Diferenciação de alta eficiência de pluripotentes humanas células-tronco para Cardiomyocytes e Caracterização por citometria de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é gerar culturas de cardiomiócitos de alta qualidade a partir de células-tronco pluripotentes e caracterizar adequadamente o produto final usando citometria de fluxo. Para conseguir isso, são geradas culturas de monocamada de alta qualidade de células-tronco pluripotentes indiferenciadas. A cardiomiogênese é então induzida pela modulação da via do vento usando pequenas moléculas.

Em seguida, os cardiomiócitos são fixados, permeados e corados usando condições especificamente otimizadas para cada anticorpo. Finalmente, as células são analisadas por citometria de fluxo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram culturas altamente positivas para marcadores cardíacos, TNNI três e IRX quatro e demonstram potenciais de ação ventriculares.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como os de funcionários e corpos de tranças, é que ela é relativamente simples de implementar e econômica. Além disso, a técnica gera culturas de células altamente positivas por troponina cardíaca I. Sem a variação subjacente interna e a eficiência observada por outros protocolos, a demonstração visual do método é crítica, pois a qualidade da célula pré-diferenciação afetará significativamente a eficiência da diferenciação. Além disso, a fixação inadequada e permeável antes da coloração com anticorpos levará a resultados de citometria de fluxo abaixo do ideal, demonstrando que o procedimento será Shabo Bachar, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.

O aspecto mais desafiador do procedimento a seguir é manter células-tronco pluripotentes indiferenciadas de alta qualidade antes da diferenciação. O uso de células com características de crescimento abaixo do ideal afetará significativamente a eficiência da diferenciação. Comece este procedimento com HPCs bem estabelecidos cultivados em seis placas revestidas com matriz qualificada HESC.

Verifique as células ao microscópio para garantir que elas exibam uma morfologia homogênea. Se as células exibirem morfologia epitelial neural ou semelhante a fibroblastos, como mostrado aqui, elas não devem ser usadas. Certifique-se de que as células proliferam de forma robusta quando assentadas a 0,75 milhão por poço passá-las aproximadamente a cada três dias a 75%Confluência passa as células com dissociação para o nível de célula única pelo menos cinco vezes antes do início da diferenciação Para passagem.

As células primeiro aspiram o meio de crescimento E oito e lavam as células duas vezes com quatro mililitros de PBS pré-aquecidos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione um mililitro de solução de desprendimento de células à temperatura ambiente a cada poço e deixe o poço intacto até que os limites das células comecem a arredondar. Isso normalmente leva de três a sete minutos e pode ser observado macroscopicamente e confirmado usando um microscópio.

Em seguida, usando uma pipeta de vidro com tamponamento de algodão com um bulbo, as células foram desalojadas e transferidas para um tubo cônico de 15 mililitros contendo um mililitro de meio DM EMF 12. Isso inativará a solução de desprendimento de células. Remova uma alíquota de 10 microlitros da solução celular e misture-a com 10 microlitros de azul trian em um tubo de microcentrífuga.

Conte as células e, em seguida, para coletá-las centrifugue, o tubo cônico de 15 mililitros a 130 GS por cinco minutos. À temperatura ambiente, durante a centrifugação, conte as células usando um hemocitômetro automatizado. Espere 70 a 80% de viabilidade daqui para frente.

Baseie todos os números de células na contagem total de células, em oposição às contagens de células viáveis. Após o spin, aspire o meio e ressuspenda o pellet celular em D-M-E-M-F 12 até uma concentração final de 0,75 vezes 10 para as seis células por 500 microlitros, adicione 0,5 mililitros da suspensão celular a cada poço de uma placa de seis poços em que cada poço contém dois mililitros de meio Eoito. Com o inibidor de rocha, balance suavemente a placa da frente para trás e de um lado para o outro para dispersar uniformemente as células pelo poço.

Retorne as células à incubadora a 5% de dióxido de carbono e 37 graus Celsius. 24 horas após a embalagem. Comece a substituir o meio diariamente usando dois mililitros por poço de E oito sem inibidor de rocha.

Otimize a densidade de semeadura para atingir 100% de confluência antes do início da diferenciação. No dia zero, as células são 100% confluentes com morfologia compacta e detritos celulares mínimos. Comece o processo de diferenciação substituindo o meio E oito por dois mililitros de diferenciação. Média.

Número um, adicione 1,2 microlitros de CHIR a cada um. Bem, nos dias um e dois, é comum observar 40 a 50% de morte celular significativa. No entanto, as células anexadas manterão a morfologia compacta.

Durante esse tempo, o meio torna-se laranja e turvo. Se for observado meio rosa, que indica morte celular excessiva, confirme a viabilidade celular com azul triam e interrompa se a morte celular exceder 70%Caso contrário, no primeiro dia, repita o processo de substituição do meio por dois mililitros de diferenciação fresca. Média. Número um, adicione 1,2 microlitros de CHIR a cada poço e, nos dias dois a três, substitua por meio de diferenciação fresco.

