Name: A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a analisar simultaneamente neurônios e vasos sanguíneos em culturas de fatias organotípicas entorrino-hipocampais para estudar lesão cerebral isquêmica. Este método permite investigar remodelação neurovascular.

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Este trabalho foi financiado pela Universidade de Basel, Departamento de Biomedicina, ea National Science Foundation suíço (31003A_141007). Markus Saxer prestou apoio técnico.

Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Directiva do Conselho Comunidades Europeias de 22 de Setembro de 2010 (2010/63 / UE) e foram analisados ​​e autorizados pelas autoridades suíças. 1 Configurando culturas fatia Organotípicas Entorhino-hipocampo <ol><li> Prepare entorhino-hipocampal culturas organotípicas (EHOSCs) de pós-natal filhotes dia 4 (P4) do mouse usando o método de incubação 4,11 estática. Aqui, utilizam ratinhos C57BL6 e CB6F1. <ol><li> Tome cerca de 30 min por rato filhote para a preparação de culturas fatia, ou seja, 3 horas para uma ninhada de seis filhotes de rato. Realizar todas as etapas em condições estéreis em uma bancada de fluxo laminar com instrumentos cirúrgicos esterilizados. </li><li> A fim de evitar uma possível interferência a partir da posição do corte ao longo do eixo do septo-temporal, usar apenas o hipocampo fatias de metade do septo. Se não for indicado de outra forma, realizar todos os passos à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Corte tele cabeça de um filhote de cachorro P4 rato com uma tesoura cirúrgica. Sem anestesia é necessário para este passo. <ol><li> Remover o crânio em volta do cérebro e identificar a fenda entre a extremidade caudal dos hemisférios cerebrais e mesencéfalo. Cuidadosamente remover a parte do cérebro para rostral do mesencéfalo do crânio e colocá-lo no meio de preparação de gelado consistindo em MEM suplementado com uma forma estabilizada de L-glutamina. </li></ol></li><li> Continue a dissecção sob microscópio estereoscópico com o cérebro estar imerso no gelo médio preparação frio. Remover meninges remanescentes dos hemisférios corticais. Identificar o hipocampo na superfície caudal medial do hemisfério e separá-lo em conjunto com o córtex entorrinal adjacente do resto do cérebro. <ol><li> Transferir o tecido de um cortador de tecido e cortado 400 um de espessura, sob condições assépticas, transversal ao eixo septo-temporal do hipocampo. </li></ol></li><li> Coloque as fatias sobre ceinserções de cultura II (aproximadamente 6 fatias por pastilha) e incubar em placas de 6 poços com 1 ml por poço de meio de incubação (47 ml de MEM, 25 ml de Meio Eagle, 25 ml de soro de cavalo, 1 ml I glutamax, 1 ml de uma solução estéril de glicose a 10%, pH 7,3) numa atmosfera húmida com 5% de CO 2, a 37 ° C. Troca da mídia no dia seguinte e, em seguida, a cada dois dias até uma semana. </li></ol> 2 In Vitro hipóxia e oxigênio-glicose Privação com reperfusão <ol><li> Ver Tabela 1 para um horário exato momento do procedimento. EHOSCs de cultura para 5 dias (DIV5) antes da exposição a hipoxia ou POG. Neste ponto de tempo mudar a forma de meio de incubação contendo 25% de soro de cavalo para meio isento de soro, com a seguinte composição: meio Neurobasal com suplemento B27 a 2%, 1% de glucose e glutamax adicional de 0,1%. </li><li> Preparar o meio OGD como detalhado em 7 de referência .As concentrações finais dos componentes é a seguinte: 0,3mM de CaCl2, 70 mM de NaCl, 5,25 mM de NaHCO3, 70 mM de KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 2 mM de MgSO4 e 10 mM de sacarose a pH 6.8. Adicionar 1 ml de meio a cada poço OGD de duas placas de cultura de tecidos de 6 poços. <ol><li> Perfundir a forma OGD com N 2 durante 1 hora, em uma câmara de hipoxia e, em seguida, vedar e manter S / N em uma incubadora a 37 ° C. </li><li> Use tiras de anaeróbios como indicadores de hipóxia. Considere o meio estar livre de oxigénio quando a cor das tiras mudou de rosa para branco. </li><li> Para a indução da hipóxia, utilizar meio isento de soro com glucose, em vez de meio de OGD. Antes da utilização, o meio de perfundir com N 2, em uma câmara de hipoxia como descrito acima para o meio de OGD. </li></ol></li><li> Antes de as fatias são expostas a OGD, perfundir a forma OGD novamente com N 2 durante 30 min. Adicionar 2 mL de uma solução 1 mg / ml de iodeto de propídio (PI) de solução por cavidade (para uma concentração final de 2 ug / ml) para as fatias, durante 30 min e seleccionarapenas fatias saudáveis ​​para experimentação, conforme indicado por um reduzido número de células positivas para PI. </li><li> Utilizar o modelo de exposição OGD e reperfusão indicado na Figura 1. Privar fatias de oxigénio ou apenas (hipoxia) ou de oxigénio e glicose (POG), durante 15 min. <ol><li> Para a indução de hipoxia ou OGD, transferir as fatias em forma OGD e manter por 15 minutos em câmara de hipóxia. Certifique-se de que todos os fluidos que permanecem nos lados da peça inserta são aspirados para longe quando as culturas são comutados de forma regular para OGD médio e para trás. </li><li> Após a hipoxia ou OGD, substituir o meio de OGD com meio isento de soro e oxigenado culturas são deixados a recuperar durante 3, 24 ou 48 horas em meio isento de soro na incubadora normal a 37 ° C com 