kang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+Env+protein+signal+sequence+retards+its+cleavage+and+down-regulates+the+glycoprotein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 Env protein signal sequence retards its cleavage and down-regulates the glycoprotein folding.</a> Virology. 272, 417-428 (2000).</li>
<li>Leonard, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+intrachain+disulfide+bonds+and+characterization+of+potential+glycosylation+sites+of+the+type+1+recombinant+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+%28gp120%29+expressed+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assignment of intrachain disulfide bonds and characterization of potential glycosylation sites of the type 1 recombinant human immunodeficiency virus envelope glycoprotein (gp120) expressed in Chinese hamster ovary cells.</a> J. Biol. Chem. 265, 10373-10382 (1990).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+study+of+the+N-glycosylation+sites+of+HIV-1+envelope+protein+on+infectivity+and+antibody-mediated+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">A systematic study of the N-glycosylation sites of HIV-1 envelope protein on infectivity and antibody-mediated neutralization.</a> Retrovirology. 10 (14), (2013).</li>
<li>Helseth, E., Olshevsky, U., Furman, C., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein+regions+important+for+association+with+the+gp41+transmembrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein regions important for association with the gp41 transmembrane glycoprotein.</a> J. Virol. 65, 2119-2123 (1991).</li>
<li>Haim, H., Salas, I., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+processing+of+the+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoprotein+precursor+decreases+conformational+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteolytic processing of the human immunodeficiency virus envelope glycoprotein precursor decreases conformational flexibility.</a> J. Virol. 87, 1884-1889 (2013).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+immune+evasion+at+the+site+of+CD4+attachment+on+HIV-1+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis of immune evasion at the site of CD4 attachment on HIV-1 gp120.</a> Science. 326, 1123-1127 (2009).</li>
<li>Kwong, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+evades+antibody-mediated+neutralization+through+conformational+masking+of+receptor-binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 evades antibody-mediated neutralization through conformational masking of receptor-binding sites.</a> Nature. 420, 678-682 (2002).</li>
<li>Sakai, K., Takiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+an+effective+AIDS+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toward an effective AIDS vaccine development.</a> Eur. J. Immunol. 43, 3087-3089 (2013).</li>
<li>Veillette, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+Cellular+CD4+Exposes+HIV-1+Envelope+Epitopes+Targeted+by+Antibody-Dependent+Cell-Mediated+Cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity.</a> J. Virol. 88, 2633-2644 (2014).</li>
<li>Wibmer, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+escape+from+HIV-1+neutralizing+antibodies+drives+increased+plasma+neutralization+breadth+through+sequential+recognition+of+multiple+epitopes+and+immunotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Viral escape from HIV-1 neutralizing antibodies drives increased plasma neutralization breadth through sequential recognition of multiple epitopes and immunotypes.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003738), (2013).</li>
<li>Kovacs, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+envelope+trimer+elicits+more+potent+neutralizing+antibody+responses+than+monomeric+gp120%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">HIV-1 envelope trimer elicits more potent neutralizing antibody responses than monomeric gp120.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 12111-12116 (2012).</li>
<li>Yuan, W., Bazick, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+multiple+conformational+States+of+free+monomeric+and+trimeric+human+immunodeficiency+virus+envelope+glycoproteins+after+fixation+by+cross-linker%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the multiple conformational States of free monomeric and trimeric human immunodeficiency virus envelope glycoproteins after fixation by cross-linker.</a> J. Virol. 80, 6725-6737 (2006).</li>
<li>Guttman, M., Lee, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+interaction+between+gp41+and+gp120+is+observed+for+monomeric+but+not+oligomeric%2C+uncleaved+HIV-1+Env+gp140%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A functional interaction between gp41 and gp120 is observed for monomeric but not oligomeric, uncleaved HIV-1 Env gp140.</a> J. Virol. 87, 11462-11475 (2013).</li>
<li>Ringe, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+strongly+influences+whether+soluble+HIV-1+envelope+glycoprotein+trimers+adopt+a+native-like+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cleavage strongly influences whether soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers adopt a native-like conformation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 18256-18261 (2013).</li>
<li>Desormeaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+highly+conserved+layer-3+component+of+the+HIV-1+gp120+inner+domain+is+critical+for+CD4-required+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The highly conserved layer-3 component of the HIV-1 gp120 inner domain is critical for CD4-required conformational transitions.</a> J. Virol. 87, 2549-2562 (2013).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+CD4+and+CD4-mimetic+compounds+inhibit+HIV-1+infection+by+induction+of+a+short-lived+activated+state%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a short-lived activated state.</a> PLoS Pathogens. 5 (e1000360), (2009).</li>