Número um, durante os dias três a quatro, as células se recuperarão e a densidade aumentará no quarto dia. Substitua o meio em cada poço por uma nova diferenciação. Meio número um e um microlitro de IWR um.

Durante os dias cinco a seis, ocorre uma morte celular mínima e manchas densas podem começar a aparecer no dia cinco, substituindo o meio por uma nova diferenciação. Meio número um, e adicione um microlitro de IWR um a cada poço no dia seis a sete, substitua o meio por uma nova diferenciação. Médio número um.

Do sétimo ao oitavo dia, uma monocamada confluente é alcançada com morfologia compacta intercalada com manchas densas. No oitavo dia, as células começarão a se contrair espontaneamente e as primeiras contrações serão frequentemente visíveis nas manchas densas. No oitavo dia, substitua o meio por uma nova diferenciação. Média.

Número dois, continue a substituir pelo meio de diferenciação número dois, a cada dois dias durante a cultura. No dia 10, uma contração mais robusta é observada e continuará a se espalhar por toda a cultura nos dias subsequentes. Este vídeo mostra as células no dia 30 e aqui as células são mostradas no dia 55.

Para coletar células para citometria de fluxo, execute a coleta e contagem de dissociação celular conforme realizado anteriormente. Observe que as células não precisam ser mantidas estéreis neste momento. Enquanto vórtice suavemente o pellet celular, adicione 100 microlitros de solução de fixação ao pellet celular gota a gota.

Em seguida, incube o tubo no gelo por 15 minutos. Adicione três mililitros de solução de lavagem de células, colete as células por centrifugação após a centrifugação, aspire a solução durante o vórtice. Adicione 100 microlitros de solução permeável ao pellet celular gota a gota como antes.

Em seguida, incube o tubo no gelo por 30 minutos. Adicione três mililitros de solução de lavagem celular. Coletar as células por centrifugação e aspirar a solução.

Repita para um total de duas lavagens após a permeação. Realize a coloração de anticorpos conforme descrito no documento que acompanha usando uma pipeta P 1000 a 400 microlitros de solução de manutenção celular para as células e desagregue-as pipetando para cima e para baixo. Em seguida, pré-umedeça uma tampa de filtro de célula em um tubo inferior redondo com 50 microlitros de solução de manutenção de célula.

Coloque o tubo no gelo. A tampa do filtro de células evita que os agregados de células entupam o citômetro de fluxo. Em seguida, transfira a solução celular para a tampa do filtro celular e deixe a suspensão celular drenar por gravidade.

Bata suavemente na parte inferior do tubo na bancada para que as células sejam coletadas em um tubo. Coloque o tubo de volta no gelo o mais rápido possível. Enxágue o filtro com 250 microlitros de solução de manutenção celular para garantir a recuperação máxima das células.

Mantenha as células no gelo e proteja-as da luz até que sejam analisadas por citometria de fluxo para determinar a qualidade dos cardiomiócitos gerados. Usando este protocolo, as células foram diferenciadas por 10 dias e coradas com anticorpos contra TNNI três a, marcador de cardiomiócitos pan, TNNT dois um marcador de músculo estriado e marcador de cardiomiócitos ventriculares IRX quatro A. Observe que a fixação e as condições permeáveis foram otimizadas para cada anticorpo para atingir a porcentagem máxima de células positivas.

Os histogramas mostram que 99% das células fechadas foram positivas para TNNI três e 96% foram positivas para IRX quatro. Além disso, as células foram altamente positivas para outros marcadores de diferenciação cardíaca, incluindo TNNT dois, MLC dois V e MLC dois. Uma nota de que a afirmação sobre a pureza dos cardiomiócitos e a identidade celular é baseada no TNNI três e no IRX quatro.

A coloração MC dois V e MC dois A não são restritas à câmara durante o desenvolvimento e o TNNT dois também é encontrado no músculo esquelético. O potencial de ação mostrado aqui foi registrado a partir de um único cardiomiócito em contração espontânea no dia 46 de diferenciação usando clampeamento de adesivo de células inteiras. O perfil do potencial de ação indica que foram obtidos cardiomiócitos ventriculares.

Uma pequena porcentagem de perfis nodais também foi observada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar culturas de cardiomiócitos de alta qualidade a partir de células-tronco pluripotentes e como caracterizá-las por citometria de fluxo. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido aos desafios comuns encontrados na manutenção das células-tronco como monocamadas de alta qualidade antes do início da diferenciação.

Não se esqueça de que trabalhar com um fixador pode ser perigoso e pessoal. Equipamentos de proteção, como jaleco ou luvas, devem sempre ser usados durante a execução deste procedimento.