Name: Isolando e com cortes de bovinos artéria e veia mesentérica como Bioassay teste para vasoactividade no intestino delgado (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a isolar artérias e veias mesentéricas bovinas para avaliar a vasoatividade de compostos experimentais. Este bioensaio permite estudar o fluxo sanguíneo intestinal e identificar potenciais aplicações terapêuticas em saúde gastrointestinal.

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Os autores reconhecem Ryan Chaplin e Dr. Gregg Rentfrow da Universidade de Kentucky Meats Lab e do Departamento de Animal e Ciências da Alimentação de proporcionar oportunidades para coletar tecidos experimentais aqui utilizados.

Os procedimentos utilizados neste estudo não necessitam de aprovação da Universidade de Kentucky Animal Care e do Comitê Use porque há animais vivos foram usados. Antes da coleta de uma amostra aqui utilizada, todos os animais foram atordoados com um parafuso prisioneiro e sangrar. Este foi realizado em um abatedouro inspecionado pelo governo federal, da Universidade de Kentucky. Um representante oficial do USDA Food Safety Inspection Service e observado todas as atividades que lidavam com o animal vivo e manuseio da carcaça. 1 Preparação de Instrumentação <ol><li> Para minimizar a quantidade de tempo entre as colheitas das amostras de tecido para o início de uma experiência, montaram equipamentos e preparar tampões antes da recolha de tecidos experimental (ou, se o pessoal adicionais estão disponíveis, estas tarefas podem ocorrer simultaneamente). NOTA: Isto não só fornece a maior quantidade de tempo que o tecido permanece viável a realização de experiências, mas algunsexperimentos podem funcionar por longos períodos de tempo (ou há um desejo de completar várias experiências em um dia), portanto, é geralmente desejável para começar o mais cedo possível. </li><li> Ligue o computador associado, aquisições de dados de equipamentos, banho de água (para tampão (s)) e myograph unidade (s). Coloque o equipamento de calibração na unidade (s) myograph e ligue calor myograph (predefinido para 37,5 ° C) e deixe as unidades e equipamentos de calibração para aquecer para programar temperaturas. <ol><li> Abra um arquivo de configurações de software Chart previamente criado no computador e começar a correr (mas não a aquisição de dados). </li></ol></li><li> Aqueça o equipamento durante 10 minutos. <ol><li> Comece a aquisição de dados. </li><li> Zero todos os canais. </li><li> Verifique, e realizar a calibração (se necessário) em cada canal (4 canais por multimyograph) para padronizar o sinal elétrico fornecido a partir do transdutor de força respectivo associado a esse canal para uma força de 2 g fornecido por um peso certificado. </li><li> Após a calibração e uma conversão de unidades sejam concluídas, armazenar todos os dados subsequentes como gramas. Mudar de acordo com base em desejos de cada laboratório separado; o equipamento e software de permitir a utilização de outras unidades, tais como milinewtons e volts. </li></ol></li><li> Certifique-se de que as linhas de gás são livre de bloqueios e ligue fornecimento de gás (95% de O2 / 5% CO 2) para myograph (s) unidades. Continuamente gás Os tampões (nas câmaras myograph) durante todo o procedimento. </li><li> Preencha todas as câmaras myograph com etanol 70% e deixe de molho por 10 minutos, remover o etanol, e repita para uma segunda 10 min de molho. <ol><li> Após a remoção do etanol, enxaguar três vezes com água desionizada, seguido por três lavagens com tampão preparado (ver secção 2 para a preparação de tampão), deixando a terceira adição de tampão nas câmaras. NOTA: Neste ponto, o equipamento pode permanecer ociosa nesse estado até tampão e tecido são preparados e equipe está pronta para prosseguir com os experiment. </li></ol></li></ol> 2 Preparação de Buffers <ol><li> Prepara-se uma solução tampão de 1 L de solução de Krebs-Henseleit para o uso no transporte e processamento de amostras de tecidos, para atingir concentrações finais de 11,1 mM de D-glicose; 1,2 mM MgSO4; 1,2 mM de KH 2 PO 4; KCl 4,7 mM; NaCl 118,1 mM; 3,4 mM CaCl2; 24,9 mM de NaHCO 3. <ol><li> Misture 9,6 g de sais de Krebs em aproximadamente 900 ml de água desionizada sobre uma placa de agitação. </li><li> Misturar 0,373 g de cloreto de cálcio di-hidratado, seguido por bicarbonato de sódio a 2,1 g por L de solução tampão pretendida. </li><li> Solução tampão de gás durante 20 minutos com 95% O2 / 5% de CO 2. </li><li> Depois de gaseamento, ajustar o pH para 7,05 (filtração de tampão aumenta o pH; pH meta final deve ser 7,4) e ajustar o volume a 1 L. </li><li> Filtrar esterilizar tampão para um tampão de armazenamento de