Name: Baseada Reporter ensaio de crescimento para análise sistemática de degradação de proteínas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprenda a quantificar taxas de proteólise por meio de ensaio baseado em crescimento de levedura. Este método correlaciona degradação de proteínas com cinética de crescimento em cultura líquida de forma simples e modular.

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Agradecemos ao Dr. Yuval Reiss e ao Dr. William Breuer pela revisão crítica do manuscrito e a Omri Alfassy por ajudar no desenvolvimento do ensaio de tela Ura3-GFP. Também agradecemos ao Dr. M. Hochstrasser e ao Dr. R. Kulka pelos plasmídeos e cepas. Este trabalho foi financiado pela Academia Israelense de Ciências (concessão 786/08) e pela Fundação Científica Binacional Estados Unidos-Israel (bolsa 2011253).

1. Cultura celular <ol><li> Transformar as células de levedura auxotróficos, adequados, tais como Try467 (Tabela 2), com um plasmídeo contendo (a) um URA3 -degron de fusão e (b) um marcador de selecção adicional para metabólica plasmídeo e manutenção. NOTA: Um exemplo de um plasmídeo adequado é YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-Ura3 (LYS2) (Deg1- UV) Este é um plasmídeo integrativo de levedura contendo uma proteína de fusão que compreende de Deg1 - degron um derivado da transcrição de levedura. factor de mat2 17, epitopo FLAG - para a detecção por imunotransferência, Vma12 - uma proteína ER estável, e Ura3 15,18 (Figura 3A). (Ver Tabela 3 para os plasmídeos usados ​​neste estudo e para exemplos adicionais de plasmídeos apropriados.) </li><li> Para a selecção da manutenção do plasmídeo e, manter as células em placas de agar sintético adequado sob uma Definido (SD) meio sem marcadores de selecção amino ácidos <saté&gt; 19 (Por exemplo, Deg1 -UV é selecionada e mantida sob SD-LYS meios seletivos). </li><li> Cultivar células S / N a 30 ° C num meio SD selectivo adequado para manutenção do plasmídeo, até uma fase estacionária é alcançada. Cresça as células em tubos de ensaio ou em uma placa de 96 cavidades, dependendo do número de amostras a serem examinadas (ponto 2). </li></ol> 2. Preparação de células para análise <ol><li> Quando um pequeno número de amostras (N≤15) está a ser ensaiada, diluir as células e substituir o meio como se segue: <ol><li> Dilui-se 50 ul de células a partir de uma cultura D / N com 150 ul de meio SD por poço numa placa de 96 poços (fundo claro). Note-se, a primeira amostra é designado como branco contém apenas médio. </li><li> Determinar os valores de OD 600 amostras na placa de 96 poços utilizando um leitor de microplacas. </li><li> Calcula-se a OD efectiva 600 em cada poço pela multiplicação da leitura de OD 600 pelo factor de diluição (x4), a partir which o valor da leitura do branco é subtraído. Normalizar os valores resultantes dividindo por 0,55 para obter um caminho de comprimento calculado de 1 cm de acordo com a lei de Beer-Lambert. Note-se, este valor é constante quando se mede o OD 600 de 200 ul de células em uma placa de 96 poços padrão. </li><li> Calcule o volume exato necessário para a obtenção de células de levedura em montante equivalente a DO600 de 0,25 e transferir para um tubo Eppendorf. </li><li> Girar as células a alta velocidade (12.000 xg) durante 1 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio selectivo apropriado (ver secção 3.1) para se obter DO600 de 0,25. </li><li> Transferir 200 uL das estirpes diluídos para um novo poço de uma placa de 96 poços. </li></ol></li><li> Quando um grande número de amostras (N&gt; 15) estão a ser testados, diluir as células e substituir o meio, sem medição OD 600 anterior, como segue: <ol><li> Transferir 10 ml de células estacionáriascrescida O / N em uma placa de 96 poços para uma nova placa de 96 poços contendo 190 ul (diluição de 1:20) dos meios selectivos apropriados (ver secção 3.1). </li></ol></li></ol> 3. cinética de crescimento em cultura líquida em condições selectivas (Gils) <ol><li> Use os seguintes meios para medições de crescimento utilizando o repórter Ura3-degron: <ol><li> Para controles positivos de crescimento da levedura em condições não restritivas, o uso plasmídeo mídia SD seletiva (ver secção 1.2). Se nenhuma selecção plasmídeo é necessária, por exemplo, quando se usa um plasmídeo integrativo, tal como Deg1 -UV, meio SD contendo todos os aminoácidos necessários (SD completa) pode ser utilizado. </li><li> Para amostras experimentais de medição de crescimento sob condições restritivas, use meio SD-URA. </li></ol></li><li> Definir um leitor de microplacas multimodo para:. Uma temperatura de incubação de 30 ° C, OD 600 intervalos de medição de 15 minutos, e um ciclos orbitais e lineares de agitação de 1 min a cada sete minutos &lt;br /&gt; NOTA: Esta-dual mode tremor foi otimizada para obter uma distribuição homogênea de células; no entanto, outros modos de agitação ou mesmo nenhuma agitação pode funcionar tão bem. </li><li> Incubar as células a 30 ° C num leitor de microplacas O / N ou até que as células tenham atingido a fase estacionária (12-24 h). </li><li> Exportar os dados brutos em um arquivo de planilha. </li><li> Determinar