Eletrofisiologia do Patch Clamp
As membranas celulares neurônios são povoadas com canais de íons que controlam o movimento da carga dentro e fora da célula, regulando assim o disparo…
A gravação de grampos de correção é uma técnica extremamente útil para investigar as propriedades biofísicas dos canais de íons que controlam a ativação neuronal.
O procedimento envolve pressionar uma micropipette de vidro contra uma célula, a fim de isolar um pequeno "patch" de membrana que contém um ou mais canais de íons.
A configuração experimental permite ainda que os cientistas "apertem" o ambiente elétrico da área remendada controlando precisamente a tensão através da membrana celular, o que, dependendo dos canais de íons presentes, impacta o fluxo de íons através da membrana e permite um estudo intrincado desses canais.
Este vídeo apresenta uma visão geral dos princípios por trás da técnica de grampo de remendo, uma descrição das etapas necessárias para executar um experimento e, finalmente, algumas das aplicações deste método.
Primeiro, vamos rever os princípios por trás da gravação do grampo de remendo.
O número de íons carregados positivas e negativamente dentro de um neurônio difere do número encontrado no exterior.
Esse desequilíbrio produz uma diferença de tensão, ou potencial de membrana, de cerca de -70 mV, o que significa que o interior é mais negativo do que o exterior.
Os canais de íon ajudam a manter o gradiente controlando o movimento dos íons através da membrana celular, que são essencialmente correntes elétricas.
Usando a técnica de grampo de remendo, os cientistas fazem perguntas sobre a natureza do potencial e da corrente.
A plataforma de fixação inclui uma micropipette de vidro, que contém uma solução iônica e um eletrodo de prata clorado para medir tensões e correntes.
A ponta da micropipette tem uma abertura polida, de um míccro que envolve uma pequena área de membrana.
Para eliminar o ruído de fundo dos íons dentro da solução de banho, uma vedação de alta resistência é formada entre a pipeta e o patch de membrana. Como a resistência do selo está na faixa gigaohm, é conhecida como uma vedação gigaohm.
O eletrodo dentro da pipeta é conectado a um amplificador que pode amplificar flutuações de corrente e tensão que são o resultado do movimento dos íons através de canais na membrana plasmática.
Com o amplificador, os cientistas podem fixar ou definir artificialmente o potencial da membrana em tensões específicas.
O amplificador regula a quantidade de corrente que deve ser adicionada através do eletrodo de prata, a fim de manter a tensão constante.
Uma vez que diferentes canais de íons com tensão são abertos em tensões específicas, os eventos de abertura são representados pelas variações nos perfis das correntes medidas.
Alternativamente, os cientistas podem forçar uma corrente específica através do eletrodo e registrar as mudanças resultantes no potencial. Neste "grampo atual" os potenciais de ação de configuração podem ser registrados.
Vamos agora olhar para os cinco principais tipos de configurações de grampo de remendo.
Primeiro é a configuração ligada à célula onde a micropipette é simplesmente selada à membrana de uma célula intacta.
Em segundo lugar está a configuração de células inteiras onde a membrana dentro da micropipette é rompida para fornecer acesso ao interior da célula.
Em terceiro lugar está a configuração de patch perfurado. Aqui, produtos químicos como antibióticos são adicionados ao micropipette para fazer pequenos buracos na membrana que fornecem acesso ao citosol.
A quarta configuração é o patch de dentro para fora. Para isso, a micropipette primeiro forma uma vedação com a célula, depois é puxada para trás rapidamente, arrancando um pedaço da membrana e expondo a superfície interna à solução do banho.
Isso permite que o lado citoplasmônico dos canais seja exposto a diferentes produtos químicos aplicados ao banho.
Por fim, semelhante ao de dentro para fora, o patch externo começa como uma configuração de célula inteira. A micropipette é lentamente retirada até que um pedaço de membrana forma uma vedação convexa através da ponta.
Nesta configuração, a face extracelular do canal pode ser exposta a tratamentos experimentais.
Agora que revisamos os princípios, vamos revisar as etapas necessárias para realizar uma gravação de grampo de remendo.
Comece puxando um tubo de vidro borossilicato em micropipettos usando um puxador de pipeta.
Em seguida, coloque o polimento de fogo na ponta para obter o diâmetro e resistência adequados.
Depois de polir, encha a micropipette com uma solução iônica e gire suavemente para desalojar quaisquer bolhas de ar.
Em seguida, deslize a micropipette sobre o eletrodo ligado a um suporte.
Uma vez anexada, use uma seringa para aplicar pressão positiva na pipeta, o que impede que outras soluções entrem na ponta.