garrafas e limpo autoclavado 1 L mídia a 4 ° C até que esteja pronto para uso. </li></ol></li><li> Prepare separada de Krebs-Hsolução tampão enseleit para utilização em experiências myograph como descrito no passo 2.1 para o transporte de tampão de Krebs-Henseleit com compostos adicionais que se referem às experiências de contractilidade. NOTA: 2 L Tipicamente será suficiente para experiências descritas neste artigo, mas este volume pode necessitar de ser aumentada ou reduzida com base na duração da experiência, o número de câmaras myograph, e substituições de tampão (em relação ao número de adições de tratamento). <ol><li> Antes do passo de gaseificação (passo 2.1.3), adicionar 9,1 mg (por L de solução tampão a ser preparado) da desipramina-HCl para tamponar. </li><li> Prepara-se uma solução de propranolol-HCl 1,0 uM e adicionar 1 ml (por L de solução tampão a ser preparado) desta solução para a solução tampão de Krebs-Henseleit. Faça este tampão no dia da utilização e mantenha a temperaturas myograph operando (uma temperatura que produz uma temperatura de 37,5 ° C no myograph). NOTA: A desipramina é adicionado para inibir os mecanismos selectivos da recaptação de aminas biogênicase permitir a compensação de acréscimos experimentais do buffer que banham os vasos sanguíneos a ocorrer mais rapidamente. A adição de propranolol impede a ligação não específica de compostos de tratamento para β-adrenérgicos. </li></ol></li></ol> 3 Coleta e Preparação da vasculatura <ol><li> Tão rapidamente quanto possível, remover o tracto gastrointestinal a partir da carcaça. Uma vez que o animal não apresenta qualquer reflexo involuntário, retire a cabeça e esconder e, em seguida, levantar a carcaça verticalmente. A remoção das vísceras gastrointestinal (esôfago até o ânus) na carcaça deve ser concluído até o pessoal de matadouros aprovados (&lt;20 min de tempo de atordoamento). NOTA: Em quanto tempo, é geralmente limitada pela localização / instalação onde o trato intestinal está sendo coletado e de procedimentos operacionais padrão ou procedimentos mandato federal seguidos pelos funcionários do local. <ol><li> Na maioria das instalações, realizar manipulações do tracto gastrintestinal, num local distinto do tratamento da carcaça que está destinado a entrar na cadeia alimentar. Use uma localização próxima conveniente, onde o trato gastrointestinal podem ser tomadas e espalhar-se para o exame. </li></ol></li><li> Uma vez que o tracto gastrointestinal é espalhado, identificar o intestino delgado, a dobra de ligação ileocecal do intestino delgado ao ceco, e estendendo-se o flange do íleo proximal à prega ileocecal (Figura 1A). <ol><li> Usando um bisturi ou uma faca, muito levemente fazer uma incisão na membrana mesentérica no centro da flange ileal. Usando dois dedos indicadores, sem rodeios dissecar longe do tecido adiposo e conjuntivo expondo a vasculatura mesentérica (Figura 1B). </li></ol></li><li> Deste flange ou protuberância no mesentério intestinal, dissecar vários ramos (~ 2 cm de comprimento) dos feixes de artéria e veia mesentérica expostos que suportam esta parte do íleo (Figura 1C). <ol><li> Se ucantar uma pinça para agarrar tecido, tome cuidado para não captar diretamente ou puxe os vasos sanguíneos em tudo, removendo-os como qualquer tipo de alongamento pode causar danos e afetar negativamente o desempenho do tecido 14. Remoção do vaso sanguíneo é melhor realizado, por corte ao longo de cada extremidade da secção a ser removida e, em seguida, o corte ao longo ou paralelamente à secção agora isolado. Para maior facilidade, remova uma parte do tecido circundante, juntamente com os vasos para fornecer algum tecido para agarrar com um par de fórceps. </li><li> Com um par de fórceps, submergir amostra de tecido num tubo contendo tampão frio de Krebs-Henseleit gelada e armazenar em gelo até que o tratamento pode ocorrer no laboratório. </li></ol></li><li> Colocar a amostra de tecido sobre uma superfície de corte ou de uma placa de petri e submergir parcialmente em gelo frio de Krebs-Henseleit. <ol><li> Usando # 5 joalheiros fórceps, Noyes íris tesoura e ampliação lâmpada ou dissecar escopo (2,5 a ampliação 5.0X é suficiente), dissecar cuidadosamente afastado o connecti gordura e envolventeve tecidos e separar a artéria e veia. Identificando a abertura vaso em uma extremidade da secção e cuidadosamente compreender a fáscia em torno do vaso, com a pinça. </li><li> Fazer um corte com a tesoura paralela ao recipiente fazendo deslizar a ponta da tesoura por baixo da fáscia levantada. Após a incisão inicial, a gordura e os tecidos conjuntivos podem ser ainda isolada a partir do recipiente através da redução com um ou outro lado da tesoura. Certifique-se