Name: Eficiente Geração células iPS a partir de sangue, utilizando epissomas e HDAC Inibidores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Aprenda a gerar células iPS livres de integração a partir de sangue periférico utilizando plasmídeos episomais e inibidores de HDAC. Este método eficiente minimiza riscos de mutagênese insercional para aplicações terapêuticas.

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Os autores gostariam de agradecer às seguintes concessões do NIH para apoiar esta pesquisa: K08DK082783 (AR), P30DK56465 (BTS), U01HL099993 (BTS), T32HL00715036 (SKS) e K12HL0806406 (SKS); ea Fundação McCarthy JP (AR).

Consentimento informado, aprovado pelos Conselhos de Revisão Institucional da Cancer Research Center Fred Hutchinson e as crianças &quot;s Hospital of Philadelphia, foi obtido de pacientes antes de coletar amostras de sangue periférico. Foram observadas Todas as diretrizes institucionais. Todos os experimentos com animais, incluindo geração e MEF formação de teratomas foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional. 1. Ficoll separação de PBMC e Expansão da Erythroblasts - Dia 0 <ol><li> Dilui-se sangue periférico de 1: 1 com Solução Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco (DPBS). Em um tubo de poliestireno de fundo redondo de 15 ml, a camada cuidadosamente 7 ml de sangue diluído em 3 mL de temperatura ambiente Ficoll-Hypaque. </li><li> Centrifuga-se a amostra a 400 xg durante 30 min. </li><li> As PBMC irão ter resolvido para a interface entre o plasma e o Ficoll-Hypaque, visto como uma camada branca turva. Usando uma pipeta estéril, recolher o PBMCs em um tubo de 15 ml. Levar o volume até 10 ml, utilizando DPBS. </li><li> Usando um hemocitômetro, contar as PBMC. </li><li> Pipeta de 2 x 10 6 PBMC em um tubo de 15 ml separado e centrifugar a 300 xg durante 5 min. Girar as restantes células e congelamento a uma concentração de 2 x 10 6 PBMC / ml em 90% de soro fetal bovino (FBS) a sulfóxido / 10% de dimetilo (DMSO). </li><li> Prepare meio de expansão: meio isento de soro QBSF-60 (protegido da luz) + penicilina / estreptomicina (1%) + ácido ascórbico (50 ng / ml) + factor de células estaminais (SCF, 50 ng / ml) + a interleucina 3 (IL 3, 10 ng / ml) + eritropoietina (EPO, 2 U / ml) + insulin-like growth factor 1 (IGF-1, 40 ng / mL) + dexametasona (1 uM; proteger da luz; descongelar uma alíquota fresca cada um dos meios alterações). </li><li> Ressuspender 2 × 10 6 PBMC em 2 ml de meio de expansão acabado de fazer e colocar em um poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços e incubar numa incubadora a 37 ° C humidificado com uma atmosfera de 5% De O 2, 5% de CO 2, e 90% de N2. </li><li> No dia 3 eo dia 6, substituir a mídia. <ol><li> Recolher as células e lava-se a bem com 2 ml de QBSF-60 para recolher quaisquer células restantes. </li><li> Centrifuga-se a suspensão de células a 300 xg durante 5 min e aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender as células em 2 ml de meio de expansão e nova devolvê-las para a mesma placa de 12 poços. </li></ol></li></ol> 2. reprogramar células por Nucleofection - Dia 9 <ol><li> Pipetar os plasmídeos de reprogramação para um tubo de 1,5 ml estéril Eppendorf (Tabela 1). </li><li> Misture a solução nucleofection com suplemento (fornecido pelo fabricante) e pipeta em um estéril de 1,5 ml tubo Eppendorf. </li><li> Pipetar 2 ml de meio de expansão em um poço de uma placa de 12 bem e coloque numa atmosfera humidificada de 37 ° C incubadora (5% de O2, 5% de CO 2, e 90% de N2) por razões de equilíbrio antes da adição de células. </li><li> Recolher océlulas de cultura e lavar o poço com 2 ml de QBSF-60 para recolher as células restantes. </li><li> Centrifuga-se as células a 300 xg durante 5 min e aspirar o sobrenadante. </li><li> Lavam-se as células por ressuspensão em 5 mL de DPBS e centrifugar a 300 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o pellet celular em 100 ml de solução nucleofection + Suplemento, tendo o cuidado de evitar a geração de bolhas. </li><li> Pipeta