Agora, coloque suas células ou tecido de interesse no estágio do microscópio e mova a micropipette em direção a uma célula.
Com o amplificador gerando pulsos de tensão de teste, registo a resistência, que aumentará quando a ponta estiver tocando a célula.
Para formar o selo gigaohm, mude suavemente de pressão positiva para negativa usando a seringa. A formação do selo resultará em um rápido aumento da resistência a mais de 1 gigaohm.
Agora que uma configuração conectada por células foi estabelecida, vamos converter para uma configuração de células inteiras e fazer um experimento!
Lembre-se que uma configuração de células inteiras é quando a membrana é rompida.
A ruptura é realizada adicionando pressão negativa à micropipette.
Uma vez que a membrana se rompe, a forma de pulso de teste terá grandes transitórios de corrente, já que a membrana celular está agora agindo como um capacitor, que é carregado pelo pulso de teste.
As propriedades de um único tipo de canal de íon em qualquer neurônio pode ser investigada bloqueando a atividade de outros canais tipos farmacologicamente.
Um protocolo de passo de tensão é usado para examinar as correntes do canal de íons evocadas pisando a tensão para uma série de diferentes potenciais de retenção.
A curva corrente-tensão ou IV mostra as dependências de tensão da corrente que flui através de um canal de íons e fornece uma visão sobre quais tensões o canal está aberto ou fechado.
Vamos agora olhar para algumas aplicações para explorar o que os neurocientistas podem fazer com essa técnica.
Às vezes, canais de íons encontrados em neurônios podem ser estudados em um ambiente não celular.
Aqui os cientistas adicionaram proteínas do canal de íons a uma membrana lipídica artificial, a fim de estudar esses canais isoladamente.
Esses canais podem então ser expostos a moléculas experimentais, como a capsaicina derivada da pimenta, para estudar seu impacto na atividade do canal.
Por serem expostos ao ambiente extracelular e impactarem significativamente a função celular, os canais de íons são excelentes alvos de drogas. Quando os compostos de teste são adicionados às soluções de micropipette ou banho, gravações de grampos de remendo podem ser usados para testar diretamente o efeito de drogas, como a nicotina, na atividade neural. O princípio de aplicar pressão negativa para formar um selo de alta resistência tem sido até aplicado para construir dispositivos de alta produção, que podem registrar de inúmeras células simultaneamente para aplicações de triagem de medicamentos.
O grampo de remendo de células inteiras é uma ferramenta valiosa para medir a resposta de células únicas a estímulos.
Além disso, gravações emparelhadas podem ser usadas para investigar o impacto do disparo de neurônios em células alvo excitáveis, como músculos. Neste exemplo, o grampo de remendo de células inteiras é usado para estimular o disparo de um neurônio motor, enquanto as gravações são simultaneamente retiradas da fibra muscular que controla. São observadas relações claras entre excitação neuronal e atividade muscular.
Você acabou de assistir a introdução do JoVE para a gravação de grampos onde os princípios por trás da técnica e passos na execução de um experimento foram revisados.
Com sua requintada sensibilidade temporal às mudanças na tensão e correntes, a gravação do grampo de remendo continuará a ser fundamental na compreensão da biofísica dos canais e neurônios.
Obrigado por assistir!
Iniciar sessão ou para aceder ao conteúdo completo. Saiba mais sobre o acesso da sua instituição ao conteúdo JoVE aqui
A gravação de grampos de correção é uma técnica extremamente útil para investigar as propriedades biofísicas dos canais de íons que controlam a ativação neuronal.
O procedimento envolve pressionar uma micropipette de vidro contra uma célula, a fim de isolar um pequeno "patch" de membrana que contém um ou mais canais de íons.
A configuração experimental permite ainda que os cientistas "apertem" o ambiente elétrico da área remendada controlando precisamente a tensão através da membrana celular, o que, dependendo dos canais de íons presentes, impacta o fluxo de íons através da membrana e permite um estudo intrincado desses canais.
Este vídeo apresenta uma visão geral dos princípios por trás da técnica de grampo de remendo, uma descrição das etapas necessárias para executar um experimento e, finalmente, algumas das aplicações deste método.
Primeiro, vamos rever os princípios por trás da gravação do grampo de remendo.
O número de íons carregados positivas e negativamente dentro de um neurônio difere do número encontrado no exterior.
Esse desequilíbrio produz uma diferença de tensão, ou potencial de membrana, de cerca de -70 mV, o que significa que o interior é mais negativo do que o exterior.
Os canais de íon ajudam a manter o gradiente controlando o movimento dos íons através da membrana celular, que são essencialmente correntes elétricas.