de que os vasos são tão limpas quanto possível, minimizando a quantidade de tempo que os navios passam no banco. </li><li> Voltar vasos sanguíneos para tubos de tampão Krebs-Henseleit fresco e armazenar a 4 ° C (amostras podem permanecer armazenadas por até 24 horas após a coleta e ainda produzir dados de contratilidade válidos). </li><li> Usando uma lâmina de barbear, vaso fatia a ser utilizado em myograph em número desejado de secções de 2 mm (isto é útil para usar um fatiador de tecidos para se obter secções transversais consistentes). </li><li> Examine cada seção em uma sco de dissecaçãope (ampliação 12,5X) para garantir que cada seção tem nenhuma anormalidade, ramos, válvulas ou dano superficial, inadvertidamente, feito durante a dissecção e limpeza. Substituir seção do navio, se houver qualquer anormalidade, filial, válvula, ou dano superficial. </li></ol></li><li> Armazenar aceitáveis ​​secções cortadas dos vasos submersos (em tampão de Krebs-Henseleit) em gelo ou a 4 ° C até pronto para montagem em câmaras myograph (geralmente &lt;30 minutos). </li><li> Suavemente montar o recipiente na myograph inserindo os suportes através do lúmen e aumentar a tensão (usando o microposicionador na myograph) tendo o cuidado de não esticar os navios acima de uma leitura de 2 a 3 g. </li><li> Uma vez que todas as câmaras são cobertos, aspirar o tampão de todas as câmaras e reabastecer com 5,0 ml de tampão e iniciar um temporizador de 15 minutos para começar o período de equilíbrio e experiência. </li></ol> 4. Experiment <ol><li> Equilibrar todas as seções da embarcação durante 1,5 horas para conseguir uma res estáveisting tensão de 1,0 g. <ol><li> Substituir o tampão de incubação Krebs-Henseleit a cada 15 min. </li><li> Durante o equilíbrio, ajustar constantemente a tensão nas seções dos vasos sanguíneos até 2 g e deixa-se relaxar para baixo para cerca de 0,80 g. Tente não permitir que os navios para relaxar demais (eles podem escorregar as montagens). Tente alcançar um linha de base estável da tensão, quando o recipiente contém 1 g de tensão sem a necessidade de ajustamento. </li></ol></li><li> Durante o equilíbrio, preparar uma solução aquosa 1,32 M de KCl para ser utilizado como uma referência. </li><li> Após a conclusão de um equilíbrio satisfatório, adicionar 500 mL de solução 1,32 M de KCl para se obter uma solução 0,12 M em 5,5 ml da solução que banha o navio. <ol><li> Após a adição de 1,32 M de KCl, não ajustar manualmente a tensão como a resposta máxima a partir desta adição é usada para avaliar a viabilidade do tecido e pode ser usado para normalizar os dados de tratamento (por exemplo, respostas a uma concentração de umgonist). </li><li> Substituir o tampão em 15 minutos de intervalo até que a tensão voltou ao valor inicial de 1,0 g. </li></ol></li><li> Depois da linha de base é atingido, mudar o tampão e, simultaneamente, iniciar um temporizador de um minuto. Faça isso para todas as câmaras em simultâneo para evitar um escalonamento de horários de início. <ol><li> Vortex o padrão a ser adicionado e preparar um comentário a câmara 1 durante a 1 min de contagem regressiva. </li><li> Adicionar as normas em 25 mL alíquotas de cada uma das câmaras, como os ditames experimentais (isto mantém o tratamento abaixo de 0,5% do volume total). </li><li> Quando foi adicionado o último padrão, comece a 9 min timer. </li><li> No final da incubação de 9 min padrão, remover o tampão contendo o tratamento das câmaras e adicionar 5,0 ml de tampão fresco, e iniciar o temporizador de 2,5 min. </li><li> Repita o passo 4.4.4. </li><li> No final da segunda lavagem 2.5 min, as câmaras de vácuo e adicionar tampão fresco, e inicia um temporizador de um minuto a contagem regressiva do início da Second adição de padrão. </li></ol></li><li> Continuar este ciclo para todos adições padrão do dia. </li><li> Durante a adição de padrão final e posterior 9 min de incubação preparar o composto de referência 1,32 M KCl para o fim da adição de dose de referência prazo de 500 mL. </li><li> Após o intervalo de 1 min após a adição de tratamento final, adicione o KCl e começar a 9 min timer. NOTA: A adição de KCl é confirmar a viabilidade do tecido na conclusão do experimento e é útil se a administração de um tratamento que resulta em resposta insignificante. </li><li> Ao final da incubação composto referência final 9 min, aspirar ou remover o tampão de todas as câmaras. Não adicione uma solução tampão nova. Concluir o experimento. </li><li> Salvar arquivo gráfico, remover seções dos vasos sanguíneos, e descartar adequadamente e siga o protocolo de limpeza (fornecido pelo fabricante e pode ser específico de laboratório) para equipamentos myograph. </li></ol>

