Name: Retroviral Infecção murina Embryonic Stem Cell Derived Cells embrioides corpo de Análise da diferenciação hematopoética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Aprenda a analisar a diferenciação hematopoética em células-tronco embrionárias murinas usando infecção retroviral e citometria de fluxo. Este método permite estudar o efeito temporal da expressão gênica no desenvolvimento sanguíneo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por um Pilot and Feasibility Grants do Indiana University School of Medicine Center (IUSM) para Excelência em Hematologia Molecular (NIDDK, 5P30DK090948). Financiamento adicional foi fornecido por um Subsídio de Aprimoramento Biomédico da IUSM. Gostaríamos de agradecer à Dra. Karen Cowden Dahl por comentar o manuscrito.

1. embrioides Corporal (EB) Formação <ol><li> Gelatina-se adaptar CES que foram mantidos em fibroblastos de embrião de ratinho (MEFs). CES passagem 3 vezes na placa de 6 poços de cultura de tecidos revestidas com gelatina a 0,1% para remover MEFs. <ol><li> Cultivar células em meio de manutenção com LIF ESC para manter as células indiferenciadas (Tabela 1). Faça células certeza nunca superior a 80% de confluência. Use baixa passagem (10 ou menos passagens após a remoção de MEFs) células de diferenciação. </li></ol></li><li> No dia antes da CES são cultivadas durante a diferenciação EB, a passagem das células, de forma que será de aproximadamente 50-70% confluentes no dia seguinte. Continuar a cultura de células em meio de manutenção de ESC para reter pluripotência das células. </li><li> No dia da diferenciação, meios de manutenção aspirado ESC e lava-se com 1 ml de fosfato salino tamponado (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM e 11,9 mM de tampão fosfato, pH 7,4) por poço de uma placa de 6 poços. <ol><li> Adicionar 200 ul de 0,25% Trypsem / EDTA a cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 3 min. </li><li> Inactivar a tripsina / EDTA com 800 ul de meios de diferenciação. Pipeta cima e para baixo em um 2 ml pipeta sorológica com uma ponta p200 para quebrar-se as células em uma suspensão de células individuais. Certifique-se de que a ponta p200 se encaixa perfeitamente no final, para a mídia não subir entre a pipeta e interface de ponta. </li><li> Pipeta cima e para baixo cerca de 5-10 vezes. Tome cuidado para não criar bolhas durante a pipetagem. </li></ol></li><li> Transferência de células para um tubo cônico de 15 ml. Traga-se o volume para 10 ml com PBS. Centrifugar a 315 xg durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover o sobrenadante. Lavar duas vezes com 5 ml de PBS para remover a mídia restantes contendo LIF. Centrifuga-se como no passo 1.4 para cada lavagem. <ol><li> Ressuspender o sedimento final de células em 2 ml de meio de diferenciação (Tabela 2). </li></ol></li><li> Contar as células com um hemocitómetro ou contador de células e a placa 6.000-10.000 células / ml numa placa de 10 centímetros de Petri(Cultura de tecido não-tratado). <ol><li> Determine as exatas células / ml empiricamente para cada linha ESC. Use placas de Petri estéreis normalmente utilizados para o trabalho bacteriana ou placas de baixa adesão. NOTA: Para obter os melhores resultados de diferenciação, as EBs devem formar esferas que permanecem em suspensão sem anexar a placa. Teste várias marcas de placas para encontrar aquelas com menos aderência. </li><li> Incubar os CES diferenciadores em um 37 ° C tecido cultura incubadora com 5% de CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Banco </td><td> Concentração final </td><td> Volume </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1x </td><td></td><td> 410 ml </td><td> S<html> IGMA / Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (ES filtrada) </td><td> 100% </td><td> 15% </td><td> 75 ml </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> Não-essencial Aminoácidos </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / Estreptomicina </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> 14,3 M </td><td> 114 mM </td><td> 4 l </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> M3148 </td></tr><tr><td> Fator Inibidor de Leucemia (LIF) </td><td> 10 7 unidades / ml </td><td> 1000 unidades / ml </td><td> 50 ul </td><td> Millipore </td><td> ESG1107 </td></tr></tbody></table>ONTEÚDO &quot;&gt; Tabela 1: ESC Manutenção Media. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col /><col span="2" /><col /><col span="2" /></colgroup><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Banco </td><td> Concentração final </td><td> Volume </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 1x </td><td></td><td> 410 ml </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> D5796 </td></tr><tr><td> FBS (User selecionados para diferenciação ideal) </td><td> 100% </td><td> 15% </td><td> 75 ml </td><td> Hyclone </td><td> SH30070.03E </td></tr><tr><td> Não-essencial Aminoácidos </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 11140 </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Vida Tecnologia degias </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> Penncillin / Estreptomicina </td><td> 100x </td><td> 1x </td><td> 5 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 15070 </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> 14,3 M </td><td> 114 mM </td><td> 4 l </td><td> Sigma / Aldrich </td><td> M3148 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Diferenciação Media. 2. preparação de células EB à infecção pelo Vírus <ol><li> Na fase de desenvolvimento desejado (entre o dia 2 e dia 3), transfira as EBs do 10 centímetros de Petri para tubo de 15 ml. Lava-se a placa com 5 ml de PBS e adicionar a lavagem para o tubo cónico. </li><li> Agregar as CEs a 315 xg à temperatura ambiente durante 5 min. Lave as células EB com 5 ml de PBS. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de separação de células descongelado (contendo enzimas proteolíticas e colagenolíticas) e colocar os tubos num banho de água a 37 C ° (incubadora) ou durante 30 minutos com occagitação asional (a partir de um movimento súbito ou luz vórtice). </li><li> Adicionar 1 ml de mídia diferenciação. Pipeta cima e para baixo com uma pipeta 2 ml com uma ponta de pipeta p200. Colocar o tubo em banho-maria a 37 ° C de novo durante 30-60 minutos. </li><li> Girar as células a 315 xg durante 5 min e lava-se as células com PBS. </li></ol> Infecção 3 Vírus <ol><li> Ressuspender as células em 1,5 ml de meio de diferenciação. Transferência da suspensão de células para uma de 6 poços de cultura de tecidos não-placa tratada. </li><li> Prepare a retrovírus por técnicas convencionais antes do tempo. Adicionar 5 a 100 mL de sobrenadante virai para células dependendo título viral. Não adicione polibrene para melhorar a infecção, pois isso inibe a reforma posterior da EBS. </li><li> Spinoculate as células com o vírus por centrifugação a 2120 xg durante 90 min à temperatura ambiente. </li></ol> 4. Diferenciando virais células EB infectados em gotas de suspensão <ol><li> Adicionar 2 ml de meio de diferenciação em cada poço de infected EB suspensão de células. </li><li> Pipetar 3,5 ml de suspensão de células infectadas em EB um reservatório de reagente estéril