a cinética de crescimento de leveduras utilizando MDTcalc, um programa de software personalizado que calcula o tempo mínimo (em horas) para as células para dobrar seu tamanho populacional (Minimal tempo de duplicação (MDT); para mais detalhes ver seção 4). </li></ol> 4. O cálculo do tempo de duplicação Minimal (MDT): Princípios do Algoritmo MDTcalc NOTA: Princípios do algoritmo MDTcalc, utilizando uma amostra representativa de células de levedura Try467 (Tabela 2) cultivadas em meio completo SD, são ilustrados na Tabela 1 e na Figura 1, que mostra uma folha de cálculo e dados de crescimento parcelas, respecpectivamente. <ol><li> Subtrair OD 600 valores em branco, obtido no respectivo poço, a partir de cada uma das leituras obtidas no poço da amostra. Separe as diferenças resultantes de 0,55 (por placas de 96 poços) para corrigir o comprimento do percurso da luz. Traça-se os valores finais (Tabela 1, Trans.) Contra o tempo para produzir a curva de crescimento de levedura real (OD 600 / hr) (Figura 1A). </li><li> Calcular o log 2 (OD 600) para cada um dos valores transformados para converter a fase logarítmica de crescimento em uma curva linear (Figura 1B). </li><li> Calcular o declive de um intervalo de 10 pontos temporais (N = 10) começando no tempo 0 e movendo um ponto de tempo de cada vez até N &lt;10 (Tabela 1, Pista; Figura 1C). </li><li> Calcula-se o valor inverso de cada inclinação para obter o tempo necessário para a população de células para dobrar (Tabela 1, 1 / Declive; Figura 1C). Calcula-se o mínimo1 / valor Slope para determinar o MDT (Tabela 1, retângulo preto; Figura 1C). Extrai-se a MDT calculada para células na amostra (Tabela 1, 1 / Slope, rectângulo preto) a partir do intervalo de tempo seleccionado (Tabela 1, delineada pelo rectângulo vermelho, as Figuras 1B, 1D). NOTA: A taxa de crescimento celular em meio SD-URA é inversamente proporcional ao MDT. </li></ol> 5. Usando MDTcalc <ol><li> Copie os arquivos de programas suplementados em uma pasta designada no computador. </li><li> Verifique se o arquivo de planilha que contém os dados de crescimento é salvo e fechado. Abra o programa de aplicação MDTcalc para ver o início da tela aparece. <ol><li> Insira as informações necessárias, como demonstrado na Figura 2: <ol><li> Em &#39;Caminho do arquivo &quot;, clique no retângulo à direita para localizar o arquivo de planilha. </li><li> Em &#39;Nome de folha &quot;, escrever o nome da planilha onde tele dados brutos está localizado. </li><li> Em &quot;Posição inicial&quot;, insira coordenar a planilha de tempo 0 da primeira amostra. </li><li> Em &#39;coluna Time&#39;, insira a letra que define a localização da coluna ponto de tempo (tempo deve ser fornecido em segundos). </li><li> Sob &#39;coluna em branco &quot;, inserir a carta que define a localização da coluna em branco (geralmente, mas não necessariamente no poço A1 da placa de 96 poços). </li><li> Em &#39;valor OD&#39;, escolha o valor mínimo transformado OD 600 necessário para o início do cálculo MDT (geralmente ,15-0,25). A definição deste valor impede cálculos de MDT para as culturas em fase de latência, devido à diluição excessiva para que MDT é calculado apenas para as amostras que chegam ao valor DO600 definido ou superior. </li></ol></li><li> Uma vez que o último valor foi inserido, pressione o botão &quot;calcular&quot; na parte inferior da tela. Certifique-se de que a barra de progresso na direita muda gradualmente para green. Não abra o arquivo de planilha durante o processo de cálculo. </li><li> Exportar os dois conjuntos de dados que aparecem automaticamente na tela após a conclusão do cálculo MDT em uma planilha. Certifique-se de que os dados incluem: (a) o valor MDT para cada bem que passa o teste do valor OD mínimo (como definido na seção 5.2.1.6) e (b) o ponto do intervalo a partir do qual o MDT foi calculado o tempo inicial (Iniciar tempo). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Hershko, A., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin system.</a> Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).</li>
<li>Ravid, T., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+degradation+signals+in+the+ubiquitin-proteasome+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).</li>
<li>Willems, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF+ubiquitin+protein+ligases+and+phosphorylation-dependent+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).</li>
<li>Tyers, M., Jorgensen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+and+the+cell+cycle%3A+with+this+RING+I+do+thee+destroy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy.</a> Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).</li>
<li>Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+signal+masking+by+heterodimerization+of+MAT%CE%B12+and+MAT+a1+blocks+their+mutual+destruction+by+the+ubiquitin-proteasome+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway.</a> Cell. 94, 217-227 (1998).</li>
<li>Furth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+bipartite+hydrophobic+signal+triggers+nuclear+quality+control+of+Ndc10+at+the+endoplasmic+reticulum%2Fnuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope.</a> Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).</li>