5% de CO 2. Adicionar PI novamente antes da fixação para a determinação da morte celular. </li></ol></li></ol> 3. tratamentos farmacológicos de Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia <ol><li> Culture EHOSCs durante 5 dias (DIV5) em meio de incubação antes de exposição a tratamentos farmacológicos. Iniciar os tratamentos farmacológicos ou durante ou imediatamente após a OGD OGD quando fatias são transferidas para meio isento de soro. </li><li> Tratamentos para proteção contra POG. <ol><li> Adicionar 100 | iM 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2.3-diona (CNQX) ou 1 uM a tetrodotoxina (TTX) ao meio de cultura durante a indução OGD (durante 15 min) ou imediatamente após a indução OGD durante 30 min. Em seguida, incuba-se meio isento de soro durante 48 horas normóxica antes da fixação. </li></ol></li><li> Os tratamentos para a indução da morte excitotóxica. <ol><li> Após 5 dias de incubação em culturas de meio interruptor para meio isento de soro contendo 100 uM (RS) -α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico ácido (AMPA), durante 30 min. </li><li> Retire o meio de cultura contendo AMPA por aspiração (ter o cuidado de remover qualquer meio residual em inserções), em seguida, transferir as fatias para placas novas com acesso médio e soro normalmantê-los por 48 horas, até a fixação. </li></ol></li></ol> 4. Fixação e Imunocoloração de Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia <ol><li> O iodeto de propídio (PI) a coloração. <ol><li> Adicionar PI durante 30 min para o meio de cultura de fatias de vida, a uma concentração de 2 ug / ml. Ver culturas vivas com um microscópio invertido equipado com óptica de fluorescência e selecione fatias para mais tratamentos. Para a coloração de PI em combinação com imuno-histoquímica, adicionar solução de PI 30 min antes da fixação das culturas. </li></ol></li><li> A fixação das fatias. <ol><li> Remover o meio de cultura da placa de 6 poços e adicionar 3 ml de preparado de fresco a 4% de paraformaldeído (PFA) a cada poço. Em seguida, colocar a placa de 6 cavidades em uma geladeira e fixar O / N a 4 ° C. </li><li> Remover a solução de PFA no dia seguinte e as fatias de lavar 3-4 vezes com tampão fosfato salino (PBS). </li></ol></li><li> A remoção das fatias a partir da cultura de células insert e procedimento de bloqueio para imuno-histoquímica de secções de livre flutuação. <ol><li> Retirar cuidadosamente e retire as fatias das inserções de cultura utilizando uma arte pincel do tamanho 0 ou menor. Transferir cada faixa individual num poço de uma placa de 96 poços preenchidos com tampão de bloqueio (PBS com 3% de soro de cabra normal (NGS) e 2% de Triton-X100). Manter as fatias em tampão de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente, sob agitação constante por um agitador orbital. </li></ol></li><li> A imunocoloração das culturas de fatias <ol><li> Para a marcação dos vasos sanguíneos usar policlonal anti-laminina a uma diluição de 1: 200 em PBS contendo 1% NGS e 0,5% de Triton-X100. </li><li> Para os neurónios rotulagem utilizar anti-microtúbulo associado proteína 2 (MAP2), a uma diluição de 1: 500 em PBS contendo 1% NGS e 0,5% de Triton-X100. </li><li> Incubar as fatias com anticorpos primários durante 48 horas a 4 ° C com agitação constante. Após o período de incubação, lavá-las em PBS com 0,5% Triton-X100 em 3-4 vezes. </li&gt; <li> Dilui-se anticorpos secundários 1: 500 em PBS contendo 1% NGS e 0,5% de Triton-X100. Incubar as fatias durante 2 horas à temperatura ambiente no escuro, com os anticorpos secundários conjugados com Alexa fluoróforo. Use de cabra anti-coelho adequado ou anticorpo secundário de cabra anti-ratinho conjugado com Alexa 350 ou 488. </li><li> Remover a solução de anticorpo secundário e lava-se as fatias de três vezes com solução salina tamponada com Tris (TBS); montá-los em lâminas de vidro e lamela as lâminas com Mowiol. </li></ol></li><li> Microscopia das fatias coradas </li><li> Ver as fatias manchadas ou em um microscópio padrão com equipamentos de epifluorescência ou com um microscópio confocal. Tire fotos com uma câmera apropriada. Para algumas imagens, inverter o contraste de fluorescência, a fim de produzir vasos com uma coloração escura sobre um fundo claro (Figuras 5 e 6). </li></ol> 5 Determinação da densidade de vasos Regional nas culturas <ol><li> Quantificar o vessel com base na densidade de vasos passagens como descrito na Referência 8. </li><li> Use fatias manchadas para laminina para essas medições. Sobreponha as imagens gravadas de aumento de 10x com uma grade 6 x 6, onde cada grade é igual a 100 x 100 mm por metro quadrado, área total de 0,25 milímetros 2. </li><li> Sobreposição três dessas redes na região CA1, CA3, DG, e CE (Figura 2). Conte as embarcações que cruzam as linhas do grid. </li><li> Para a obtenção de resultados com uma boa relevância estatística, fazer medições em pelo menos três experiências independentes, cada uma das quais os dados a partir de 3 filhotes de rato com três fatias por ratinho filhote. </li><li> Determine o valor médio das passagens de navio da grades para cada região e realizar uma análise estatística por ANOVA com correção de Bonferroni como post hoc teste (p &lt;0,05 considerada significativa), utilizando software estatístico adequado. </li></ol>