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Menção do nome comercial, produto patenteado, ou equipamento especificado, não constitui uma garantia ou garantia pelo USDA e não implica a aprovação para a exclusão de outros produtos que podem estar disponíveis.

O desafio inicial no desenvolvimento deste bioensaio foi a criação de um local de coleta repetível para a vasculatura mesentérica. Consistência sítio da amostra é crítico, como algumas das funções do intestino pequeno, a mudança durante a progressão através do jejuno e do íleo, por conseguinte, o mesentério variar segundo um padrão semelhante. Os ramos ileais da artéria mesentérica e veia foram os mais facilmente identificados através de marcos anatômicos. Ao localizar o ceco e seguindo a dobra ileocecal a seu término n...

Alterações no fluxo sanguíneo para uma cama de tecido pode ter um grande impacto sobre a função do órgão. Uma função primária do intestino delgado é a absorção de nutrientes. O fluxo de sangue arterial para a superfície de absorção do intestino é necessária para a absorção de nutrientes e aumentar o fluxo sanguíneo para ajudar a absorção de nutrientes como digesta se move ao longo da superfície 1. A diminuição do fluxo de sangue pode causar uma redução na absorção de nutrientes devido a uma diminuição do gradiente transepitelial 2. Em adição aos nutrientes, o intestino delgado, podem também ser expostos a metabolitos secundários, drogas, toxinas ou que exercem um efeito sobre o fluxo sanguíneo localizado no mesentério. No caso de o animal ruminante, os compostos podem ser libertados a partir de um ingrediente alimentar (por exemplo, nutrientes, tais como aminoácidos, ou toxinas, tais como os alcalóides da cravagem do centeio) por meio de processos de fermentação do intestino anterior. Se estes compostos sobreviver ao metabolismo microbiano de fermentação ruminal, eles estão agora disponíveis para a absorçãoou interacção enquanto viajam através do tracto gastrointestinal do animal. Há um número de métodos diferentes disponíveis para medir o fluxo de sangue, in vivo (por exemplo, ultra-som Doppler, residindo medidores de fluxo de sangue, microesferas radiomarcados, e técnicas de diluição-indicador) que permitem a avaliação de vários cenários ou tratamentos experimentais. No entanto, para obter informações sobre as propriedades mecânicas ou farmacológicas do músculo liso vascular, métodos permaneceu limitado a navios de grande porte até Mulvany e Halpern 3 publicou um artigo descrevendo uma técnica usando o fio montado preparações anel vascular em um myograph. Desde o desenvolvimento da técnica, modificações continuam a ser feitos para os sistemas myograph associados que permitem uma variedade de aplicações diferentes, para avaliação de estruturas tubulares. O sistema também foi adaptado para utilizar hastes fixas para montagem de navios de maior porte 4, onde a perfusãotécnicas não são desejados. Por causa de diferenças nos vasos de diferentes origens anatômicas e distinções nas mesmas embarcações de diferentes espécies de animais, dados da embarcação e tipo de animais não podem ser facilmente extrapolados em diferentes recipientes ou na mesma embarcação em diferentes tipos de animais 5. Consequentemente, bioensaios separadas devem ser desenvolvidos e validados a qualquer momento estes aspectos são alterados. Recentemente, vários bioensaios foram realizados com estas tecnologias para uso em bovinos laterais da veia safena e artéria e veia ruminal 6,7. Este bioensaio foi desenvolvido especificamente para investigar os efeitos de que alcalóides da cravagem do centeio tem na vasculatura de suporte do intestino