<li>Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+in+nuclear+protein+quality+control+degradation+is+governed+by+exposed+hydrophobicity+that+correlates+with+aggregation+and+insolubility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility.</a> J Biol Chem. 10, (2013).</li>
<li>Rosenbaum, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorder+Targets+Misorder+in+Nuclear+Quality+Control+A+Disordered+Ubiquitin+Ligase+Directly+Recognizes+Its+Misfolded+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates.</a> Molecular cell. 41, 93-106 (2011).</li>
<li>Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heat-stable+polypeptide+component+of+an+ATP-dependent+proteolytic+system+from+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemica.%2C+%26+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes.</a> Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).</li>
<li>Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+system+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 192, 319-360 (2012).</li>
<li>Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall+construction+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 23, 185-202 (2006).</li>
<li>Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analyses+of+sumoylated+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.+Induction+of+protein+sumoylation+by+cellular+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses.</a> J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).</li>
<li>Alani, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+type+of+fusion+analysis+applicable+to+many+organisms%3A+protein+fusions+to+the+URA3+gene+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast.</a> Genetics. 117, 5-12 (1987).</li>
<li>Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+ubiquitin+ligase+of+the+nuclear+envelope%2Fendoplasmic+reticulum+that+functions+in+both+ER-associated+and+Matalpha2+repressor+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation.</a> Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).</li>
<li>Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+and+soluble+substrates+of+the+Doa10+ubiquitin+ligase+are+degraded+by+distinct+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways.</a> EMBO J. 25, 533-543 (2006).</li>
<li>Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+signals+for+ubiquitin+system+proteolysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Embo J. 17, 2759-2766 (1998).</li>
<li>Hochstrasser, M., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+degradation+of+a+transcriptional+regulator%3A+the+yeast+2+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor.</a> Cell. 61, 697-708 (1990).</li>
<li>Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradation+of+a+cytosolic+protein+requires+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery.</a> J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).</li>
<li>Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuthrie%2C+C+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. 194, Academic Press. (1991).</li>
<li>Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ubiquitin-ligase+complexes+define+convergent+pathways+for+the+degradation+of+ER+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins.</a> Cell. 126, 361-373 (2006).</li>
<li>Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luminal+surveillance+complex+that+selects+misfolded+glycoproteins+for+ER-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation.</a> Cell. 126, 349-359 (2006).</li>
<li>Wu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+catalytic+residue+in+the+ubiquitin-conjugating+enzyme+family%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family.</a> Embo J. 22, 5241-5250 (2003).</li>
<li>Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluoroorotic+acid+as+a+selective+agent+in+yeast+molecular+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics.</a> Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).</li>
<li>Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placing+a+disrupted+degradation+motif+at+the+C+terminus+of+proteasome+substrates+attenuates+degradation+without+impairing+ubiquitylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation.</a> J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).</li>
<li>Cronin, S. R., Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein+degradation+with+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein degradation with green fluorescent protein.</a> Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui nós descrevemos um ensaio baseado no crescimento celular para determinar a taxa de degradação da proteína relativos, denominado &#39;A cinética do crescimento em cultura líquida sob condições selectivas &quot;(Gils). O ensaio Gils tem várias vantagens: é simples de configurar, aquisição e análise de dados é simples e é extremamente modular. Consequentemente, Gils podem ser aplicadas simultaneamente para várias amostras em um amistoso formato de placa de multi-usuário que também pode ser adaptado a automação para ap...