<li>Haim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+intrinsic+reactivity+of+the+HIV-1+envelope+glycoproteins+to+CD4-independent+infection+and+global+inhibitor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Contribution of intrinsic reactivity of the HIV-1 envelope glycoproteins to CD4-independent infection and global inhibitor sensitivity.</a> PLoS Pathogens. 7 (e1002101), (2011).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+changes+in+gp120-CD4+binding+affinity+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+glycoprotein+function+and+soluble+CD4+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of changes in gp120-CD4 binding affinity on human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein function and soluble CD4 sensitivity.</a> J. Virol. 65, 5007-5012 (1991).</li>
<li>Medjahed, H., Pacheco, B., Desormeaux, A., Sodroski, J., Finzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+gp120+major+variable+regions+modulate+cold+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 gp120 major variable regions modulate cold inactivation.</a> J. Virol. 87, 4103-4111 (2013).</li>
<li>Thali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+conserved+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+neutralization+epitopes+exposed+upon+gp120-CD4+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of conserved human immunodeficiency virus type 1 gp120 neutralization epitopes exposed upon gp120-CD4 binding.</a> J. Virol. 67, 3978-3988 (1993).</li>
<li>Finzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+layers+in+the+HIV-1+gp120+inner+domain+regulate+gp41+interaction+and+CD4-triggered+conformational+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Topological layers in the HIV-1 gp120 inner domain regulate gp41 interaction and CD4-triggered conformational transitions.</a> Mol. Cell. 37, 656-667 (2010).</li>
<li>Kassa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitions+to+and+from+the+CD4-bound+conformation+are+modulated+by+a+single-residue+change+in+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+inner+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Transitions to and from the CD4-bound conformation are modulated by a single-residue change in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 inner domain.</a> J. Virol. 83, 8364-8378 (2009).</li>
<li>Xiang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic+stabilization+and%2For+disruption+of+a+CD4-bound+state+reveals+distinct+conformations+of+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+gp120+envelope+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mutagenic stabilization and/or disruption of a CD4-bound state reveals distinct conformations of the human immunodeficiency virus type 1 gp120 envelope glycoprotein.</a> J. Virol. 76, 9888-9899 (2002).</li>
<li>Mouquet, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex-type+N-glycan+recognition+by+potent+broadly+neutralizing+HIV+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Complex-type N-glycan recognition by potent broadly neutralizing HIV antibodies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3268-3277 (2012).</li>
<li>Julien, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+neutralizing+antibody+PGT121+allosterically+modulates+CD4+binding+via+recognition+of+the+HIV-1+gp120+V3+base+and+multiple+surrounding+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Broadly neutralizing antibody PGT121 allosterically modulates CD4 binding via recognition of the HIV-1 gp120 V3 base and multiple surrounding glycans.</a> PLoS Pathogens. 9 (e1003342), (2013).</li>
<li>Walker, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+neutralization+coverage+of+HIV+by+multiple+highly+potent+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies.</a> Nature. 477, 466-470 (2011).</li>
<li>Moore, J. P., Willey, R. L., Lewis, G. K., Robinson, J., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+evidence+for+interactions+between+the+first%2C+second%2C+and+fifth+conserved+domains+of+the+gp120+surface+glycoprotein+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Immunological evidence for interactions between the first, second, and fifth conserved domains of the gp120 surface glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 68, 6836-6847 (1994).</li>
<li>Robinson, J. E., Yoshiyama, H., Holton, D., Elliott, S., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+antigenic+sites+on+HIV+gp120+identified+by+a+panel+of+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Distinct antigenic sites on HIV gp120 identified by a panel of human monoclonal antibodies.</a> J. Cell. Biochem. Suppl. 16E (Q449), (1992).</li>
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<li>Brand, D., Srinivasan, K., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+entry+in+the+CDR2+loop+of+the+CD4+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Determinants of human immunodeficiency virus type 1 entry in the CDR2 loop of the CD4 glycoprotein.</a> J. Virol. 69, 166-171 (1995).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Este ensaio foi optimizado para detectar a interacção de mAbs específicos com HIV-1 trimérico Env expressa na superfície da célula. Uma vez que o protocolo foi estabelecida, ela pode ser utilizada na forma de altas taxas de transferência, com baixos custos materiais globais e pequenas quantidades de anticorpos. Uma vez que este ensaio é à base de transfecção, que pode facilmente ser adaptada para a co-expressão de proteínas celulares, tais como CD4, a fim de estudar os seus efeitos na conformação Env. <p class="jove...