delgado. Foi relatado que 50-60% dos alcalóides alimentados aparecem no abomaso conteúdo, mas apenas 5% são recuperadas nas fezes 8. Strickland et al. 9 afirmou em uma revisão de alcalóides da cravagem do centeio, que sugg dados disponíveisest que o intestino delgado pode ser o local mais importante para a absorção ergopeptine. Eckert et al. 10 aspectos biofarmacêuticos avaliação de alcalóides da cravagem do centeio e afirmou que, assim que atravessar a barreira epitelial, alcalóides da cravagem do centeio, são transportados pelo sistema linfático para a veia subclávia ou via veia mesentérica e em sangue portal. Rhodes et al. 11 relataram uma diminuição do fluxo sanguíneo para duodeno e cólon em novilhos consumindo uma (alta alcalóide da cravagem do centeio) dieta rica infectadas pelo endófito. Usando o bioensaio artéria e veia ruminal direita, 12 Foote et al. Demonstraram que alcalóides da cravagem do centeio são vasoativas na vasculatura ruminal. Foote et al. 13 subsequentemente demonstrado in vivo de que a exposição do rúmen de alcalóides da cravagem do centeio resulta em uma diminuição do fluxo de sangue no rúmen epitelial. Esta diminuição no fluxo do sangue para a superfície de absorção do rúmen concomitante causou uma redução de nutrientes (ácido gordo volátil) de fluxo. Dada a quantity de alcalóides da cravagem do centeio que passam para o intestino delgado do intestino anterior; foi formulada a hipótese de que um efeito semelhante na vasculatura do intestino delgado e a absorção de nutrientes ocorreria. Isto exigiu o desenvolvimento do bioensaio artéria mesentérica e na veia do íleo proximal bovina.

<table><tbody><tr><td>Multi Myograph</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>610M</td><td>Um miógrafo é crítico para este bioensaio, mas existem outras plataformas disponíveis para uso que serão suficientes.&nbsp;</td></tr><tr><td>Powerlab 8/sp</td><td>ADIntruments</td><td>ML785</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 7</td><td>ADInstruments</td><td>Versão 7</td><td></td></tr><tr><td>Kit de calibração de força</td><td>Dinamarquesa Myo Technologies</td><td>100055</td><td>Específico para miógrafos DMT</td></tr><tr><td>Filtro de topo de garrafa</td><td>Nalgene</td><td>595-4520</td><td>0.22 &#956; tamanho dos poros m; Tamanho do pescoço de 45 mm #</td></tr> <tr><td>5 Jewler ' s Fórceps</td><td>Miltex</td><td>555008FT</td><td>Qualquer marca de fórceps pode ser usada</td></tr><tr><td>Noyes Iris Scissors</td><td></td><td>Miltex 18-1510</td><td>Qualquer marca de tesoura pode ser usada</td></tr><tr><td>Escopo de dissecação</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Qualquer marca de microscópio de luz dissecante será suficiente</td></tr><tr><td>Tecido Ajustável Matrice</td><td>Braintree Scientific</td><td>TM C12</td><td>Isso não é crítico para o ensaio, mas reduz muito a variação de comprimento de seção para seção e acelera muito o processo de fatiamento</td></tr><tr><td>Krebs-Hensleit Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3753-10x1L</td><td>Não é necessário comprar Krebs, isso pode ser feito em casa</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio desidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Desipramina-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3900-5G</td><td></td></tr><tr><td>Propranolol-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0884-1G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>95% O2/5% CO2</td><td>Scott Bruto</td><td>UN3156</td><td></td></tr></tbody></table>

isolando e com cortes de bovinos artéria e veia mesentérica como bioassay teste para vasoactividade no intestino delgado