<ol><li>Turner, R. C., Dodson, S. C., Rosen, C. L., Huber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+cerebral+ischemia+and+the+quest+for+neuroprotection%3A+navigating+past+failure+to+future+success%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">The science of cerebral ischemia and the quest for neuroprotection: navigating past failure to future success.</a> J Neurosurg. 118, 1072-1085 (2013).</li>
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<li>De Jong, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+hypoperfusion+yields+capillary+damage+in+the+hippocampal+CA1+area+that+correlates+with+spatial+memory+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebral hypoperfusion yields capillary damage in the hippocampal CA1 area that correlates with spatial memory impairment.</a> Neuroscience. 91, 203-210 (1999).</li>
<li>Cavaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+variation+in+brain+capillary+density+and+vascular+response+to+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Regional variation in brain capillary density and vascular response to ischemia.</a> Brain Res. 910, 81-93 (2001).</li>
<li>Chip, S., Nitsch, C., Wellmann, S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfield-specific+neurovascular+remodeling+in+the+entorhino-hippocampal-organotypic+slice+culture+as+a+response+to+oxygen-glucose+deprivation+and+excitotoxic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Subfield-specific neurovascular remodeling in the entorhino-hippocampal-organotypic slice culture as a response to oxygen-glucose deprivation and excitotoxic cell death.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 33, 508-518 (2013).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
</ol>

Experimentos em animais foram realizados de acordo com a Directiva do Conselho Comunidades Europeias de 24 de Novembro de 1986 (86/609 / CEE) e foram analisados ​​e autorizados pelas autoridades suíças. Os autores não têm nada a revelar.

Com os métodos aqui apresentados, hipocampo culturas organotípicas de fatias pode ser utilizado como uma ferramenta versátil para estudar alterações plásticas no tecido neural após a lesão. Enquanto as culturas organotípicas de fatias tenha sido utilizado no passado para o estudo de reacções neuronais após isquemia 6, 7, o novo aspecto do estudo simultâneo de alterações vasculares aumenta significativamente as aplicações potenciais do presente método. A indução de hipoxia ou OGD por si só pode ser aplicado po...