Humano do tipo 1 do vírus da imunodeficiência (HIV-1) de entrada, mediada pelas glicoproteínas do envelope viral triméricos (Env), é a primeira etapa do ciclo infeccioso. Sendo o único antigénio viral exposto apresentado na superfície de viriões, o trímero de Env elicia anticorpos neutralizantes e não neutralizantes. Como tal, ele representa um candidato interessante para o design imunogénio de vacina. No entanto, ensaios de vacinação com Env em formas solúveis ou recombinante induziu respostas com apenas uma eficácia mínima contra mais primário de HIV-1 isolados de 1-3. No entanto, a eficácia parcial observada no teste de vacina RV144 4 renovado interesse em HIV-1 Env como candidato imunógeno. Esse fato foi corroborado por um estudo recente descreve que os anticorpos anti-Env provocada por vacina foram suficientes para gerar um certo grau de proteção contra SIV e HIV desafia 5. Depois de ser sintetizada no retículo endoplasmático, o glycoprote Envno precursor, a gp160, sofre várias modificações pós-traducionais que são críticos para a sua capacidade para alimentar o processo de fusão viral. O precursor Env deve dobrar corretamente e associado em trímeros antes de ser clivada em seus gp120 e gp41 transmembrana extra-citoplasmática subunidades 6-10, com interações não covalentes mantendo a ligação gp120-gp41. A maquinaria da célula infectada, também é fortemente responsável pela glicosilação de Env, compreendendo cerca de 50% da sua massa total de 11,12. A estrutura complexa resultante permite Env ser conformação flexível 13,14, enquanto fornece uma metaestabilidade que é pensado para permitir Env para se adaptar e se esconder certos epítopos altamente imunogênica que seriam expostos 15-19, destacando a importância de compreender melhor as diferentes conformações amostrados pelo trimer Env nativa. Até à data, são conhecidos vários métodos têm sido desenvolvidos e utilizados com sucesso para estudar Env ch conformacionalanges. No entanto, eles variam em suas limitações, sendo, muitas vezes restrita a contextos específicos Env. Por exemplo, a ressonância de plasmon de superfície ou ensaios de imunoprecipitação, utilizando anticorpos monoclonais específicos de conformação (mAbs), dependem quer em moléculas solúveis ou solubilizadas monoméricos de Env que são conhecidos por serem imunogeneticamente diferente das suas formas triméricas 20,21. Estudos recentes também sugerem que a clivagem afecta as conformações de Env que resultam na exposição de epitopos reconhecidos, principalmente, pelos anticorpos não neutralizantes 14,22,23. Aqui vamos descrever em detalhes um método que permite a determinação rápida e fácil de conformação de expressa-celularmente Env trï¿½eros 18,24-26. Após a transfecção transiente de Env numa linha celular humana aderente a ligação de anticorpos específicos de Env é detectado utilizando uma simples reacção de quimioluminescência. Esta técnica também pode ser usada para caracterizar a preferência conformacional de conformação-depenanticorpos Dent. Assim, este ensaio proporciona um método de detecção robusta e altamente flexível.