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Sistemas gastrointestinal de mamíferos são constantemente expostos a compostos (desejáveis ​​e indesejáveis) que podem ter um efeito sobre o fluxo de sangue para ea partir desse sistema. Alterações do fluxo sanguíneo para o intestino delgado podem resultar em efeitos nas funções de absorção do órgão. Interesse particular em toxinas liberadas a partir de alimentos através de processos fermentativos e digestivos desenvolveu em ruminantes como uma área onde a eficiência produtiva pode ser melhorada. O vídeo associado a este artigo descreve um ensaio biológico in vitro desenvolvido para compostos de tela para vasoactividade em isolados secções transversais da artéria mesentérica bovina e veia utilizando um multimyograph. Uma vez que os vasos sanguíneos são montados e equilibrada no myograph, o próprio bioensaio pode ser usado: como ferramenta de triagem para avaliar a resposta contrátil ou vasoactividade de compostos de interesse; determinar a presença de tipos de receptores por receptores farmacologicamente alvo com agonista específicos; determinar o papel de um receptor com a presença de um ou mais antagonistas; ou determinar interações potenciais de compostos de interesse com antagonistas. Através de tudo isso, os dados são recolhidos em tempo real, de tecido recolhida a partir de um único animal pode ser exposto a um grande número de diferentes tratamentos experimentais (uma vantagem in vitro), e representa a vasculatura de cada lado do leito capilar para fornecer uma exacta imagem do que poderia estar acontecendo no aferentes e eferentes fornecimento de sangue apoiando o intestino delgado.

Os vasos sanguíneos utilizados para gerar os resultados incluídos foram coletadas de seis novilhos da raça Holandesa (425 ± 8 kg), com intervalo de três semanas. Um exemplo típico de um mesentérica resposta contráctil da veia ao KCl e adições crescentes na concentração de tratamento está apresentado na Figura 2. A magnitude da resposta pode variar um pouco com o tamanho do recipiente (correlacionado com o tamanho do animal dador), mas pode também ser influenciadas (negativamente) pelo manuseio inadequad...

O intestino delgado é freqüentemente expostos a toxinas que podem influenciar o fluxo sanguíneo e impactar negativamente a absorção de nutrientes. Usando uma artéria mesentérica e multimyograph e veia isolados, os compostos de interesse ou toxinas podem ser rastreados para a vasoactividade.

Isolando e com cortes de bovinos artéria e veia mesentérica como Bioassay teste para vasoactividade no intestino delgado