a suspensão de células para dentro do tubo contendo os plasmídeos de reprogramação, pipeta-se para baixo e, uma vez, e pipetar a amostra para o fundo da cubeta nucleofection. </li><li> Coloque a cuvete na máquina nucleofection e executar Programa de T-019. </li><li> Transferir 100 ul da expansão pré-aquecido médio (a partir da placa de equilíbrio no Passo 2.3) na cuvete nucleofection. </li><li> Recolher imediatamente a totalidade da amostra e depósito para o poço de pré-aquecido médio Expansão. Evite recolher o, flutuando restos de células mortas branco. </li&gt; <li> Colocar a placa num incubador humidificado a 37 ° C incubadora (5% de O2, 5% de CO 2, e 90% N 2) para o crescimento. </li></ol> 3. chapeamento células alimentadoras - Dia 10 ou 11 <ol><li> No dia 10, as células da placa de alimentação. <ol><li> Brasão uma placa de 6 poços de cultura de tecidos com gelatina. <ol><li> Pipeta de 1 m de gelatina a 0,1% em Solução Salina Tamponada de Hank (HBSS) para cada poço da placa. </li><li> Colocar a placa num incubador humidificado a 37 ° C incubadora durante pelo menos 5 min. </li><li> Imediatamente antes da utilização, aspirar a solução de gelatina a partir da placa. </li></ol></li><li> Descongelar um frasco de 2 x 10 6 de fibroblastos de rato embrionários irradiadas a 3000 cGy em 10 ml de pré-aquecido MEF Meios (Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) + FBS (10%) + penicilina / estreptomicina (1%)). </li><li> Centrifuga-se as células a 300 xg durante 5 min e aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células em 12 ml de MEF Mídia e pipeta de 2 ml into de cada poço revestido com gelatina a placa de 6 poços. Colocar a placa num incubador humidificado a 37 ° C incubadora (5% de O2, 5% de CO 2, e 90% N 2) até o dia 12. </li></ol></li></ol> 4. cultivo de células em células alimentadoras e Alterando Médio - Dia 12 <ol><li> Coletar as células nucleofected em um tubo de 15 ml e recolher todas as células restantes lavando as bem com 2 ml de QBSF-60. Centrifuga-se a amostra a 300 xg durante 5 min. </li><li> Prepare reprogramação Meio: Iscove Modificado por Dulbecco (IMDM) + FBS (10%) + não animal de L-glutamina (1 mM) + ácidos aminados não essenciais (NEAA, 1%) + penicilina / estreptomicina (1%) + β -mercaptoetanol (0,1 mM) + factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF, adicionado na alimentação fresca, 10 ng / ml) + ácido ascórbico (adicionado fresco na alimentação, 50 ug / ml). </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 12 ml de Meio A reprogramação. Pipeta de 2 ml por cavidade da suspensão de células ema placa de 6 poços de células alimentadoras (como foi preparada na secção 3). Centrifugar a placa a 50 xg durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Colocar a placa num incubador humidificado a 37 ° C incubadora (5% de O2, 5% de CO 2, e 90% N 2) para o crescimento. Altere a Reprogramação Médio em dias alternados até colônias IPSC começam a aparecer (1-2 semanas). </li><li> Preparar células estaminais embrionárias humanas Meio: DMEM / F12 1: 1 + KO substituição Serum (20%) + penicilina / estreptomicina (1%) + NEAA (1%) + não animal de L-glutamina (1 mM) + piruvato de sódio (1%) + bicarbonato de sódio (0,12%) + β-mercaptoetanol (0,1 mM) + bFGF (adicionado fresco na alimentação, 10 ng / ml) </li><li> Prepare inibidores de HDAC: butirato de sódio (adicionado fresco em alimentação, 100 M), ácido suberanilohidroxï¿½ico (SAHA, acrescentou fresco na alimentação, 200 nM). Uma vez colônias IPSC aparecer, começam a alimentar as células com inibidores de células estaminais embrionárias humanas Médio + HDAC, mudando médio a cada dia. NOTA: o butirato de sódio é uma pequena molécula que é adsorvido para os tubos de plástico, tor conseguinte armazená-lo em um tubo de vidro de borosilicato, a 4 ° C. </li></ol> 5. Clones Isolando IPSC <ol><li> Uma vez colônias IPSC são grandes o suficiente para ser isolado (20-25 células), buscá-las com uma pipeta P20. </li><li> Preparar os inibidores de HDAC: butirato de sódio (adicionado fresco a alimentação, 100 uM), SAHA (adicionado fresco a alimentação, 200 nM) </li><li> Coloque as colônias isoladas para iMEFs em pratos individuais mm 35 contendo inibidores de HDAC hESC Médio + + Clonagem &amp; Recovery suplemento. </li><li> O dia após a colheita das colônias, mudar o meio de inibidores de células estaminais embrionárias humanas Médio + HDAC. </li><li> Mudar o meio todos os dias até as colónias IPSC estão prontos para passaging. </li><li> Retirar os inibidores de HDAC do meio uma vez colônias estabilizar em passagem 2-3. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Koche, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+expression+initiates+widespread+targeted+chromatin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodeling.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 96-105 (2011).</li>
<li>Baum, C., Kustikova, O., Modlich, U., Li, Z., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+and+oncogenesis+by+chromosomal+insertion+of+gene+transfer+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis and oncogenesis by chromosomal insertion of gene transfer vectors.</a> Human Gene Therapy. 17 (3), 253-263 (2006).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li>
<li>Hong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+induced+pluripotent+stem+cell+generation+by+the+p53-p21+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.</a> Nature. 460 (7259), 1132-1135 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li>
<li>Yates, J. L., Warren, N., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+replication+of+plasmids+derived+from+Epstein-Barr+virus+in+various+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells.</a> Nature. 313 (6005), 812-815 (1985).</li>
<li>Ware, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibition+elicits+an+evolutionarily+conserved+self-renewal+program+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibition elicits an evolutionarily conserved self-renewal program in embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (4), 359-369 (2009).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+greatly+enhances+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+promoting+epigenetic+remodeling+and+the+expression+of+pluripotency-associated+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Butyrate greatly enhances derivation of human induced pluripotent stem cells by promoting epigenetic remodeling and the expression of pluripotency-associated genes.</a> Stem Cells. 28 (4), 713-720 (2010).</li>
<li>Azuara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of pluripotent cell lines.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 532-538 (2006).</li>
<li>Sommer, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+peripheral+blood+using+the+STEMCCA+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector.</a> J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 237-241 (2009).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Gadi, I., Stewart, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Embryonic+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Derivation of Embryonic Stem Cell Lines.</a> Methods in Enzymology. 225, 803-823 (1993).</li>
<li>Kim, H. J., Bae, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors%3A+molecular+mechanisms+of+action+and+clinical+trials+as+anti-cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs.</a> American Journal of Translational Research. 3 (2), 166-179 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Para a geração de iPSC bem sucedido ao usar este protocolo, existem várias advertências importantes que devem ser considerados. Durante a fase de expansão de eritroblastos, o cronograma de mudança de mídia devem ser rigorosamente seguidas, como desvios podem levar à estimulação ineficiente da população de células progenitoras alvo e uma menor eficiência de geração da IPSC. É importante fazer novo meio de expansão com dexametasona fresco com cada mudança de meios de comunicação; e o meio de base QBSF-60 e dexametasona de...