O sistema de degradação da ubiquitina-proteassoma é um importante regulador da máquina, que tem sido implicado na manutenção da homeostase da proteína em todos os eucariotas. A UPS inicialmente conjuga múltiplas moléculas de ubiquitina a uma proteína-alvo, após o que a proteína poli-ubiquitina-marcado é degradado pelo proteassoma 26S. Na maioria dos casos, o passo limitante da velocidade para a degradação mediada por ubiquitina é ubiquitinação substrato, mediada por E2 e E3 conjugar enzimas ligando enzimas (ligases E3) 1. Por conseguinte, a estabilidade intracelular de proteínas específicas reflecte a sua susceptibilidade a ubiquitina-conjugação e a actividade das suas enzimas cognatas ubiquitinação. E3 ligases são os componentes de reconhecimento de substrato principais da UPS. Como tal, estas enzimas reconhecem degrons dentro de seus substratos que estão ausentes ou não expostos em suas contrapartes estáveis ​​2. Por exemplo, muitos reguladores do ciclo celular must ser sintetizado e degradado de uma forma temporal específica, a fim de manter a progressão do ciclo celular em ordem. A degradação destas proteínas é muitas vezes controlada pela fosforilação, mediadas por quinases de sinalização celulares regulados 3,4. Por outro lado, as proteínas anormalmente dobradas são reconhecidos através degrons enigmáticas. Estas são as regiões que normalmente são escondidos na estrutura nativa e estão expostos em cima estrutura perturbação. Tais degrons incluem domínios hidrófobos e segmentos de 5-7 intrinsecamente desordenados 8. Desde a descoberta seminal do sistema ubiquitina-proteína para degradação e a caracterização dos seus fundamentos em lisados ​​de reticulócitos de 9, genética de leveduras foi instrumental na descoberta de muitos dos componentes do sistema ubiquitina 10. O sucesso da levedura como organismo modelo para a análise sistemática da degradação das proteínas pelo UPS é principalmente devido ao fato de que o UPS é altaly conservada em todos os eucariontes 4, juntamente com a sua receptividade como um sistema experimental. De facto, os sistemas à base de levedura são vulgarmente utilizados para decifrar os mecanismos de acção da máquina ubiquitinação. Estudando a degradação da proteína por meios bioquímicos normalmente requer uma preparação de extractos celulares. Enquanto proteínas da célula animal pode ser extraída sob condições relativamente suaves que preservem as interacções e função de proteínas, a presença de uma parede celular de levedura 11 robusto no requer consideravelmente mais severas condições de perturbação, que podem afectar a recuperação de proteína. De fato, diferentes procedimentos de levedura rompimento celular variam consideravelmente em sua capacidade para recuperar proteínas intactas em quantidades que representem corretamente a sua abundância relativa celular. Além disso imprecisão é inerente aos diferentes métodos empregados para a determinação das taxas de degradação de proteínas específicas: experimentos metabólicos à base de rotulagem &#39;pulse-chase&#39; seguido de immunoprecipitation, para isolar proteínas específicas 12, muitas vezes não é estritamente quantitativa. Assim, quando a degradação da proteína é comparada por este método, cuidado extra deve ser tomado na interpretação dos resultados. Para contornar este inconveniente, um ensaio perseguição cicloheximida alternativa (CHX) podem ser empregados 12. Neste ensaio, o inibidor da tradução é adicionado a culturas de células e alterações temporais nos níveis em estado estacionário da proteína são subsequentemente monitorizados. No entanto, o uso de CHX está limitado às proteínas com semi-vidas relativamente curtas (&lt;90 min), como a inibição de longa duração da síntese de proteínas é citotóxica. Notavelmente, ambos os ensaios mencionados acima requerem a utilização de anticorpos específicos para a proteína, o que nem sempre estão disponíveis. Para superar estas limitações técnicas, os investigadores têm desenvolvido vários métodos que não requerem a extracção de células e proteínas manuseamento directo. Uma abordagem baseia-se no estabelecimento de sim auxotróficoestirpes st, obtidos por deleção dos genes que codificam enzimas metabólicas essenciais. Tais genes incluem HIS3, LEU2, LYS2 e TRP1, que codifica para as enzimas necessárias para a biosíntese de aminoácidos, bem como URA3 que codifica OMP-descarboxilase (Ura3), uma enzima essencial da pirimidina ribonucleótido biossíntese. Ura3 tem sido amplamente utilizado em estudos de degradação de proteínas. Nestes ensaios, a expressão constitutiva de Ura3 resgata o crescimento de células ura3 em meio deficiente em uracilo-13. Consequentemente, desestabilizando Ura3 através da fusão de um degron pode diminuir o crescimento das células em meio mínimo sem uracilo. Este método tem sido utilizado em vários estudos de degradação de proteínas, incluindo a identificação dos determinantes da degradação 5, 14 e ligases E3 ubiquitinação auxiliar factores 15 e a descoberta de novos UPS degrons 16. Todos estes métodos empregues crescimento celular em placas de agar como o ensaio de leitura. No entanto, tele critério de crescimento (crescimento positivo / negativo), enquanto robusto e eficiente, é principalmente qualitativa e não fornece informação quantitativa que é importante para avaliar a potência de um degron ou a contribuição relativa dos diversos fatores de degradação auxiliares. Temos, portanto, desenvolvidos e utilizados vetores de levedura e métodos de rastreio que permite uma análise sistemática e quantitativa da degradação de proteínas pela URA3 -degron sistema de fusão. O protocolo baseia-se em um ensaio de manusear fácil que mede a cinética do crescimento na cultura líquido sob condições selectivas (gils) e na geração de curvas de crescimento padrão. Cinética de crescimento de levedura são caracterizados por três fases principais - o atraso, o exponencial (log) e da fase estacionária. Cálculo da cinética de replicação de levedura durante a fase log em condições selectivas, que é determinada pelos níveis de expressão do Ura3-degron, fornece uma medição imparcial o quantitativof degradação da proteína. Este método pode ser aplicado para medir e comparar as taxas de degradação de vários substratos UPS simultaneamente em múltiplas linhagens e sob várias condições.

