Eficiente Geração células iPS a partir de sangue, utilizando epissomas e HDAC Inibidores

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar células-tronco pluripotentes induzidas livres de integração a partir de uma pequena quantidade de sangue periférico. Isso é obtido cultivando células mononucleares isoladas do sangue periférico em fatores de crescimento definidos para produzir uma população progenitora de eritrócitos que é muito responsiva à reprogramação. Como segundo passo, plasmídeos epissómicos não integradores que transportam genes de reprogramação são introduzidos nos eritroblastos por afecção do núcleo para iniciar o processo de reprogramação.

Em seguida, as células afetadas pelo núcleo são colocadas em uma camada de fibroblastos embrionários de camundongo irradiados para permitir a reprogramação contínua com sucesso. Colônias de células-tronco pluripotentes induzidas reprogramadas podem ser identificadas com base em suas características morfológicas, atividade de fosfatase alcalina, imunoquímica positiva para marcadores de pluripotência e expressão de genes de pluripotência endógena. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a reprogramação baseada em vírus, é que esse protocolo garante a geração consistente de IPSC livre de integração.

Um técnico no laboratório Comece diluindo o sangue periférico na proporção de um para um na SPBD. Em seguida, em um tubo de poliestireno de fundo redondo de 15 mililitros, coloque cuidadosamente sete mililitros de sangue diluído em três mililitros de temperatura ambiente. Após separar a amostra por 30 minutos a 400 GS e temperatura ambiente, o pbmc terá se acomodado na camada de interface branca turva entre o plasma e o pacote alto de fibra.

Usando uma pipeta de transferência estéril, transfira os P BMCs para um tubo cônico de 15 mililitros e aumente o volume para 10 mililitros com DPBS fresco. Em seguida, depois de contar as células, transfira duas vezes 10 para os seis P BMCs em um novo tubo cônico de 15 mililitros e gire as células restantes, congele as células peletizadas em uma concentração de duas vezes 10 a seis pbmc por mililitro em 90% de soro bovino fetal com 10% de dimetilsulfóxido. Então, depois de girar os P BMCs que foram reservados, suspendemos o pellet em dois mililitros de meio de expansão recém-preparado e os colocamos em um poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços, incubamos as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com uma atmosfera de 5% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono e 90% de nitrogênio.

Então, no terceiro e sexto dia, substitua a mídia coletando as células do poço. Lavando o poço com dois mililitros de QBSF 60 para coletar quaisquer células restantes, peletizando as células por centrifugação e, em seguida, suspendendo o pellet em dois mililitros de meio de expansão fresco. Em seguida, retorne as células para a mesma placa de 12 poços e continue a incubação No nono dia, pipete os plasmídeos de reprogramação em um tubo einor estéril de 1,5 mililitro, conforme descrito na tabela.

Em seguida, misture a solução de afeto nucleo com os suplementos fornecidos pelo fabricante e transfira a mistura para um tubo DPH estéril de 1,5 mililitro. Em seguida, dispense dois mililitros de meio de expansão em um poço de uma nova placa de 12 poços e equilibre o meio na incubadora umidificada a 37 graus Celsius até que as células estejam prontas. Colete as células, lave bem a cultura de células como acabamos de demonstrar e lave as células em cinco mililitros de DPBS.

Em seguida, suspenda o pellet celular em 100 microlitros de solução de afeto Nucle mais suplemento tomando cuidado para evitar a geração de bolhas e transfira a suspensão celular para o tubo que contém o plasmídeo de reprogramação. Misture as células pipetando para cima e para baixo uma vez e transfira toda a solução para o fundo de um núcleo de afecção vete. Em seguida, coloque o vete na máquina de afeto Nucle e execute o programa T 0 1 9.

Agora adicione 100 microlitros do meio de expansão EQUILIBRADO ao afeto do núcleo e colete imediatamente toda a amostra evitando quaisquer detritos de células mortas flutuantes brancas e deposite-a no poço do meio pré-aquecido. Em seguida, coloque as células de volta na incubadora umidificada no dia 10 ou 11. Cubra cada poço de uma placa de cultura de tecidos de seis poços com gelatina com um mililitro de gelatina a 0,1% em HBSS e, em seguida, coloque a placa na incubadora umidificada ou pelo menos cinco minutos durante a incubação, transfira um frasco de descongelamento, duas vezes 10 para os seis camundongos irradiados com 3000 graus centígrados, embrionários, fibroblastos ou mes em 10 mililitros de meio de metanfetamina pré-aquecido, e depois centrifugue as células enquanto as células estão girando.

Aspire a solução de gelatina da placa de seis poços e, em seguida, ressuspenda o mes em 12 mililitros de meio de metanfetamina fresco. Dispense imediatamente dois mililitros de OFMs em cada poço do revestido de gelatina. Seis. Poço e coloque o prato de volta na incubadora umidificada até o dia 12.

No dia 12, colete as células afetadas pelo núcleo do poço em um tubo cônico de 15 mililitros, lavando o poço conforme demonstrado para coletar as células restantes. Depois de girar as células, suspendemos o pellet em 12 mililitros de meio de reprogramação recém-preparado e dispensamos dois mililitros de células em cada poço de células alimentadoras. Na placa de seis poços, centrifugue a placa por 30 minutos a 75 GS e temperatura ambiente e, em seguida, coloque a placa de volta na incubadora umidificada, trocando o meio a cada dois dias por uma a duas semanas.

Assim que as colônias de células pluripotentes induzíveis aparecerem, comece a alimentar as células com meio de células-tronco embrionárias humanas recém-preparado contendo inibidores da histona desacetilase três dias após a afecção do núcleo e antes do plaqueamento, as células afetadas pelo núcleo na metanfetamina induzível. A eficiência de uma afecção nuclear NU bem-sucedida deve ser estimada por microscopia de fluorescência Para EGFP, por exemplo, mostrado aqui é um experimento típico de afecção de núcleos com aproximadamente cinco a 10% da população total de células expressando EGFP colônias de células-tronco pluripotentes induzíveis reprogramadas começarão a aparecer aproximadamente duas semanas após a afecção nuclear NU. As colônias são geralmente circulares com bordas bem definidas e podem ser identificadas por sua morfologia característica de células-tronco embrionárias humanas, incluindo pequenas células compactadas com alta proporção nuclear para citoplasmática e nucléolos visíveis das linhagens representativas que foram completamente caracterizadas.

Todos os testes positivos para a atividade da fosfatase alcalina expressam os marcadores de pluripotência padrão e reativam os genes de pluripotência endógena Uma vez dominados. Essa técnica pode gerar consistentemente IPSC livre de integração em quatro semanas, se for executada corretamente. Após este procedimento, estudos de diferenciação podem ser realizados para responder a perguntas sobre qualquer tipo de tecido.