<table><tbody><tr><td>Células HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Cultura de Tecidos Opaca Branca, 96 poços, Fundo Plano</td><td>BD</td><td>353296</td><td></td></tr><tr><td>Polietileminina, linear, 25.000 MW</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td>Preparado em solução de 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-humano de cabra, peroxidase conjugada</td><td>Pierce</td><td>31413</td><td></td></tr><tr><td>Substrato de Quimioluminescência Aprimorada</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL105001EA</td><td></td></tr><tr><td>TriStar LB 941, Leitor de Placas</td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação conformacional do hiv-1 trimérico glicoproteínas do envelope usando um elisa ensaio celular

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

as glicoproteínas do envelope do HIV-1 (Env) medeiam a entrada viral nas células-alvo e são essenciais para o ciclo infeccioso. Entender como essas glicoproteínas são capazes de alimentar o processo de fusão por meio de suas mudanças conformacionais pode levar ao design de imunógenos melhores e mais eficazes para estratégias de vacinas. Aqui descrevemos um ensaio ELISA baseado em células que permite estudar o reconhecimento do Env trimérico do HIV-1 por anticorpos monoclonais. Após a expressão do HIV-1 trimeric Env na superfície das células transfectadas, os anticorpos anti-Env específicos da conformação são incubados com as células. Um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano e uma reação simples de quimioluminescência são então usados para detectar anticorpos ligados. Este sistema é altamente flexível e pode detectar alterações conformacionais de Env induzidas por CD4 solúvel ou proteínas celulares. Requer uma quantidade mínima de material e nenhum equipamento ou know-how altamente especializado. Assim, essa técnica pode ser estabelecida para triagem de antígenos e anticorpos de médio a alto rendimento, como anticorpos recém-isolados.

Utilizando o procedimento geral descrito acima, nós adaptamos o protocolo para ensaiar os efeitos de CD4 solúvel (sCD4) e CD4 celular co-expresso na exposição de epitopos de cada CD4i de tipo selvagem (wt) ou mutadas Env, como descrito anteriormente, 18,24, 25,28. Figura 1 representa esquematicamente o procedimento geral e a exposição de epítopos CD4i após o tratamento com sCD4 ou por co-expressão de CD4 celular 18. Na Figura 2, o sCD4 foi utilizado para induzir mu...

Compreender as conformações dos antígenos de superfície viral é necessário para avaliar a neutralização de anticorpos e orientar o projeto de imunógenos vacinais eficazes. Aqui descrevemos um ensaio ELISA baseado em células que permite o estudo do reconhecimento do Env trimérico do HIV-1 expresso na superfície das células transfectadas por anticorpos anti-Env específicos.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