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar seções transversais de artérias e veias mesentéricas bovinas em um gráfico multim para permitir a triagem de compostos experimentais quanto à sua atividade vaso. Isso é feito coletando primeiro uma amostra de tecido mesentérico do animal. Na segunda etapa, a amostra é limpa e os vasos são seccionados.Em seguida, as seções são montadas e equilibradas no mioenxerto. Na etapa final, os vasos isolados são expostos aos compostos de interesse. Em última análise, este bioensaio de artéria e veia pode ser usado para avaliar a atividade vaso dos compostos e os efeitos que eles têm no fluxo sanguíneo dentro dos vasos sanguíneos mesentéricos bovinos.A principal vantagem dessa técnica em comparação com os métodos existentes, como medir o fluxo sanguíneo in vivo, é que, com essa técnica, o tecido de um único animal pode ser exposto a vários compostos simultaneamente. Embora este método possa fornecer informações sobre síndromes animais muito específicas que podem causar vasoconstrição, como festuca, toxicose ou ergotismo, ele também pode ser aplicado a outros cenários que podem ser de interesse para os pesquisadores, como produtos farmacêuticos que estão sendo desenvolvidos ou produtos naturais. Além disso, também pode ser aplicado não apenas à vasculatura do gado, mas também à vasculatura de qualquer outra espécie de mamífero.Depois de remover os vasos sanguíneos do tecido mesentérico, use uma pinça para colocar a amostra de tecido em uma superfície de corte e mergulhe-a parcialmente em tampão aite de galinhas henzel crebs geladas. Em seguida, usando joalheiros número cinco, fórceps e ruído, a tesoura Iris disseca cuidadosamente a gordura e os tecidos conjuntivos ao redor dos vasos. Depois de separar a artéria e a veia, identifique a abertura do vaso em uma extremidade da seção e segure cuidadosamente a fáscia ao redor do vaso com a pinça.Em seguida, deslize a ponta da tesoura por baixo da fáscia elevada para fazer um corte com a tesoura paralela ao vaso. Após a incisão inicial, corte os dois lados do vaso para separar ainda mais a gordura e os tecidos conjuntivos e limpar o vaso. Coloque os vasos sanguíneos limpos em um tubo novo de tampão leve Krebs Henzel e armazene o tubo a quatro graus Celsius por até 24 horas.Quando estiver pronto, use um cortador de tecido para obter seções transversais consistentes do vaso de interesse no número desejado de seções de dois milímetros e, em seguida, examine cada seção com uma ampliação de 12,5 x para garantir que cada amostra não tenha anormalidades, ramificações, válvulas ou danos superficiais adquiridos durante o processo de dissecção e limpeza. Armazene as seções aceitáveis do recipiente fatiado submersas em tampão de luz Krebs Henzel a quatro graus Celsius por até 30 minutos. Em seguida, insira suavemente os suportes através do lúmen de cada amostra e use o micro posicionador no mioenxerto para aumentar gradualmente a tensão para montar o vaso no mioenxerto.Tomando cuidado para não esticar os vasos acima de uma leitura de dois a três gramas. Quando todas as câmaras estiverem cobertas, aspire o tampão de cada câmara e encha-as novamente com cinco mililitros de tampão novo. Depois que todas as seções do vaso se equilibraram por 1,5 horas para atingir uma tensão de repouso estável de um grama a 500 microlitros de cloreto de potássio 1,32 molar até uma concentração final de 0,12 molar para a solução de 5,5 mililitros, banhando o vaso.Não ajuste a tensão manualmente, pois a resposta máxima ao cloreto de potássio será usada para normalizar os dados do tratamento, substitua a solução por tampão leve Krebs Henzel fresco em intervalos de 15 minutos até que a tensão retorne ao valor basal de um grama. Uma vez que a tensão tenha retornado à linha de base, adicione os padrões em alíquotas de 25 microlitros a cada câmara de acordo com o protocolo experimental. Quando o último padrão for adicionado, inicie um cronômetro de nove minutos.No final da incubação, remova o tratamento contendo tampão das câmaras e adicione cinco mililitros de tampão fresco a cada câmara. Em seguida, inicie um cronômetro de 2,5 minutos após a conclusão, repita este enxágue de 2,5 minutos. Uma segunda vez no final do segundo enxágue, aspire as câmaras.Então, depois de adicionar um novo buffer mais uma vez, inicie um cronômetro de um minuto para fazer a contagem regressiva para o início da segunda edição padrão. Como observado nos períodos de incubação de nove minutos ilustrados aqui, há aumentos incrementais na resposta aos padrões que, com o aumento das concentrações do tratamento, a adição de cloreto de potássio na conclusão do experimento é essencial, pois confirma a viabilidade do tecido. Este bioensaio pode ser usado para avaliar a atividade vaso dos compostos experimentais nos vasos sanguíneos que fornecem nutrientes ao intestino delgado, bem como nos vasos sanguíneos que transportam os nutrientes absorvidos.Por exemplo, neste experimento, não foi observada diferença nas respostas contráteis arteriais ou venosas após o tratamento com cinco hidroxitriptaminas. Por outro lado, a resposta contrátil da veia mesentérica ao aumento das concentrações de norepinefrina foi maior do que a da artéria mesentérica. Seguindo esse procedimento, o método pode ser modificado para incluir agonistas ou antagonistas no tampão que sejam de interesse específico para o pesquisador.Isso permitiria ao pesquisador entender melhor o envolvimento de receptores muito específicos e os mecanismos por trás das respostas vasculares observadas durante o experimento myo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como coletar, processar e isolar vasos sanguíneos. Para um meu experimento.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Adulto normal tecido vascularizado mamíferos que carece de angiogênese fisiológica e que não tenha sido exposto a uma intervenção cirúrgica é usado para estudar: (i) o início e desenvolvimento da angiogênese após a administração intraperitoneal de agentes de teste, e (ii) a modificação da angiogênese após a administração sistêmica de selecionados agentes de teste.