para multipipettors. Utilizar a pipeta de multipipettor 15-20 filas de oito 20 ul gotas sobre a tampa invertida da placa de Petri 15 centímetros. </li><li> Adicionar 10 ml de PBS estéril ou água para a metade inferior da placa de Petri. Em seguida, inverter a tampa com as gotas e coloque sobre a placa de Petri. Certifique-se de que as gotas estão pendurados de cabeça para baixo a partir da tampa com PBS ou água abaixo para manter a câmara úmida. </li><li> Coloque os pratos no 37 ° C tecido cultura incubadora com 5,0% de CO 2. </li><li> Após 2 dias, recolher EB formadas na suspensão, invertendo a tampa cai e lavagem com 4,5 mL de meios de diferenciação. <ol><li> Transferência de Mídia e EBS para uma nova cultura 10 centímetros não-tecido placa de Petri. Lava-se a tampa, uma vez mais com 3 ml de meio de diferenciação e de transferência para a placa de 10 cm. </li></ol></li><li> Células colheita para análise por citometria de fluxo depois de um total de 8dias de cultura a partir da transferência inicial de células de mídia diferenciação (-LIF). </li></ol> 5. As células que se preparam para Análise de Fluxo Cytometer <ol><li> Transferir as células para um tubo de 15 ml com uma pipeta de 10 ml. Lava-se a placa com 5 ml de PBS e transferir para o mesmo tubo cónico. </li><li> Células de pellets em 315 x g. Lave pellets com 10 ml PBS. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de separação de células descongelada e colocar os tubos num banho de água a 37 C ° durante 30 min, com agitação ocasional. Para a detecção de alguns antigénios de superfície celular, a tripsina pode ser usado em substituição. </li><li> Adicionar 1 ml de mídia de diferenciação e pipeta cima e para baixo com uma pipeta de 2 ml. Utilizar uma ponta de p200 para a ponta da pipeta para ajudar a quebrar-se digerido EB em suspensão de célula única. <ol><li> Colocar o tubo num banho de água a 37 ° C de novo durante 60 minutos a fim de que as proteínas de membrana integrais para reciclar para a superfície da célula. </li></ol></li><li> Sedimentar as células a 315 xg durante 5 min. </li><li> Lave o wi célulasth 0,1% Albumina de soro bovino Fracção V (BSA) preparada em PBS (PBS / BSA) e incuba-se as células com anticorpos específicos fluorescente etiquetado. </li></ol> 6 Análise do Fluxo Citometria de Progenitores hematopoiéticos <ol><li> Colocam-se 10 6 células EB derivados em 5 ml 12 x 75 mm redondo tubo inferior. Para ajustar as definições de compensação citômetro de fluxo, use esferas de compensação de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Células de pellets em 315 x g. Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet em solução de PBS / BSA residual no tubo. </li><li> Para detectar ESC HPCs, incubar as células com anticorpos fluorescentes rotulado: anti-rato CD41-PE (R-Phycoerytherin) e anti rato-CD117 (c-kit) -APC / Cy7 (aloficocianina Cyanine 7). <ol><li> Dilui-se os anticorpos 1: 100 em PBS / BSA. Adicionar 100 ul de anticorpo diluído em cada amostra. Determine a diluição correta de anticorpos para cada fornecedor, clone, e muito ou anticorpo. Determinar a diluição óptima para a marcação de células individualmente. </li&gt; </ol></li><li> Incubar as amostras em gelo no escuro durante 30 min. </li><li> Adicionar 2 ml de células de PBS / BSA e pelotas a 315 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e pellet ressuspender em 300 mL de PBS ou outro tampão isotônica. </li><li> Filtrar ressuspensas células através de um coador de células tampão (0,35 M) para remover grandes agregados celulares. </li><li> Analise as células em um citômetro de fluxo. </li></ol>

