Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An Ex-ovo Eletroporação Approach

O objetivo geral deste procedimento é alcançar alta eficiência, plasmídeo, transfecção de células da retina para permitir estudos genéticos funcionais em culturas primárias da retina. Isso é feito coletando primeiro embriões de galinha no estágio 27 do sistema de hambúrguer e Hamilton. O estadiamento adequado é fundamental para alcançar a eficiência ideal.

O segundo passo é dissecar os olhos embrionários e remover o epitélio pigmentado da retina expondo a retina neural. Em seguida, o copo de retina é colocado em uma câmara cheia de solução de plasmídeo. Em seguida, é submetido à eletroporação sob condições otimizadas usando eletrodos personalizados de fácil construção.

As etapas finais são remover o corpo vítreo e o cristalino e dissociar a retina neural em células únicas para cultura primária de baixa densidade. Em última análise, as células transfectadas podem ser visualizadas pela expressão de genes repórteres ou imuno-histoquímica, e a manipulação genética eficaz pode ser avaliada avaliando a expressão de genes a jusante e/ou alterações celulares fenotípicas. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como lipofecção ou transfecção química, é que ela aumenta a taxa de transfecção de células da retina em cinco vezes, produzindo eficiências de 22 a 25% da população total de células.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia dos fotorreceptores, uma vez que permite a manipulação da expressão gênica em culturas primárias da retina em um nível de eficiência que pode fornecer insights biologicamente significativos. As implicações dessa técnica vão além da pesquisa básica, pois podem ser facilmente adaptadas a tecnologias de alto rendimento para o desenvolvimento de medicamentos. Comece incubando ovos de galinha de chifre de perna branca fertilizados a 37,5 graus Celsius e 60% de umidade relativa por cinco dias em uma incubadora de ovos.

Antes do experimento, obtenha um filamento de caixa normalmente usado em micropipetas. Use uma pinça para desfazer a caixa quadrada e endireitar o filamento em uma tira longa. Em seguida, usando uma régua como guia, dobre o filamento em forma de u quadrado, três milímetros de comprimento na base e dois milímetros de altura de um lado com o outro lado, o comprimento restante do filamento use uma pinça para mergulhar o eletrodo em etanol 96% e inflamar brevemente o eletrodo para esterilizá-lo.

Em seguida, conecte um cabo elétrico com um pequeno clipe jacaré ao braço longo do eletrodo. Em seguida, limpe o eletrodo grosso com ponta dourada usando etanol 70%. Em seguida, prepare a câmara de eletroporação cortando a tampa de um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro usando uma tesoura esterilizada e fixando-a com o lado plano para baixo em uma placa de Petri de 100 milímetros usando fita adesiva.

Em seguida, esterilize as ferramentas de microdissertação mergulhando as pontas do instrumento em etanol a 96% e queimando-as brevemente. Além disso, limpe o escopo de dissecção usando 70% de etanol. Aqueça uma garrafa de solução salina estéril sem cálcio e magnésio Hanks balance em um banho-maria a 37 graus Celsius.

Depois de quente, use-o para encher uma placa de Petri estéril de 100 milímetros com três quartos do caminho. Em seguida, coloque a câmara de eletroporação sob um microscópio de dissecção limpo. Em seguida, conecte os eletrodos ao aparelho de eletroporação, certificando-se de que o eletrodo feito sob medida esteja conectado ao pólo negativo e o eletrodo com ponta de ouro esteja conectado ao pólo positivo da máquina.

Limpe os ovos limpando o exterior das cascas com 70% de etanol. Seja cauteloso e mantenha a esterilidade durante todo o restante do protocolo. Para evitar a contaminação para as culturas usando uma pinça Maloney grande e curva, abra cuidadosamente um orifício na casca do ovo batendo suavemente na ponta arredondada de um ovo diretamente sobre a câmara de ar.

Retire todas as peças da concha com outro par de pinças. Remova as membranas e colete o embrião retirando-o cuidadosamente do ovo. Coloque o embrião em uma placa de Petri com a solução salina Hanks Balance livre de cálcio e magnésio pré-aquecida.

Quando um número adequado de embriões tiver sido coletado, certifique-se de que todos estejam no estágio correto. De acordo com o sistema de estadiamento de hambúrguer e Hamilton para eficiência ideal, os embriões devem estar no estágio 27. Eutanasiar os embriões por decapitação usando pinças de malonia e, em seguida, usar uma pinça dumont para cuidadosamente e nuclear os olhos.

Transfira os olhos para uma nova placa de Petri com HBSS livre de cálcio e magnésio. Comece na parte posterior de cada olho, perto da cabeça do nervo óptico e, em seguida, introduza uma ponta de cada par de pinças de dumont entre a retina neural e o epitélio pigmentado da retina. Trabalhando da parte posterior do olho para a frente, use a pinça para dissecar cuidadosamente o epitélio pigmentado da retina.

Ser cauteloso para não danificar a retina neural. Configure o eletroperter para fornecer cinco pulsos quadrados de 15 volts com duração de 50 milissegundos e um intervalo de 950 milissegundos. Em seguida, encha a câmara de eletroporação com 120 microlitros de solução de plasmídeo a uma concentração de 1,5 microgramas por microlitro em PBS.

Em seguida, coloque o eletrodo negativo em forma de U dentro da câmara de eletroporação da tampa da microcentrífuga. Usando um par de pinças curvas dumont. Transfira uma ventosa de retina para a câmara de eletroporação e coloque-a dentro do eletrodo em forma de U.

Posicione a retina de forma que a parte posterior fique voltada para a parte inferior do eletrodo e a lente fique voltada para cima. Em seguida, coloque o ânodo de forma que toque a parte anterior do olho ao lado da lente. Em seguida, use o pedal do electro raider para fornecer cinco pulsos elétricos.

Quando terminar, transfira o copo de retina eletroporado para uma nova placa de Petri cheia de HBSS livre de cálcio e magnésio. Repita o procedimento de eletroporação com cada copo retiniano adicional. Até seis ventosas retinianas podem ser eletroporadas com a mesma solução de plasmídeo sem uma diminuição significativa na eficiência da transfecção.

Em seguida, use uma pinça dentada de ligação para remover suavemente o cristalino e o corpo vítreo de cada amostra eletroporada enquanto mantém o olho no lugar com a parte de trás das pinças curvas dumont uma vez removidas, prossiga para a dissociação e cultura das células retinianas eletroporadas usando técnicas padrão. As células da retina mostradas aqui foram eletroporadas com expressão de GFP, plasmídeo, dissociadas e cultivadas por quatro dias. Micrografias fluorescentes mostraram núcleos de manchas e células retinianas expressando GFP.

A coloração com anticorpos antivisina foi realizada para identificar células fotorreceptoras. Os parâmetros descritos neste protocolo foram otimizados para obter eficiências de transfecção que se comparam em média à população total após quatro dias. Em cultura, essa medida aumenta para uma média de 25% de eficiência quando apenas a população de fotorreceptores é considerada considerada uma vez dominada.

Esta técnica, desde a coleta de embriões até a eletrooperação, pode ser feita em menos de 30 minutos para seis olhos, se for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que não devem passar mais de três horas entre a coleta dos embriões e o plaqueamento celular dissociado para obter uma cultura de boa qualidade. Essa técnica pode ser aplicada à superexpressão ou correlação de genes, por exemplo, usando um sistema de RNAi.

Além disso, a retina que foi transfectada após este procedimento pode ser usada para culturas organotípicas da retina.