iPSCs são derivados a partir de tecidos somáticos via expressão ectópica de um conjunto mínimo de genes de pluripotência. Esta técnica foi inicialmente demonstrado por transdução retroviral de fibroblastos humanos com OCT4, SOX2, KLF4, e cMyc, que são altamente expressos no estado pluripotente 1. Estes transitoriamente expressas &quot;fatores de reprogramação epigenética&quot; alterar perfil de expressão de paisagem e gene da célula-alvo análogo ao de células-tronco embrionárias humanas 2. Uma vez criado, iPSCs podem potencialmente ser diferenciadas em qualquer tipo de tecido para posterior investigação. Assim, eles representam uma promessa para o uso em medicina regenerativa, doença de modelagem, e aplicações de terapia génica. No entanto, interrompendo o genoma do vírus com integrando tem o potencial de alterar a expressão do gene endógeno, influencia o fenótipo celular e, finalmente, viés resultados científicos. Além disso, as integrações aleatórias virais pode levar a deletéria e celularffects, incluindo a possibilidade de transformação maligna 3 ou re-expressão dos transgenes oncogénicos 4. Aplicações clínicas futuras exigirá geração iPSC não-integrantes. Epissomas, que são moléculas de DNA circular cromossômicas extra, oferecem uma estratégia para gerar custo efetivo, iPSCs livre de integração 5. A combinação dos vectores epissomais mostrados na Tabela 1 Factores de expressar a reprogramação OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, e LIN28A. O plasmídeo pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F também contém uma p53 shRNA para a supressão temporária de TP53 para melhorar a reprogramação celular 6. A replicação deficiente vetor pCXWB-EBNA1 promove amplificação de fatores de reprogramação e aumento da eficiência de reprogramação, proporcionando um aumento transitório na expressão EBNA1 7. O plasmídeo pCXLE_EGFP pode ser adicionado à mistura nucleofection com a finalidade de determining a eficiência de transfecção ou para aplicações de separação de células. Com a excepção de p-CXWB EBNA1, os plasmídeos epissomais utilizados neste protocolo contêm a origem do vírus de Epstein-Barr de replicação viral e o gene de EBNA 1, que medeiam a replicação e partição do epissoma durante a divisão da célula hospedeira 8. Os epissomas são espontaneamente perdido com expansão sucessiva iPSC 7. A subclonagem e caracterização de iPSCs com perda vector epissomal, que pode ser inferida a partir da perda de expressão eGFP, pode conduzir a integração iPSCs completamente livres para aplicações clínicas futuras. Inerente ao processo de geração iPSC é a supressão de genes específicos de linhagem e reactivação de genes associados à pluripotência. Regulação da expressão gênica ocorre em vários níveis dentro do núcleo, incluindo a modificação de DNA e da cromatina para permitir que fatores de transcrição, elementos de DNA reguladoras e acesso RNA polimerase ao alvogenes. A remodelação da paisagem epigenética através de modificações da cromatina globais é um componente chave para a re-expressão do programa genético pluripotência. Uma modificação da cromatina específico que é importante na regulação da expressão génica é a acetilação das histonas em determinados resíduos de lisina, que permite o acesso aos genes-alvo através da diminuição da tensão da bobina de histona-ADN. Inibidores de HDAC são pequenas moléculas que têm sido mostrados para melhorar iPSC reprogramação e hESC auto-renovação 9,10, provavelmente devido ao apoio do Estado acetilada 11. O protocolo descrito abaixo, adaptado a partir de uma publicação anterior, utilizando os lentivírus integrando 12, proporciona um método passo-a-passo para a geração de iPSC optimizado a partir de sangue periférico utilizando epissomas e inibidores de HDAC. As concentrações de inibidor de HDAC aqui utilizados são metade daqueles descritos por Ware et al. 9, e foram rotineiramente levou a um aumento de 2 vezes na colónias IPSC completamente reprogramadas padrão maisprotocolos de reprogramação epissómicos sem inibidores de HDAC. Este nível de reprogramação está a par com a eficiência que observamos com os métodos de lentivírus. Usando este protocolo, temos gerado de forma eficiente iPSC de indivíduos como velhos como 87 anos de idade.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-001-750</td><td>Armazene a 4 ° C. Aqueça à temperatura ambiente antes de usar.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td>Loja em 4 ° C.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Loja em 4 °C.</td></tr><tr><td>soro fetal bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10437028</td><td>Armazenar a -20 &graus; C até que seja necessário. Descongelar, alíquota, armazenar a 4 ° C.</td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>154938</td><td>Armazenar em temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>QBSF-60 meio sem soro</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-983-234</td><td>Loja em 4 ° C.