<table><tbody><tr><td>Base de nitrogênio de levedura Difco sem aminoácidos e sulfato de amônio</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td>Para crescimento de levedura em meio SD mínimo.&nbsp; Os aminoácidos a serem fornecidos são: Arginina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Felinalanina, Treonina, Triptofano</td></tr><tr><td>Sulfato de amônio</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos</td><td>Mais Alto pureza disponível&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td>Qualquer outra marca compatível pode ser usada</td></tr><tr><td>Ciclohexade&nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C7698</td><td>Trabalhando conc. 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Infinite 200 PRO series</td><td>Tecan</td><td></td><td>Para incubação de leveduras e medições OD600. Qualquer outro leitor compatível com controle de temperatura pode ser usado.</td></tr><tr><td>Software MDTcalc</td><td></td><td></td><td>Experimental</td></tr></tbody></table>

baseada reporter ensaio de crescimento para análise sistemática de degradação de proteínas

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

A degradação das proteínas pelo sistema ubiquitina-proteassoma (UPS) é um importante mecanismo de regulação para a homeostase da proteína em todos os eucariotas. A abordagem padrão para determinar a degradação da proteína intracelular se baseia em ensaios bioquímicos para seguir a cinética de declínio proteína. Tais métodos são frequentemente trabalhoso e demorado e, portanto, não passível de experiências destinadas a avaliar múltiplos substratos e as condições de degradação. Como alternativa, ensaios baseados em células de crescimento têm sido desenvolvidos, que são, no seu formato convencional, ensaios de ponto final, que não é possível determinar quantitativamente as mudanças relativas nos níveis de proteína. Aqui, descrevemos um método que determina fielmente as alterações nas taxas de degradação de proteínas por acoplamento los a uma cinética de crescimento de levedura célula. O método é baseado em um sistema de seleção estabelecido em uracila Auxotrofia de URA3 -deleted células de levedura é resgatado por uma proteína repórter exogenamente expressa, Composta de uma fusão entre o gene URA3 essencial e determinante degradação (degron). A proteína repórter é concebido de modo a que a sua taxa de síntese é constante enquanto que a sua taxa de degradação é determinada pela degron. Como o crescimento celular em meio deficiente em uracilo-é proporcional aos níveis relativos de Ura3, cinética de crescimento são inteiramente dependentes da degradação da proteína repórter. Este método mede com precisão mudanças na cinética de degradação de proteínas intracelulares. Aplicou-se a: (a) Avaliação da contribuição relativa dos factores de conjugação de ubiquitina conhecidos à proteólise (b) E2 enzima de conjugação de estrutura-função de análises (c) Identificação e caracterização de novos degrons. A aplicação do sistema baseado URA3 degron- transcende o campo de degradação de proteínas, como pode também ser adaptada para a monitorização das alterações dos níveis de proteína associados com as funções de outras vias celulares.

Investigar o papel das enzimas da via Doa10 na degradação de um substrato de repórter Para testar a validade do método gils que foi comparado com um ensaio de degradação de tradicional. Esta experiência avalia a contribuição relativa dos componentes da membrana localizada ER-Doa10-ligase E3 complexo de 20,21 para a degradação do substrato de proteína repórter de controlo de qualidade Deg1- VU (Figura 3A). O plasmídeo Deg1- VU foi...

Aqui descrevemos um ensaio biológico robusto para quantificar a taxa relativa de proteólise pelo sistema ubiquitina-proteassoma. A leitura do ensaio é a taxa de crescimento da levedura em cultura líquida, que depende dos níveis celulares de uma proteína repórter que compreende um sinal de degradação fundido a um marcador metabólico essencial.

Baseada Reporter ensaio de crescimento para análise sistemática de degradação de proteínas