Usando a técnica de grampo de remendo, os cientistas fazem perguntas sobre a natureza do potencial e da corrente.
A plataforma de fixação inclui uma micropipette de vidro, que contém uma solução iônica e um eletrodo de prata clorado para medir tensões e correntes.
A ponta da micropipette tem uma abertura polida, de um míccro que envolve uma pequena área de membrana.
Para eliminar o ruído de fundo dos íons dentro da solução de banho, uma vedação de alta resistência é formada entre a pipeta e o patch de membrana. Como a resistência do selo está na faixa gigaohm, é conhecida como uma vedação gigaohm.
O eletrodo dentro da pipeta é conectado a um amplificador que pode amplificar flutuações de corrente e tensão que são o resultado do movimento dos íons através de canais na membrana plasmática.
Com o amplificador, os cientistas podem fixar ou definir artificialmente o potencial da membrana em tensões específicas.
O amplificador regula a quantidade de corrente que deve ser adicionada através do eletrodo de prata, a fim de manter a tensão constante.
Uma vez que diferentes canais de íons com tensão são abertos em tensões específicas, os eventos de abertura são representados pelas variações nos perfis das correntes medidas.
Alternativamente, os cientistas podem forçar uma corrente específica através do eletrodo e registrar as mudanças resultantes no potencial. Neste "grampo atual" os potenciais de ação de configuração podem ser registrados.
Vamos agora olhar para os cinco principais tipos de configurações de grampo de remendo.
Primeiro é a configuração ligada à célula onde a micropipette é simplesmente selada à membrana de uma célula intacta.
Em segundo lugar está a configuração de células inteiras onde a membrana dentro da micropipette é rompida para fornecer acesso ao interior da célula.
Em terceiro lugar está a configuração de patch perfurado. Aqui, produtos químicos como antibióticos são adicionados ao micropipette para fazer pequenos buracos na membrana que fornecem acesso ao citosol.
A quarta configuração é o patch de dentro para fora. Para isso, a micropipette primeiro forma uma vedação com a célula, depois é puxada para trás rapidamente, arrancando um pedaço da membrana e expondo a superfície interna à solução do banho.
Isso permite que o lado citoplasmônico dos canais seja exposto a diferentes produtos químicos aplicados ao banho.
Por fim, semelhante ao de dentro para fora, o patch externo começa como uma configuração de célula inteira. A micropipette é lentamente retirada até que um pedaço de membrana forma uma vedação convexa através da ponta.
Nesta configuração, a face extracelular do canal pode ser exposta a tratamentos experimentais.
Agora que revisamos os princípios, vamos revisar as etapas necessárias para realizar uma gravação de grampo de remendo.
Comece puxando um tubo de vidro borossilicato em micropipettos usando um puxador de pipeta.
Em seguida, coloque o polimento de fogo na ponta para obter o diâmetro e resistência adequados.
Depois de polir, encha a micropipette com uma solução iônica e gire suavemente para desalojar quaisquer bolhas de ar.
Em seguida, deslize a micropipette sobre o eletrodo ligado a um suporte.
Uma vez anexada, use uma seringa para aplicar pressão positiva na pipeta, o que impede que outras soluções entrem na ponta.
Agora, coloque suas células ou tecido de interesse no estágio do microscópio e mova a micropipette em direção a uma célula.
Com o amplificador gerando pulsos de tensão de teste, registo a resistência, que aumentará quando a ponta estiver tocando a célula.
Para formar o selo gigaohm, mude suavemente de pressão positiva para negativa usando a seringa. A formação do selo resultará em um rápido aumento da resistência a mais de 1 gigaohm.
Agora que uma configuração conectada por células foi estabelecida, vamos converter para uma configuração de células inteiras e fazer um experimento!
Lembre-se que uma configuração de células inteiras é quando a membrana é rompida.
A ruptura é realizada adicionando pressão negativa à micropipette.
Uma vez que a membrana se rompe, a forma de pulso de teste terá grandes transitórios de corrente, já que a membrana celular está agora agindo como um capacitor, que é carregado pelo pulso de teste.
As propriedades de um único tipo de canal de íon em qualquer neurônio pode ser investigada bloqueando a atividade de outros canais tipos farmacologicamente.
Um protocolo de passo de tensão é usado para examinar as correntes do canal de íons evocadas pisando a tensão para uma série de diferentes potenciais de retenção.
A curva corrente-tensão ou IV mostra as dependências de tensão da corrente que flui através de um canal de íons e fornece uma visão sobre quais tensões o canal está aberto ou fechado.
Vamos agora olhar para algumas aplicações para explorar o que os neurocientistas podem fazer com essa técnica.