<ol><li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukaemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies%3A+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+physiology%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Experimental physiology. 85, 645-651 (2000).</li>
<li>Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies.</a> Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).</li>
<li>Tian, X., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+towards+hematopoietic+cells%3A+progress+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells towards hematopoietic cells: progress and pitfalls.</a> Curr Opin Hematol. 15, 312-318 (2008).</li>
<li>Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+by+gene+targeting+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells.</a> Cell. 51, 503-512 (1987).</li>
<li>Mansour, S. L., Thomas, K. R., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+proto-oncogene+int-2+in+mouse+embryo-derived+stem+cells%3A+a+general+strategy+for+targeting+mutations+to+non-selectable+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes.</a> Nature. 336, 348-352 (1988).</li>
<li>Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ-line+transmission+of+genes+introduced+into+cultured+pluripotential+cells+by+retroviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector.</a> Nature. 323, 445-448 (1986).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Pfeifer, A., Ikawa, M., Dayn, Y., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+by+lentiviral+vectors%3A+lack+of+gene+silencing+in+mammalian+embryonic+stem+cells+and+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transgenesis by lentiviral vectors: lack of gene silencing in mammalian embryonic stem cells and preimplantation embryos.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 2140-2145 (2002).</li>
<li>Smith-Arica, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+efficiency+of+human+and+mouse+embryonic+stem+cells+using+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+stem+cells%22%5BJournal%5D)">Infection efficiency of human and mouse embryonic stem cells using adenoviral and adeno-associated viral vectors.</a> Cloning and stem cells. 5, 51-62 (2003).</li>
<li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22, 531-543 (2004).</li>
<li>Cook, B. D., Liu, S., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad1+signaling+restricts+hematopoietic+potential+after+promoting+hemangioblast+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Smad1 signaling restricts hematopoietic potential after promoting hemangioblast commitment.</a> Blood. 117, 6489-6497 (2011).</li>
<li>Zafonte, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad1+expands+the+hemangioblast+population+within+a+limited+developmental+window%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Smad1 expands the hemangioblast population within a limited developmental window.</a> Blood. 109, 516-523 (2007).</li>
<li>Kyba, M., Perlingeiro, R. C., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HoxB4+confers+definitive+lymphoid-myeloid+engraftment+potential+on+embryonic+stem+cell+and+yolk+sac+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HoxB4 confers definitive lymphoid-myeloid engraftment potential on embryonic stem cell and yolk sac hematopoietic progenitors.</a> Cell. 109, 29-37 (2002).</li>
<li>Galvin, K. E., Travis, E. D., Yee, D., Magnuson, T., Vivian, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+signaling+regulates+the+bone+morphogenic+protein+pluripotency+pathway+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nodal signaling regulates the bone morphogenic protein pluripotency pathway in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 285, 19747-19756 (2010).</li>
<li>Ismailoglu, I., Yeamans, G., Daley, G. Q., Perlingeiro, R. C., Kyba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodermal+patterning+activity+of+SCL%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mesodermal patterning activity of SCL.</a> Exp Hematol. 36, 1593-1603 (2008).</li>
<li>Kyba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+hematopoietic+differentiation+of+embryonic+stem+cells+conditionally+expressing+Stat5%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced hematopoietic differentiation of embryonic stem cells conditionally expressing Stat5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11904-11910 (2003).</li>
<li>Cao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-23a+regulates+TGF-beta-induced+epithelial-mesenchymal+transition+by+targeting+E-cadherin+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">MiR-23a regulates TGF-beta-induced epithelial-mesenchymal transition by targeting E-cadherin in lung cancer cells.</a> Int J Oncol. 41, 869-875 (2012).</li>
<li>Chan, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+antagonism+between+PDGF+and+the+TGFbeta+family+of+signalling+pathways+by+control+of+miR-24+expression%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for antagonism between PDGF and the TGFbeta family of signalling pathways by control of miR-24 expression.</a> EMBO J. 29, 559-573 (2010).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+miR-23a+approximately+27a+approximately+24+decreases+transforming+growth+factor-beta-induced+tumor-suppressive+activities+in+human+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Upregulation of miR-23a approximately 27a approximately 24 decreases transforming growth factor-beta-induced tumor-suppressive activities in human hepatocellular carcinoma cells.</a> Int J Cancer. 123, (2008).</li>
<li>Min, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-associated+miR-27a+inhibits+dendritic+cell-mediated+differentiation+of+Th1+and+Th17+cells+by+TAB3%2C+p38+MAPK%2C+MAP2K4+and+MAP2K7%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Immun%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-associated miR-27a inhibits dendritic cell-mediated differentiation of Th1 and Th17 cells by TAB3, p38 MAPK, MAP2K4 and MAP2K7.</a> Genes Immun. 13, 621-631 (2012).</li>
<li>Mikkola, H. K., Fujiwara, Y., Schlaeger, T. M., Traver, D., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD41+marks+the+initiation+of+definitive+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Expression of CD41 marks the initiation of definitive hematopoiesis in the mouse embryo.</a> Blood. 101, 508-516 (2003).</li>
<li>Mitjavila-Garcia, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD41+on+hematopoietic+progenitors+derived+from+embryonic+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Expression of CD41 on hematopoietic progenitors derived from embryonic hematopoietic cells.</a> Development. 129, 2003-2013 (2002).</li>
<li>Warr, M. R., Pietras, E. M., Passegue, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+controlling+hematopoietic+stem+cell+functions+during+normal+hematopoiesis+and+hematological+malignancies.+Wiley+interdisciplinary+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Systems+biology+and+medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions during normal hematopoiesis and hematological malignancies. Wiley interdisciplinary reviews.</a> Systems biology and medicine. 3, 681-701 (2011).</li>
<li>Dahl, R., Ramirez-Bergeron, D. L., Rao, S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spi-B+can+functionally+replace+PU.1+in+myeloid+but+not+lymphoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Spi-B can functionally replace PU.1 in myeloid but not lymphoid development.</a> Embo J. 21, 2220-2230 (2002).</li>
<li>Dahl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+macrophage+and+neutrophil+cell+fates+by+the+PU.1%3AC%2FEBPalpha+ratio+and+granulocyte+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of macrophage and neutrophil cell fates by the PU.1:C/EBPalpha ratio and granulocyte colony-stimulating factor.</a> Nat Immunol. 4, 1029-1036 (2003).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros competitivos para divulgar.