</td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Store a 4 °C.</td></tr><tr><td>Kit de nucleofector de linha celular V</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td>Armazenar a 4 °C.</td></tr><tr><td>Solução de gelatina a 2%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td>Armazenar a 4 &deg; C, liquefazer em 37 &graus; C banho-maria antes de usar.</td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td>Loja em 4 °C.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td>Loja em 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)</td><td>Life Technologies</td><td>12440-061</td><td>Loja em 4 °C.</td></tr><tr><td>L-glutamina, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Alíquota, congelar a -20 ° C.</td></tr><tr><td>aminoácidos não essenciais (NEAA), 100X</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>Armazene em 4 &deg; C, longe da luz.</td></tr><tr><td>DMEM / Ham's F12, 1: 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30023.02</td><td>Store a 4 ° C.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>Alíquota, congelar a -20 °C.</td></tr><tr><td>piruvato de sódio, 100 mM</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Armazenar a 4 ° C.</td></tr><tr><td>bicarbonato de sódio, 7,5%</td> <td>Life Technologies</td><td>25080094</td><td>Store a 4 ° C.</td></tr><tr><td>fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF)</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0263</td><td>Fazer estoque de 10 mg/ml em DPBS, alíquota, congelar a -20 °C. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.</td></tr><tr><td>butirato de sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887-1G</td><td>Faça 2000x estoque (400 mM) em DPBS, alíquota, congele a -20 °C. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.</td></tr><tr><td>Clonagem de células hES e Suplemento de Recuperação</td><td>Stemgent</td><td>01-0014-500</td><td>Armazene a -20 &deg; C até que seja necessário. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.</td></tr><tr><td>Matriz BD qualificada pela ESC</td><td>BD Biosciences</td><td>35-4277</td><td>Descongele durante a noite no gelo às 4 > C, alíquota em tubos pré-resfriados usando pontas de pipeta pré-resfriadas. Armazene a -20 > C até que seja necessário. Descongele aos 4 graus; C, use imediatamente.</td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>9650</td><td>Alíquota, congelar a -20 ° C.</td></tr><tr><td>ácido ascórbico, em pó</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403-100MG</td><td>Faça 5 mg / ml de estoque em DPBS, filtro estéril, armazene a 4 ° C.</td></tr><tr><td>fator de células-tronco humanas recombinante (SCF)</td><td>R & D Systems</td><td>255-SC-010</td><td>Make 100 &mu; g / m estoque em SFEM, alíquota, congelamento a -20 &deg; C. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.</td></tr><tr><td>interleucina humana recombinante 3 (IL-3)</td><td>R & D Systems</td><td>203-IL-010</td><td>Faça 100 &mu; g/ml de estoque em SFEM, alíquota, congelar a -20 &deg;C. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.</td></tr><tr><td>eritropoietina (EPO)</td><td>R & D Systems</td><td>287-TC-500</td><td>Faça 1000 U/ml de estoque em SFEM, alíquota, congele a -20 °C. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.</td></tr><tr><td>fator de crescimento semelhante à insulina humana recombinante 1 (IGF-1)</td> <td>R & D Systems</td><td>291-G1-200</td><td>Make 100 &mu; g/ml de estoque em SFEM, alíquota, congelar a -20 &deg;C. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td>Faça estoque de 1000x (100 mM) em DPBS.</td></tr><tr><td>dexametasona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902-25MG</td><td>Faça 50x estoque (50 &mu; M) em DPBS, filtro estéril, armazenar a 4 °C.</td></tr><tr><td>SAHA (vorinostat)</td> <td>Cayman Chemical</td><td>149647-78-9</td><td>Faça 2.000x estoque (400 mM) em DPBS, alíquota, congele a -20 °C. Depois de descongelado, armazene a 4 °C.</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 12 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62553002</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Eppendorf de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de tecido de 35 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas descartáveis de 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas descartáveis de 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-22</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas descartáveis de 2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-17</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l pontas de pipeta, pontas de barreira</td><td>Genessee</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>pipetas de vidro Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>auxiliar de pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>pCXLE-EGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>pCXWB-EBNA1</td><td>Addgene</td><td>37624</td><td></td></tr></tbody></table>