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar as variações nas taxas de degradação de proteínas de forma sistemática, acoplando-as à cinética de crescimento de leveduras em cultura líquida. Isso é feito primeiro cultivando células expressando uma proteína repórter composta por um sinal de degradação acoplado a um marcador metabólico durante a noite até a fase estacionária em um meio seletivo adequado. Em seguida, a densidade óptica das células é medida para determinar a cinética de crescimento das células e, em seguida, o tempo mínimo de duplicação das células durante a fase logarítmica é calculado a partir da cinética de crescimento usando um programa de software designado.Em última análise, o tempo mínimo de duplicação calculado pode ser usado para definir variações na cinética de degradação da proteína. As principais vantagens desta técnica sobre os métodos existentes, como ciclamato ou ensaios de degradação de perseguição de pulso, acrescentaram que nossa técnica é simples de configurar. A aquisição e análise de dados são diretas e o design do ensaio é extremamente modular.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da degradação do pote, como quais elementos são necessários para o reconhecimento do pote mal dobrado pelo sistema de pote de ubiquitina. Tive a ideia desse método pela primeira vez quando quis fazer uma tela para identificar as proteínas que envolvem a remoção da ubiquitina de seu subconjunto. Então eu estabeleci uma maneira simples de comparar várias amostras Para preparar as células para a análise.Comece transformando as células de levedura atróficas de ox apropriadas, como TRY 4 67, com um plasmídeo contendo uma fusão U três Deron e um marcador metabólico adicional para seleção e manutenção de plasmídeos. Para seleção e manutenção de plasmídeos, cultive as células em placas de ágar sob um meio sintético definido adequado, sem marcadores de seleção de aminoácidos, transfira colônias sobreviventes para manchas, transfira células de manchas para meio líquido e incube durante a noite a 30 graus Celsius até que uma fase estacionária seja atingida. Em seguida, para 15 amostras ou menos, dilua 50 microlitros das células da cultura noturna com 150 microlitros de meio sintético definido por poço.Em uma placa de fundo transparente de 96 poços, use um leitor de microplacas para determinar os valores de OD 600 das amostras. Em seguida, depois de calcular o volume exato necessário para obter células de levedura em uma quantidade equivalente a um OD 600 de 0,25, gire as células por um minuto a 12.000 vezes G e à temperatura ambiente, ressuspenda as células em um mililitro do meio seletivo apropriado para obter um OD 600 de 0,25 e transfira 200 microlitros da cepa diluída para um poço de uma nova placa de 96 poços quando maior que 15 amostras devem ser testadas. Transfira 10 microlitros das células estacionárias cultivadas durante a noite para um poço de uma nova placa de 96 poços contendo 190 microlitros do meio seletivo apropriado para medir a cinética de crescimento das células de levedura transformadas sob condições seletivas.Em seguida, defina um leitor de microplacas multimodo para uma temperatura de incubação de 30 graus Celsius OD 600, intervalos de medição de 15 minutos e ciclos de agitação orbital e linear de um minuto a cada sete minutos. Em seguida, incube as células a 30 graus Celsius no leitor de microplacas por 12 a 24 horas. Quando as células atingirem a fase estacionária, exporte os dados brutos para um arquivo de planilha para determinar a cinética de crescimento da levedura usando o MDT Calc.Certifique-se de que o arquivo de planilha que contém os dados de crescimento esteja salvo e fechado. Em seguida, abra o programa aplicativo MDT Calc no caminho do arquivo. Clique no retângulo para localizar o arquivo de planilha sob o nome da planilha.Insira o nome da planilha onde os dados brutos