Baseada Reporter ensaio de crescimento para análise sistemática de degradação de proteínas

O objetivo geral deste procedimento é determinar as variações nas taxas de degradação de proteínas de forma sistemática, acoplando-as à cinética de crescimento de leveduras em cultura líquida. Isso é feito primeiro cultivando células expressando uma proteína repórter composta por um sinal de degradação acoplado a um marcador metabólico durante a noite até a fase estacionária em um meio seletivo adequado. Em seguida, a densidade óptica das células é medida para determinar a cinética de crescimento das células e, em seguida, o tempo mínimo de duplicação das células durante a fase logarítmica é calculado a partir da cinética de crescimento usando um programa de software designado.

Em última análise, o tempo mínimo de duplicação calculado pode ser usado para definir variações na cinética de degradação da proteína. As principais vantagens desta técnica sobre os métodos existentes, como ciclamato ou ensaios de degradação de perseguição de pulso, acrescentaram que nossa técnica é simples de configurar. A aquisição e análise de dados são diretas e o design do ensaio é extremamente modular.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da degradação do pote, como quais elementos são necessários para o reconhecimento do pote mal dobrado pelo sistema de pote de ubiquitina. Tive a ideia desse método pela primeira vez quando quis fazer uma tela para identificar as proteínas que envolvem a remoção da ubiquitina de seu subconjunto. Então eu estabeleci uma maneira simples de comparar várias amostras Para preparar as células para a análise.

Comece transformando as células de levedura atróficas de ox apropriadas, como TRY 4 67, com um plasmídeo contendo uma fusão U três Deron e um marcador metabólico adicional para seleção e manutenção de plasmídeos. Para seleção e manutenção de plasmídeos, cultive as células em placas de ágar sob um meio sintético definido adequado, sem marcadores de seleção de aminoácidos, transfira colônias sobreviventes para manchas, transfira células de manchas para meio líquido e incube durante a noite a 30 graus Celsius até que uma fase estacionária seja atingida. Em seguida, para 15 amostras ou menos, dilua 50 microlitros das células da cultura noturna com 150 microlitros de meio sintético definido por poço.

Em uma placa de fundo transparente de 96 poços, use um leitor de microplacas para determinar os valores de OD 600 das amostras. Em seguida, depois de calcular o volume exato necessário para obter células de levedura em uma quantidade equivalente a um OD 600 de 0,25, gire as células por um minuto a 12.000 vezes G e à temperatura ambiente, ressuspenda as células em um mililitro do meio seletivo apropriado para obter um OD 600 de 0,25 e transfira 200 microlitros da cepa diluída para um poço de uma nova placa de 96 poços quando maior que 15 amostras devem ser testadas. Transfira 10 microlitros das células estacionárias cultivadas durante a noite para um poço de uma nova placa de 96 poços contendo 190 microlitros do meio seletivo apropriado para medir a cinética de crescimento das células de levedura transformadas sob condições seletivas.

Em seguida, defina um leitor de microplacas multimodo para uma temperatura de incubação de 30 graus Celsius OD 600, intervalos de medição de 15 minutos e ciclos de agitação orbital e linear de um minuto a cada sete minutos. Em seguida, incube as células a 30 graus Celsius no leitor de microplacas por 12 a 24 horas. Quando as células atingirem a fase estacionária, exporte os dados brutos para um arquivo de planilha para determinar a cinética de crescimento da levedura usando o MDT Calc.

Certifique-se de que o arquivo de planilha que contém os dados de crescimento esteja salvo e fechado. Em seguida, abra o programa aplicativo MDT Calc no caminho do arquivo. Clique no retângulo para localizar o arquivo de planilha sob o nome da planilha.

Insira o nome da planilha onde os dados brutos estão localizados na posição inicial. Insira a coordenada de tempo da planilha, zero da primeira amostra na coluna de tempo. Insira a letra que define a localização da coluna de ponto de tempo em segundos em coluna em branco, insira a letra que define a localização da coluna em branco.

Por exemplo, o poço A um da placa de 96 poços. Próximo. Em Valor OD, escolha o valor mínimo transformado de OD 600 necessário para o início do cálculo do MDT. Geralmente 0,15 a 0,25 para garantir que o MDT seja calculado apenas para as amostras que atingem o valor D 600 definido ou superior.

Depois que o último valor for inserido, clique no botão calcular e confirme se a barra de progresso à direita muda gradualmente para verde. Por fim, exporte os dois conjuntos de dados que aparecem automaticamente na tela na conclusão do cálculo do MDT para uma nova planilha. Confirme se os dados incluem o valor de MDT para cada poço que passa no teste de valor mínimo de OD e a hora de início do intervalo a partir do qual o MDT foi calculado neste experimento representativo.

As diferenças relativas na cinética de degradação de proteínas entre o tipo selvagem e várias cepas mutantes foram comparadas inicialmente tipo selvagem U BBC seis, delta UBC sete delta ou DOA 10 células delta expressando D um VMAU três foram cultivadas em meio completo sintético definido. Em seguida, para medir as brânquias, as células foram lavadas e incubadas em meio sintético definido. Menos uracila curvas de crescimento semelhantes e MDT calculado foram observadas para todas as cepas cultivadas em meio completo sintético definido, excluindo a possibilidade de que a deleção de qualquer um dos genes examinados afete o crescimento celular.

Em contraste, a incubação em meio sintético definido menos uracila resultou em crescimento deficiente de células do tipo selvagem, enquanto apenas um pequeno defeito de crescimento foi observado nas cepas mutantes. UBC sete é absolutamente necessário para a degradação DEG um VMAU três, permitindo uma avaliação precisa até mesmo dos efeitos parciais de vários mutantes E dois. Assim, a cinética de crescimento rápido é observada em células que expressam UBC sete com os mutantes do sítio ativo, C 89 s e N 81 A.In além disso, dois mutantes previstos para impedir indiretamente a degradação de DEG um VMA ETH três V 20 5G e H 90 4K também aumentaram o crescimento celular em comparação com o tipo selvagem UBC sete, embora em menor grau do que os mutantes do sítio ativo.

Assim, o método das brânquias pode ser usado para medição precisa da contribuição relativa de vários fatores de degradação para a estabilidade de um substrato repórter. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o protocolo é sensível a pequenas diferenças nas taxas de degradação de proteínas. Isso é uma vantagem, mas também significa que deve-se ter cuidado no projeto e verificação do Deron a ser usado seguindo este procedimento.

Outros métodos, como microscopia de fluorescência de alto rendimento, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como qual é a propensão de agregação das proteínas repórter. Por esse motivo, é uma boa ideia incluir também uma tag GFP no repórter. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar as mudanças na taxa de degradação de proteínas de maneira sistemática usando um leitor MICROPLATE e nosso programa de software designado.