Rat Assay Angiogenesis Mesentery

Um método automatizado para medições Miografia vigor em artérias mesentéricas isoladas é descrito. Ele emprega um Mulvany-Halpern Auto Myograph fio duplo 510A para determinar as respostas à fenilefrina e cálcio extracelular. O método permite a determinação consistente de respostas isométrica aos agonistas em pequenos vasos de diâmetros de 60 - 300 mm, de forma independente.

A contração da artéria mesentérica e Estudos Relaxamento Usando Miografia Fio Automated

O Ex vivo Preparação microvasos isolada esquelético de Investigação da reatividade vascular

Medidas do KV7 atividade do canal (KCNQ) de potássio em miócitos isolados arteriais (usando patch braçadeira técnicas eletrofisiológicas) em paralelo com medidas de constritores / dilatador respostas (usando Miografia pressão) pode revelar informações importantes sobre os papéis do KV7 canais em fisiologia do músculo liso vascular e farmacologia.

Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

Nós apresentamos uma preparação para a visualização e manipulação de sinalização do cálcio em nativa, endotélio microvascular intacta. Tubos endoteliais recém isolado das artérias de resistência do mouse fornecendo músculo esquelético manter vivo na morfologia e sinalização dinâmica dentro e entre as células vizinhas. Tubos endoteliais pode ser preparado a partir de microvasos de outros tecidos e órgãos.

Isolamento de tubos endoteliais microvasculares de Artérias Rato Resistência

Miografia pressão é utilizado para avaliar a vasoactividade das pequenas artérias que se desenvolvem constrição prolongada quando pressurizado. Este manuscrito proporciona um protocolo detalhado para avaliar em segmentos isolados de pequenas artérias mesentéricas de ratos, vasoactividade e o efeito da pressão intraluminal no diâmetro vascular.

Avaliando Miogênica Resposta e vasoactividade em artérias mesentéricas de resistência Usando Miografia Pressão

A técnica de Landis modificada permite a medição pareada da condutividade hidráulica de microvasos individuais no mesentério de ratos normais e geneticamente modificados sob condições de controle e teste usando técnicas de microperfusão. Ele fornece um método conveniente para avaliar os mecanismos que regulam a permeabilidade dos microvasos e a troca transvascular em condições fisiológicas.

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Este protocolo descreve o uso de preparações de tecido intestinal excisadas ou "sacos intestinais" como um modelo ex vivo da função da barreira intestinal. Este modelo pode ser usado para avaliar a integridade da barreira epitelial e da camada de gel mucoso em locais intestinais específicos em modelos animais de doenças digestivas.

Ex Vivo Intestinal Sacs para Avaliar mucosa Permeabilidade de modelos de doença gastrointestinal

Este manuscrito descreve em vitro protocolos de vídeo microscopia para avaliar a função vascular nas artérias de resistência cerebral de rato. O manuscrito também descreve técnicas para avaliar a densidade de microvessel com perfusão de lectina e tecido fluorescente etiquetada usando Laser Doppler Flowmetry.

Avaliação dos mecanismos de controlo Vascular utilizando a microscopia das artérias de resistência isolada de ratos

A técnica de myograph do fio é usada para investigar as funções do músculo liso vascular e tela novas drogas. Nós relatamos um protocolo detalhado para medir a contratilidade isométrica da artéria mesentérica de rato e para a seleção de novos relaxantes do músculo liso vascular.

Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

O protocolo descreve o uso de miografia de arame para avaliar a tensão isométrica transmural de artérias mesentéricas isoladas de camundongos, com especial consideração da modulação por fatores liberados das células endoteliais e dos tecidos adiposos perivasculares.

Avaliação da responsividade do tônus vascular usando artérias mesentéricas isoladas com foco na modulação por tecidos adiposos perivasculares

Aprenda a isolar artérias e veias mesentéricas bovinas para avaliar a vasoatividade de compostos experimentais. Este bioensaio permite estudar o fluxo sanguíneo intestinal e identificar potenciais aplicações terapêuticas em saúde gastrointestinal.

Isolando e com cortes de bovinos artéria e veia mesentérica como Bioassay teste para vasoactividade no intestino delgado

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