estão localizados na posição inicial. Insira a coordenada de tempo da planilha, zero da primeira amostra na coluna de tempo. Insira a letra que define a localização da coluna de ponto de tempo em segundos em coluna em branco, insira a letra que define a localização da coluna em branco.Por exemplo, o poço A um da placa de 96 poços. Próximo. Em Valor OD, escolha o valor mínimo transformado de OD 600 necessário para o início do cálculo do MDT. Geralmente 0,15 a 0,25 para garantir que o MDT seja calculado apenas para as amostras que atingem o valor D 600 definido ou superior.Depois que o último valor for inserido, clique no botão calcular e confirme se a barra de progresso à direita muda gradualmente para verde. Por fim, exporte os dois conjuntos de dados que aparecem automaticamente na tela na conclusão do cálculo do MDT para uma nova planilha. Confirme se os dados incluem o valor de MDT para cada poço que passa no teste de valor mínimo de OD e a hora de início do intervalo a partir do qual o MDT foi calculado neste experimento representativo.As diferenças relativas na cinética de degradação de proteínas entre o tipo selvagem e várias cepas mutantes foram comparadas inicialmente tipo selvagem U BBC seis, delta UBC sete delta ou DOA 10 células delta expressando D um VMAU três foram cultivadas em meio completo sintético definido. Em seguida, para medir as brânquias, as células foram lavadas e incubadas em meio sintético definido. Menos uracila curvas de crescimento semelhantes e MDT calculado foram observadas para todas as cepas cultivadas em meio completo sintético definido, excluindo a possibilidade de que a deleção de qualquer um dos genes examinados afete o crescimento celular.Em contraste, a incubação em meio sintético definido menos uracila resultou em crescimento deficiente de células do tipo selvagem, enquanto apenas um pequeno defeito de crescimento foi observado nas cepas mutantes. UBC sete é absolutamente necessário para a degradação DEG um VMAU três, permitindo uma avaliação precisa até mesmo dos efeitos parciais de vários mutantes E dois. Assim, a cinética de crescimento rápido é observada em células que expressam UBC sete com os mutantes do sítio ativo, C 89 s e N 81 A.In além disso, dois mutantes previstos para impedir indiretamente a degradação de DEG um VMA ETH três V 20 5G e H 90 4K também aumentaram o crescimento celular em comparação com o tipo selvagem UBC sete, embora em menor grau do que os mutantes do sítio ativo.Assim, o método das brânquias pode ser usado para medição precisa da contribuição relativa de vários fatores de degradação para a estabilidade de um substrato repórter. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o protocolo é sensível a pequenas diferenças nas taxas de degradação de proteínas. Isso é uma vantagem, mas também significa que deve-se ter cuidado no projeto e verificação do Deron a ser usado seguindo este procedimento.Outros métodos, como microscopia de fluorescência de alto rendimento, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como qual é a propensão de agregação das proteínas repórter. Por esse motivo, é uma boa ideia incluir também uma tag GFP no repórter. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar as mudanças na taxa de degradação de proteínas de maneira sistemática usando um leitor MICROPLATE e nosso programa de software designado.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método para monitorizar a actividade de ubiquitina-proteassoma nas células vivas é descrito. A degron-GFP-desestabilizado (GFP-dgn) e uma proteína de fusão GFP estável dgnFS-são gerados e transduzidos para a célula utilizando um vector de expressão lentiviral. Esta técnica permite a geração de um estábulo GFP-dgn/GFP-dgnFS linha celular que expressa em que a actividade de ubiquitina-proteassoma podem ser facilmente avaliados utilizando epifluorescência ou citometria de fluxo.