O objetivo geral do experimento a seguir é interrogar as glicoproteínas de um envelope do HIV RIC ou a confirmação de ENV com anticorpos monoclonais. Isso é conseguido primeiro transeccionando células de adesão para expressar proteínas quiméricas HIV one E NV na superfície celular. Como segunda etapa, as células são incubadas com anticorpos monoclonais anti-ENV, que se ligam ao ENV dependendo da exposição ao epítopo.Em seguida, um anticorpo secundário conjugado com HRP é adicionado para quantificar a interação do anticorpo por um ensaio de quimioluminescência. São obtidos resultados que mostram níveis relativos de anticorpos ligados ao VNV com base nas unidades de luz relativas adquiridas para cada um. Bem, a principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a vinculação baseada em fatos, é que essa técnica pode ser feita com baixa quantidade de anticorpos e com alto rendimento, um pós-doutorado no laboratório realizará essa técnica.As células de osteossarcoma humano são usadas neste experimento um dia antes da placa de transfecção, duas vezes 10 elevado a quarto células por poço. Em uma placa de cultura de células opaca de 96 poços adequada para leitura de luminescência. Usado meio de águia modificado delcos suplementado com soro fetal bovino e penicilina estreptomicina incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono no dia seguinte.Prepare a mistura de transfecção. Primeiro, coloque dois tubos, dois compartimentos e dois B para dois compartimentos. Adicione cinco microlitros de DMEM suplementados com 25 hippies milimolares, seguidos por 10 nanogramas de plasmídeo de tat e revestimento e 150 nanogramas de plasmídeo quimérico de glicoproteína de um envelope do HIV.Observe que o plasmídeo que codifica TAT só é necessário ao usar o plasmídeo codificador de glicoproteína de um envelope do HIV dependente de tat para dois B a cinco microlitros de DMM e 450 nanogramas de polietilina ou PEI. As quantidades dos reagentes e DNA devem ser ajustadas de acordo com o número de poços que devem ser transfectados com a mesma glicoproteína de um envelope do HIV. Em seguida, adicione o conteúdo de dois B a dois compartimentos e misture bem por vórtice por 10 segundos.Incube a mistura de transfecção por 10 minutos em temperatura ambiente. Após 10 minutos, adicione 10 microlitros da mistura de transfecção por poço da placa de 96 poços incubada por 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de óxido de carbono. O Ali SA para estudar o reconhecimento da glicoproteína quimérica do HIV por um envelope por anticorpos monoclonais é realizado dois dias após a transfecção das células do osteossarcoma humano.Prepare 250 mililitros de tampão de lavagem por placa que está sendo usada ao mesmo tempo. Prepare 125 mililitros de tampão de bloqueio por placa, adicionando 1% de leite em pó desnatado e cinco milimolares de tris pH 8,0 ao tampão de lavagem. Remova o meio de cultura celular e a mistura de transfecção da placa de 96 poços.Adicione 100 microlitros de tampão de bloqueio por poço e incube por 20 minutos. À temperatura ambiente, remova o sobrenadante e adicione 50 microlitros de anticorpo por poço diluído à concentração apropriada no tampão de bloqueio. Incube por uma hora em temperatura ambiente.Lave três vezes com 100 microlitros de tampão de bloqueio e repita o processo de lavagem três vezes. Lave três vezes com 100 microlitros de tampão de bloqueio e depois lave três vezes com 100 microlitros de tampão de lavagem após a última lavagem. Retire o sate.Adicione 100 microlitros de tampão de bloqueio e incube por cinco minutos. À temperatura ambiente, remova o sobrenadante e adicione 50 microlitros de anticorpo secundário diluído um a 3000 no tampão de bloqueio. Incube por 40 minutos em temperatura ambiente após 40 minutos.Lave três vezes com 100 microlitros de tampão de bloqueio, seguido de três lavagens com 100 microlitros de tampão de lavagem. Para preparar as amostras para aquisição de dados, remova o sobrenadante da placa de 96 poços e adicione 30 microlitros de um substrato de quimioluminescência aprimorado por poço. Adquira o sinal de quimioluminescência por um segundo por poço em um leitor de placas adequado.De acordo com as instruções do fabricante, o impacto do CD quatro solúvel ou S CD quatro na exposição dos epítopos do CD quatro I nas glicoproteínas do envelope ou ENV foi ensaio A interação do CD quatro com o ENV induz alterações de confirmação do ENV que expõem os epítopos 17 B e 48 D que se sobrepõem ao local de ligação do co-receptor, mas não afeta o domínio externo que reconhece o anticorpo dois G 12. Para avaliar o impacto das mutações pontuais na confirmação da NV, foram utilizados dois mutantes ENV H 66 A, que tem uma propensão diminuída para amostrar espontaneamente a confirmação ligada ao CD quatro e S3 75 W, que predispõe o NV ao estado de ligação CD quatro. A normalização dos dados brutos de acordo com os níveis de expressão revela que H 66 A diminui o reconhecimento de CD quatro I 17 B, enquanto S3 75 W aumenta o sinal 17 B e é suficiente para restaurar o fenótipo do H 66.Um ensaio mutante de células transfectado com quantidades crescentes de um expressor CD quatro. Juntamente com as barras azuis NV, revelaram sinais crescentes para anticorpos monoclonais CD quatro I, A três, dois e C 11, que reconheceram epítopos descontínuos no domínio interno da glicoproteína ENV. O reconhecimento de GP um 20 ENV pelos dois anticorpos G 12 não foi afetado.Por fim, os dados brutos foram normalizados para dois G 12, a ausência de uma modulação 32 e C 11 quando o ENV foi transfectado com um mutante CD quatro com capacidade diminuída de interagir com o ENV indica que o aumento dos sinais dependia da interação E NV CD quatro Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em quatro horas.

conformational-evaluation-hiv-1-trimeric-envelope-glycoproteins-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A região da coroa de seqüências diferentes V3 loop do envelope glicoproteína de superfície (gp120) do HIV-1 pode ser caracterizada estruturalmente em muitos casos por in silico dobrar de posições 10-22 do loop usando um...

Avaliação da dinâmica imunologicamente relevantes Terciário características estruturais do HIV 1-V3 loop Sequence R2 Crown por Ab initio Folding

Nós desenvolvemos um vetor lentiviral que possui, além da LTR Tat-responsivo, o elemento Rev-resposta (RRE), que pode regular a expressão do gene repórter de uma forma HIV-1 Tat e Rev-dependente. O vetor permite a detecção específica de HIV replicar em células vivas através da expressão da GFP.

Marcação específica de HIV-1 células positivas utilizando um Vector Rev-dependente Lentivirus Expressando a Proteína Verde Fluorescente

O protocolo descreve uma abordagem de alto rendimento para determinação de estruturas de proteínas de membrana usando tomografia crio-eletrônica e processamento de imagens 3D. Abrange os detalhes da preparação da amostra, coleta de dados, processamento e interpretação dos dados, e conclui com a produção de um alvo representante para a abordagem, o HIV-1 glicoproteína do envelope. Estes procedimentos computacionais são projetados de uma forma que permite aos pesquisadores e estudantes para...