eficiente geração células ips a partir de sangue, utilizando epissomas e hdac inibidores

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

Este manuscrito ilustra um protocolo para a criação de células de forma eficiente sem integração humana induzida tronco pluripotentes (iPSCs) do sangue periférico, utilizando plasmídeos epissómicos e inibidores da histona deacetilase (HDAC). As vantagens desta abordagem incluem: (1) o uso de uma quantidade mínima de sangue periférico como fonte de materiais; (2) nonintegrating vetores de reprogramação; (3) um método de custo eficaz para gerar vetores iPSCs livres; (4) uma única transfecção; e (5) a utilização de moléculas pequenas para facilitar a reprogramação epigenética. Resumidamente, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são isoladas a partir de amostras de flebotomia de rotina e, em seguida, cultivadas em factores de crescimento definidos para se obter uma população de células progenitoras de eritrócitos altamente proliferativo que é extremamente passíveis de reprogramação. Nonintegrating, plasmídeos epissómicos não transmissíveis expressando OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, e uma p53 short hairpin (sh) RNA são introduced nos eritroblastos derivados através de um único nucleofection. A cotransfecção de um epissoma que expressa a proteína verde fluorescente melhorada (eGFP) permite a fácil identificação de células transfectadas. Um plasmídeo deficiente na replicação separada expressando de Epstein-Barr antigénio nuclear 1 (EBNA 1), também é adicionado à mistura de reacção para aumento da expressão de proteínas epissomais. As células transfectadas são então plaqueadas sobre uma camada de fibroblastos embrionários de ratinho irradiado (iMEFs) para a reprogramação continua. Assim que colónias-iPSC como aparece a cerca de 12 dias após nucleofection, os inibidores de HDAC são adicionados ao meio para facilitar a remodelação epigenética. Descobrimos que a inclusão de inibidores de HDAC rotineiramente aumenta a geração de colónias de IPSC totalmente reprogramado por 2 vezes. Uma vez colônias IPSC exibem morfologia típica de células-tronco embrionárias humanas (hESC), eles são cuidadosamente transferida para IMEF revestidas de placas individuais de cultura de tecidos para o crescimento contínuo e expansão.

Três dias após nucleofection e antes do plaqueamento das células em nucleofected iMEFs, a eficiência de nucleofection bem sucedida deve ser estimado por microscopia de fluorescência para eGFP. A Figura 1 mostra uma experiência típica nucleofection com aproximadamente 5-10% da população total de células que expressam eGFP. Colónias IPSC reprogramado vão começar a aparecer cerca de duas semanas após nucleofection. As colônias são geralmente circular, com bordas bem definidas e...

Aqui nós descrevemos um protocolo para gerar células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem a partir do sangue periférico usando uma estratégia de reprogramação episome base e inibidores da histona deacetilase.