Como discutido acima, os clones do CES por indução que expressam um gene de interesse pode ser gerada usando sistemas de doxiciclina, no entanto, a geração destas linhas é demorado e trabalhoso. Descrito no presente protocolo é um método de expressar um gene de interesse em suspensão de células individuais preparados a partir de derivados CES CEs. Estas células infectadas são então reformada em EBs por enforcamento queda para examinar diferenciação subseqüente. No exemplo (Figura 3), é mostrado que a ex...

As células-tronco embrionárias murinas (CTEs) são pluripotentes, permanecendo indiferenciadas e auto-renovadas na presença da citocina Fator Inibidor da Leucemia (LIF)1. Após a retirada do LIF, eles se diferenciarão espontaneamente em estruturas tridimensionais (3D) chamadas corpos embrióides (EBs)2. A arquitetura 3D permite o desenvolvimento das três camadas germinativas ectoderma, endoderme e mesoderma, que posteriormente dão origem a tipos de tecidos maduros3. As CTEs são um modelo excepcional para elucidar os mecanismos moleculares de diferenciação celular, particularmente a investigação do desenvolvimento de células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) precoces4. 
A expressão gênica em ESCs pode ser manipulada por várias técnicas que permitem a determinação de um papel para moléculas individuais no desenvolvimento. Uma das técnicas mais comuns é usar a recombinação homóloga para gerar linhagens ESC, que não possuem um gene de interesse5,6. Há também uma série de técnicas que têm sido usadas para superexpressar genes. A primeira técnica utilizada para modificar a expressão gênica em CTEs foi infectá-las com retrovírus recombinantes7,8. O gene de interesse, no entanto, é frequentemente silenciado à medida que as ESCs se diferenciam em tipos de células progenitoras e maduras. O uso de lentivírus tem sido bem-sucedido em limitar o silenciamento de genes expressos viralmente9. Outros vetores virais usados para superexpressão incluem adenovírus e vírus adeno-associados10. Além disso, técnicas de transfecção padrão para introduzir plasmídeos de expressão de forma estável são amplamente utilizadas para a expressão do transgene ESC11. Uma dificuldade com esses sistemas é que muitas vezes a expressão de um gene específico tem efeitos diferentes dependendo de sua expressão temporal. Por exemplo, a proteína Smad1 afeta o desenvolvimento de células hematopoiéticas de maneira diferente durante diferentes estágios do desenvolvimento da EB12,13. 
Este problema pode ser contornado pela geração de ESCs que inducivelmente expressam um gene de interesse. O sistema mais comum para expressar inducivelmente transgenes em ESCs usa o operon de resistência à tetraciclina de E. coli (Escherichia coli). Vários sistemas diferentes de tetraciclina foram desenvolvidos. Uma das estratégias mais populares foi desenvolvida por Kyba e colegas14. Eles geraram uma linha ESC (Ainv15), que possui o gene transativador reverso de tetraciclina inserido no locus ROSA26 constitutivamente ativo. Um elemento de resposta à tetraciclina (TRE), um sítio LoxP a jusante (locus de X-over P1 do bacteriófago P1) e um de neomicina sem promotor foram introduzidos no locus HPRT (hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase) no cromossomo X. Usando uma abordagem de recombinação CRE, um gene de interesse junto com um promotor eucariótico para impulsionar a expressão do gene de resistência à neomicina pode ser inserido no local LoxP. As ESCs direcionadas corretamente são isoladas pela seleção G418. Esses clones direcionados devem ser testados quanto à expressão induzível por doxiciclina (ou tetraciclina) do transgene. Essa abordagem gerou com sucesso linhas ESC que expressam indubitavelmente HoxB4, Stat5, SCL e Smad714-17. No entanto, a geração dessas linhagens celulares induzíveis é demorada. Descrito aqui é um método para desagregar corpos embrióides derivados de ESC (EBs) em suspensões unicelulares, infectar retroviralmente as suspensões celulares em diferentes dias de desenvolvimento e, em seguida, reformar os EBs por gota pendurada. A diferenciação a jusante é posteriormente avaliada por citometria de fluxo. Neste artigo, é mostrado um exemplo de como a expressão de miRNAs em células derivadas de EB afeta a diferenciação hematopoiética. Este método é útil para investigar o papel dos genes após a derivação do tecido específico da camada germinativa.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>&#946;-mercaptoetanol</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>FBS (ES Screened)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03E</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Defined)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>LIF ESGRO</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>ACCUMAX</td><td>Millipore</td><td>SCR006</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Placas de Cultura de Tecidos 6- poço</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Placas não tratadas 6 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri Falcon 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri Falcon 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-148</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 5 ml com tampa de filtro de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>Reservatórios estéreis brancos</td><td>EUA Scientific</td><td>111-0700</td><td></td></tr><tr><td>Rato anti-rato CD41 PE-conjugado</td><td>Biolegend</td><td>133906</td><td></td></tr><tr><td>Rato anti-rato CD117 APC/CY7-conjugado</td><td>Biolegend</td><td>105826</td><td></td></tr><tr><td>RW4 ESCs</td><td>ATCC</td><td>CRL-12418</td><td></td></tr></tbody></table>