Monitoramento da ubiquitina-proteassoma Atividade em células vivas Usando um Degron (dgn) desestabilizado Green Fluorescent Protein Protein Repórter (GFP) com base em

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de agregação de proteínas baseado em células usando inibidores de proteassoma, que bloqueiam a atividade do proteassoma, impedindo que proteínas mutantes mal dobradas, fundidas a um rótulo fluorescente, sofram degradação proteassômica dependente de ubiquitina, levando ao seu acúmulo dentro do citoplasma celular. Os agregados proteicos são então visualizados e quantificados por microscopia de fluorescência.

Ensaio de Formação de Agregados de Proteínas: Um Método para Detectar e Quantificar a Agregação de Proteínas em Células Cultivadas após Indução por Inibidor de Proteassoma

Este vídeo descreve um ensaio de degradação para proteínas mal dobradas usando tratamento com cicloheximida junto com fracionamento de detergente. Este método ajuda a estudar a dinâmica de proteínas mal dobradas e a descobrir os mecanismos aprofundados de renovação de proteínas.

Ensaio de degradação de proteínas propensas a dobramento incorreto: uma técnica para monitorar a degradação de proteínas mal dobradas usando tratamento com cicloheximida e fracionamento de detergente

Degradação de proteínas alvejado representa um grande mecanismo regulador para a função celular. Ela ocorre através da via de ubiquitina-proteassoma conservado, que se liga cadeias de poliubiquitina para a proteína alvo, que, em seguida, servir de "tags", como moleculares para o proteassoma 26S. Aqui, descrevemos um ensaio livre de células simples e confiável para a degradação de proteínas proteosomal.

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Ensaios Repórter Massively Parallel em células de mamíferos cultivadas

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Determinação baseado no crescimento e confirmação bioquímica de Requisitos Genéticos para a degradação de proteínas em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

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