Eficiente Geração células iPS a partir de sangue, utilizando epissomas e HDAC Inibidores

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar células-tronco pluripotentes induzidas livres de integração a partir de uma pequena quantidade de sangue periférico. Isso é obtido cultivando células mononucleares isoladas do sangue periférico em fatores de crescimento definidos para produzir uma população progenitora de eritrócitos que é muito responsiva à reprogramação. Como segundo passo, plasmídeos epissómicos não integradores que transportam genes de reprogramação são introduzidos nos eritroblastos por afecção do núcleo para iniciar o processo de reprogramação.Em seguida, as células afetadas pelo núcleo são colocadas em uma camada de fibroblastos embrionários de camundongo irradiados para permitir a reprogramação contínua com sucesso. Colônias de células-tronco pluripotentes induzidas reprogramadas podem ser identificadas com base em suas características morfológicas, atividade de fosfatase alcalina, imunoquímica positiva para marcadores de pluripotência e expressão de genes de pluripotência endógena. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a reprogramação baseada em vírus, é que esse protocolo garante a geração consistente de IPSC livre de integraç

efficient-ips-cell-generation-from-blood-using-episomes-hdac

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Gerando pluripotentes induzidas de células-tronco (IPSC) produz linhas de linhas de diferentes potencial de desenvolvimento, mesmo quando eles passam por testes padrão pluripotência. Aqui nós descrevemos um protocolo para produzir ratos derivadas inteiramente de iPSCs, que define as linhas iPSC como possuindo pluripotência...

Geração de camundongos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Aqui, apresentamos o nosso método estabelecido para reprogramar células somáticas humanas em iPSCs humanos sem transgene com o vírus Sendai, que mostra resultado consistente e maior eficiência.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) representam uma fonte de tecidos específicos do paciente para aplicações clínicas e de pesquisa básica. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para reprogramar células humanas mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) obtidos a partir de crostas inflamatórias congelados em iPSCs virais-livre usando não-integração plasmídeos epissomais.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco Congelado Buffy Coats usando não-integração epissomais Plasmids

Propomos um protocolo para reprogramação de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Ao plaquear as células sanguíneas transduzidas em placas revestidas com matriz com centrifugação, as iPSCs são induzidas com sucesso a partir de células flutuantes. Esta técnica sugere um protocolo de reprogramação simples e eficaz para células como PBMCs e CBMCs.

Induzida Geração Stem Cell pluripotentes a partir de células de sangue com o vírus Sendai e centrifugação

Este protocolo descreve um método detalhado para a geração eficiente de iPSCs livres de integração a partir de células sanguíneas periféricas adultas humanas. Com o uso de quatro vetores epissómicos baseados em oriP/EBNA para expressar os fatores de reprogramação, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 e SOX2, milhares de colônias de iPSC podem ser obtidas a partir de 1 mL de sangue periférico.

Geração de Integração-livres induzidas células-tronco pluripotentes a partir de células mononucleares de sangue periférico humano Usando epissï¿½ica Vectors

Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

Este protocolo demonstra a indução de um programa hemogenic em fibroblastos dérmicos humanos pela expressão forçada dos fatores de transcrição GATA2, GFI1B e FOS para gerar células-tronco e progenitoras hematopoiéticas.

Reprogramação hemogénica de fibroblastos humanos pela expressão forçada de fatores de transcrição

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

O caranguejo-ferradura americano, Limulus polyphemus, é sem dúvida a fonte mais conveniente para grandes quantidades de sangue de invertebrados. O sangue é simples na composição, com apenas um tipo celular na circulação geral, o Amebocyte granular, e apenas três proteínas abundante no plasma, hemocianina, as proteínas C-reativa e α2-macroglobulina. O sangue é coletado a partir do coração e as células de sangue e plasma são separados por centrifugação.

Coleta de sangue do caranguejo em ferradura americano, Limulus Polyphemus

Aprenda a gerar células iPS livres de integração a partir de sangue periférico utilizando plasmídeos episomais e inibidores de HDAC. Este método eficiente minimiza riscos de mutagênese insercional para aplicações terapêuticas.

Eficiente Geração células iPS a partir de sangue, utilizando epissomas e HDAC Inibidores

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