retroviral infecção murina embryonic stem cell derived cells embrioides corpo de análise da diferenciação hematopoética

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

As células-tronco embrionárias (ESCs) são um excelente modelo para elucidar os mecanismos moleculares de diferenciação celular. Eles são especialmente úteis para investigar o desenvolvimento de células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) precoces. A expressão gênica em ESCs pode ser manipulada por várias técnicas que permitem determinar o papel de moléculas individuais no desenvolvimento. Uma dificuldade é que a expressão de genes específicos geralmente tem efeitos fenotípicos diferentes, dependendo de sua expressão temporal. Esse problema pode ser contornado pela geração de ESCs que inducivelmente expressam um gene de interesse usando tecnologia como o sistema transgênico induzível por doxiciclina. No entanto, a geração dessas linhagens celulares induzíveis é cara e demorada. Aqui está descrito um método para desagregar corpos embrióides (EBs) derivados de ESC em suspensões unicelulares, infectando retroviralmente as suspensões celulares e, em seguida, reformando os EBs por gota suspensa. A diferenciação a jusante é então avaliada por citometria de fluxo. Usando este protocolo, foi demonstrado que a expressão exógena de um gene de microRNA no início da diferenciação ESC bloqueia a geração de HPC. No entanto, quando expresso em células derivadas de EB após a produção do mesoderma nascente, o gene do microRNA aumenta a diferenciação hematopoiética. Este método é útil para investigar o papel dos genes após a derivação do tecido específico da camada germinativa.

Nestes estudos gelatinizadas RW4 (derivado de 129X1 / SvJ rato tensão) CES foram utilizados. EB foram isolados em 3 dias de diferenciação. Para melhores resultados, os CEs deve ser de forma esférica e não aderentes (Figura 1A, B). Após spinoculation com vírus que co-expressam a GFP marcador fluorescente, juntamente com um gene de interesse, EB foram reformada pelo método de gota suspensa. EB foram reformados com sucesso a partir de suspensões de células preparadas a partir de 2,0, 2,5 e 3,0 dias CEs. No...

A manipulação da expressão gênica temporal na diferenciação de células-tronco embrionárias (ESCs) pode ser alcançada usando sistemas gênicos induzíveis. No entanto, a geração dessas linhagens celulares é cara e demorada. Este protocolo alcança a expressão rápida de um transgene na diferenciação de células derivadas de ES e subsequente análise da diferenciação hematopoiética a jusante.