Determinação de estruturas moleculares de glicoproteínas do envelope HIV usando Cryo-Electron Tomografia e Média Sub-tomogram Automated

Vários aptâmeros 2'Fluoro-RNA contra o HIV-1BA-L gp120 com nanomole afinidade são isolados de uma biblioteca por...

Desenvolvimento de células de tipo específico anti-HIV gp120 aptâmeros para entrega siRNA

Este artigo descreve um método para visualizar a formação de uma sinapse envelope de HIV-1 induzida por virológica em vidro suportados bicamadas planares por reflexão total interna de fluorescência microscopia (TIRF). O método pode também ser combinado com coloração de imunofluorescência para detectar a activação e redistribuição de moléculas de sinalização que ocorrem durante o HIV-1 a formação de sinapses envelope induzida virológica.

Imagem do HIV-1 Synapse Envelope induzida virológica e Sinalização em bicamadas lipídicas sintéticas

Ilustramos aqui um ensaio de ligação à membrana in vitro no qual as interações entre HIV-1 Gag e membranas lipídicas são analisadas visualmente usando Gag marcado com YFP sintetizado em um sistema de tradução in vitro baseado em gérmen de trigo e GUVs preparados por uma técnica de eletroformação.

Visualização de HIV-1 Gag vinculação a gigante Unilamelares vesículas (GUV) Membranas

Descrito é uma metodologia para quantificar a expressão dos 96 genes e 18 proteínas de superfície por células únicas ex vivo, permitindo a identificação de diferencialmente expressaram genes e proteínas em células infectadas por vírus em relação as células não infectadas. Aplicamos a abordagem de estudo CD4 infectadas SIV+ T células isoladas de macacos rhesus.

Célula única quantificação de mRNA e expressão de proteínas de superfície em CD4 infectados por vírus de imunodeficiência simiana+ T células isoladas de macacos Rhesus

Descrevemos um ensaio baseados em células para relatório sobre HIV-1 fusão através da expressão da proteína verde fluorescente detectável por microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Ele pode ser usado para testar a inibidores de entrada viral (especificamente na etapa de fusão) em sistemas de infecção sem célula e célula a célula.

Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar epítopos de neutralização em partículas semelhantes a vírus que exibem antígenos (VLPs). A imunoprecipitação do vírus da imunodeficiência humana (HIV) derivada de VLPs é realizada usando anticorpos monoclonais específicos de glicoproteínas de envelope acoplados a contas magnéticas conjugadas por G. Os VLPs capturados são posteriormente submetidos à análise de SDS-PAGE e western blot empregando anticorpos específicos da proteína do núcleo viral.

Detecção de epítopos sensíveis à neutralização em antígenos exibidos em vacinas baseadas em partículas semelhantes a vírus (VLP) usando um ensaio de captura

Aqui, descrevemos um imunoensaio fluorescente multiplex recém-desenvolvido que usa um sistema de citometria de fluxo de repórter duplo para detectar simultaneamente dois epítopos de proteína spike exclusivos em partículas virais intactas do coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) que foram capturadas por microesferas magnéticas acopladas à enzima conversora de angiotensina 2.

Perfil de epítopos de proteínas de superfície em partículas virais por estratégia de repórter duplo multiplex

Aqui, descrevemos alguns métodos estabelecidos para determinar o estresse do retículo endoplasmático (ER) e a ativação da resposta proteica desdobrada (UPR), com ênfase particular na infecção pelo HIV-1. Este artigo também descreve um conjunto de protocolos para investigar o efeito do estresse do RE/UPR na replicação do HIV-1 e na infectividade do vírion.

Medindo o estresse do retículo endoplasmático e a resposta da proteína desdobrada em células T infectadas pelo HIV-1 e analisando seu papel na replicação do HIV-1

Aprenda a avaliar a conformação das glicoproteínas do envelope do HIV-1 usando um ensaio ELISA celular. Este método permite analisar a interação de anticorpos monoclonais com baixo consumo de reagentes e alta vazão.

Avaliação conformacional do HIV-1 trimérico glicoproteínas do envelope Usando um ELISA Ensaio Celular

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