Às vezes, canais de íons encontrados em neurônios podem ser estudados em um ambiente não celular.
Aqui os cientistas adicionaram proteínas do canal de íons a uma membrana lipídica artificial, a fim de estudar esses canais isoladamente.
Esses canais podem então ser expostos a moléculas experimentais, como a capsaicina derivada da pimenta, para estudar seu impacto na atividade do canal.
Por serem expostos ao ambiente extracelular e impactarem significativamente a função celular, os canais de íons são excelentes alvos de drogas. Quando os compostos de teste são adicionados às soluções de micropipette ou banho, gravações de grampos de remendo podem ser usados para testar diretamente o efeito de drogas, como a nicotina, na atividade neural. O princípio de aplicar pressão negativa para formar um selo de alta resistência tem sido até aplicado para construir dispositivos de alta produção, que podem registrar de inúmeras células simultaneamente para aplicações de triagem de medicamentos.
O grampo de remendo de células inteiras é uma ferramenta valiosa para medir a resposta de células únicas a estímulos.
Além disso, gravações emparelhadas podem ser usadas para investigar o impacto do disparo de neurônios em células alvo excitáveis, como músculos. Neste exemplo, o grampo de remendo de células inteiras é usado para estimular o disparo de um neurônio motor, enquanto as gravações são simultaneamente retiradas da fibra muscular que controla. São observadas relações claras entre excitação neuronal e atividade muscular.
Você acabou de assistir a introdução do JoVE para a gravação de grampos onde os princípios por trás da técnica e passos na execução de um experimento foram revisados.
Com sua requintada sensibilidade temporal às mudanças na tensão e correntes, a gravação do grampo de remendo continuará a ser fundamental na compreensão da biofísica dos canais e neurônios.
Obrigado por assistir!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the basic principle behind patch clamp recording?
Patch clamp recording isolates a small membrane patch containing ion channels by pressing a glass micropipette against a cell and forming a high-resistance seal. Scientists then use an electrode to clamp or control the electrical environment of the patched area, allowing precise measurement of how voltage changes affect ion flow through channels. This technique reveals the biophysical properties of ion channels that regulate neuronal activation.
Q2: How does a gigaohm seal form in patch clamp experiments?
A gigaohm seal forms when negative pressure is applied through a syringe to the micropipette, creating a high-resistance seal between the pipette tip and the cell membrane. The resistance increases rapidly to greater than 1 gigaohm, effectively isolating the membrane patch from background noise in the bath solution. This seal is critical for detecting small electrical currents from individual ion channels.
Q3: What are the main differences between whole-cell and cell-attached patch configurations?
In cell-attached configuration, the micropipette simply seals to an intact cell membrane, allowing study of channels in their native state. Whole-cell configuration ruptures the membrane within the micropipette to access the cell's interior, enabling measurement of total cellular currents. Whole-cell recording provides broader access to intracellular mechanisms and is commonly used for voltage-step protocols and current-voltage curve generation.
Q4: How does inside-out patch configuration expose the cytoplasmic side of ion channels?
Inside-out patch begins with a cell-attached seal, then the micropipette is pulled back quickly, ripping a piece of membrane away from the cell. This exposes the cytoplasmic surface of the channels to the bath solution, allowing researchers to apply experimental chemicals directly to the intracellular face of ion channels. This configuration is valuable for studying how cytoplasmic factors regulate channel activity.
Q5: What does a current-voltage curve reveal about ion channel function?
A current-voltage (IV) curve shows the voltage-dependence of current flowing through an ion channel, revealing at which voltages the channel opens or closes. Generated using a voltage-step protocol that steps the membrane potential through a series of different holding potentials, the IV curve provides insight into channel kinetics and selectivity. This data is essential for understanding how voltage-gated ion channels control neuronal excitability.
Q6: How is patch clamp recording used for drug screening and testing?
Test compounds can be added to the micropipette or bath solutions during patch clamp recording to directly measure drug effects on neural activity. For example, nicotine or other neuroactive compounds are applied while recording channel currents, revealing how drugs alter ion channel function. High-throughput devices based on the gigaohm seal principle now enable simultaneous recording from numerous cells for rapid drug screening applications.
Q7: What can paired whole-cell patch clamp recordings demonstrate about neuron-muscle interactions?
Paired recordings simultaneously stimulate firing of a motor neuron while recording responses from the muscle fiber it controls, revealing direct relationships between neuronal excitation and muscle activity. This approach, using primary neuronal cultures and electrophysiology techniques, demonstrates how action potentials in neurons translate into functional responses in target cells. Such experiments are crucial for understanding synaptic transmission and neuromuscular function.