Retroviral Infecção murina Embryonic Stem Cell Derived Cells embrioides corpo de Análise da diferenciação hematopoética

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

O objetivo geral deste procedimento é examinar como a expressão de um gene em diferentes momentos durante a diferenciação de células-tronco embrionárias afeta a diferenciação hematopoiética. Após a transdução do corpo embrionário, a suspensão unicelular por centrifugação dos corpos embrionários é reformada por gota suspensa e cultivada para permitir uma maior diferenciação em células hematopoiéticas. Em seguida, suspensões unicelulares dos corpos embrionários reformados são preparadas, incubadas com anticorpos conjugados com fluorocromo e analisadas em um citômetro de fluxo para diferenciação hematopoiética.Em última análise, este método demonstra se a expressão de um gene durante a diferenciação de células-tronco embrionárias afeta o desenvolvimento hematopoiético. É especialmente útil para demonstrar papéis para genes que só podem estar ativos após a formação de tecido embrionário inicial. Assim, das técnicas comuns para expressar um gene aventureiro em diferentes momentos durante a diferenciação de células-tronco embrionárias requer a geração de linhagens de células-tronco embrionárias e induzível expressar um gene de interesse com indutores como a doxiciclina.A geração dessas l

retroviral-infection-murine-embryonic-stem-cell-derived-embryoid-body

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo detalhes a derivação de células-tronco hematopoéticas para transplante de células-tronco embrionárias de rato (ESC) e sua posterior injeção em camundongos letalmente irradiados destinatário. Brevemente, ESC são diferenciados como corpos embrióides, que depois são infectadas com HoxB4 retroviral e co-cultivados com células do estroma OP9 e citocinas hematopoiéticas.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Este protocolo descreve os métodos na construção de um modelo humanizado de camundongo medula óssea/fígado/timo com imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPC) derivam de células endoteliais especializadas (hegemônicos) durante o desenvolvimento, mas pouco se sabe sobre o processo pelo qual algumas células endoteliais especificar a tornar-se sangue formando. Nós demonstramos um método baseado citometria de fluxo que permite o isolamento de células endoteliais em simultâneo hegemônicos e HSPC de tecidos embrionários de murídeo.

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

Apresentamos um protocolo rápido e flexível para um único sistema de expressão in vivo baseado em receptor de células T (TCR) retroviral.  Vetores retrovirais são usados para transduzir células progenitoras da medula óssea para estudar o desenvolvimento de células T e a função de um único TCR in vivo como uma alternativa aos camundongos transgênicos TCR.

Transdução retroviral de Células de Medula Óssea progenitoras para gerar células T Receptor Retrogenic Mice

O protocolo descrito aqui detalha a indução de um programa hemogênico em fibroblastos embrionários de camundongos por meio da superexpressão de um conjunto mínimo de fatores de transcrição. Essa tecnologia pode ser traduzida para o sistema humano para fornecer plataformas para estudos futuros de hematopoiese, doenças hematológicas e transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Reprogramação do rato embrionárias fibroblastos com Fatores de transcrição para induzir um Programa hegemônicos

Nós descrevemos uma técnica para usar células-tronco embrionárias murinas para gerar dois ou três corpos embrióides dimensionais. Em seguida, explicar como induzir a diferenciação neuronal das células do corpo embrióides por ácido retinóico, e como para analisar o seu estado de diferenciação por imunofluorescência marcador de células progenitoras e imunotransferência.

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

Aqui apresentamos um protocolo para a supressão efetiva da replicação do vírus da hepatite B (HBV) em camundongos utilizando a transferência de células adotivas (ACT) de linfócitos T específicos de antígenos virais derivados de células-tronco (AG). Este procedimento pode ser adaptado para a imunoterapia baseada em ACT potencial da infecção por HBV.

Células-tronco derivadas virais AG-specific T da haste suprimir a replicação de HBV em ratos

Aqui descrevemos um método de superexpressão retroviral e transferência adotiva de células murine B-1a para examinar a migração e localização celular in vivo B-1a. Este protocolo pode ser estendido para diversos ensaios funcionais a jusante, incluindo quantificação da localização celular do doador B-1a ou análise de fatores secretos derivados de células doadoras pós-transferência adotiva.

Superexpressão retroviral de CXCR4 em células Murine B-1a e transferência adotiva para migração de células B-1a direcionadas para a produção de medula óssea e igM

Aprenda a analisar a diferenciação hematopoética em células-tronco embrionárias murinas usando infecção retroviral e citometria de fluxo. Este método permite estudar o efeito temporal da expressão gênica no desenvolvimento sanguíneo.

Retroviral Infecção murina Embryonic Stem Cell Derived Cells embrioides corpo de Análise da diferenciação hematopoética

Explorar mais vídeos