O sistema nervoso central é particularmente sensível a uma perda ou redução do fornecimento de oxigénio e glicose pela vasculatura. Mesmo um tanto curta interrupção do fornecimento de sangue para o cérebro pode induzir uma perda permanente da função das áreas cerebrais relevantes que levam às síndromes típicas tempos. Além da perda de neurônios nas áreas afetadas primários, há normalmente uma perda neuronal atraso adicional através de danos secundários. Infelizmente, até agora, nenhum tratamento neuroprotector para a redução da morte neuronal secundária estava disponível um. Os esforços de pesquisa para estudar os mecanismos de lesão secundária se baseiam na utilização de modelos animais de isquemia cerebral como a oclusão da artéria cerebral média e de várias técnicas de oclusão trombótica (para uma revisão recente ver 2). Em paralelo, também devido a limitações e preocupações éticas com o uso de modelos animais, cultura fatia organotípica de vários tecidos do sistema nervoso central têm sido utilizados que permitam o study de reações neuronais para vários tipos de lesões 3-5. Para estudar a reacção neuronais sob condições que imitam a lesão cerebral isquémica, o sistema modelo de privação de oxigénio glicose (OGD) foi desenvolvido. Neste modelo, as culturas de fatia são temporariamente expostos a um meio que carece de glicose, tendo sido equilibrada com o gás de azoto na ausência de oxigénio. Com um tal tratamento, é possível induzir a lesão neuronal e perda, que é bastante semelhante ao observado após lesão isquémica in vivo de 6, 7. No hipocampo, um tal tratamento induz a perda neuronal em CA1 especificamente, mas não no área CA3 ou do giro dentado do hipocampo. Em contraste, o estudo de reacções vasculares em culturas de fatias até agora não tem sido amplamente realizadas. Uma razão óbvia é a falta de circulação e de vasos sanguíneos de perfusão no modelo de cultura de fatia. Contudo, mostrámos previamente que é possível manter bvasos Lood em CNS fatia culturas por vários dias 8, 9. O objetivo geral deste método é monitorar não só o destino dos neurônios após POG, mas estender o estudo para o destino e remodelação da vasculatura que é uma parte importante da resposta a uma lesão. Até agora, os estudos têm exigido a utilização de experiências com animais (De Jong et al, 1999;. Cavaglia et al, 2001.). No protocolo apresentado aqui, vamos detalhar como tais estudos podem ser feitos em culturas fatia organotypic entorhino-hipocampal desafiou tanto a hipóxia ou por lesões excitotóxicos seguida da análise de ambos os sobrevivência e vasos sanguíneos reações neuronais. Este protocolo é baseado em um estudo publicado anteriormente sobre o assunto 10 e pode ser útil para qualquer laboratório interessado em interações neurovasculares no SNC.

<table><tbody><tr><td>Meio Essencial Mínimo MEM</td><td>Gibco</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>forma estabilizada de L-glutamina</td></tr><tr><td>Inserções de cultura de células Millicell</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Meio basal Águia&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cavalo</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Tiras anaeróbicas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59886</td><td></td></tr><tr><td>Solução de iodeto de propídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>AMPA</td><td>R& D sistemas</td><td>0169-10</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>R& D systems</td><td>0190/10</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>R& D systems</td><td>1078/1</td><td></td></tr><tr><td>anti-laminina policlonal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab11267</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 350</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A11045</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-mouse 488</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-coelho 350</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>Alexa anti-coelho 488</td><td>Sondas Moleculares</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Software de estatísticas</td><td>GraphPad Software</td><td>GraphPad Prisma</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain helicóptero de tecidos</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de hipóxia</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr></tbody></table>

a análise de neurovascular remodelação em entorhino-hipocampal culturas organotípicas fatia

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Lesão cerebral isquêmica é uma das condições mais comuns e devastadoras que comprometem a função cerebral adequada e muitas vezes leva a persistir déficits funcionais nos pacientes afetados. Apesar dos esforços de pesquisa intensiva, ainda não existe uma opção de tratamento eficaz disponível, que reduz a lesão neuronal e protege os neurônios nas áreas isquêmicas da morte secundário atrasado. A investigação nesta área, tipicamente envolve a utilização de modelos animais e elaborados problemáticos. Culturas fatia organotípica Entorhino-hipocampal desafiados com privação de oxigênio e glicose (POG) são estabelecidos em modelos in vitro que mimetizam isquemia cerebral. O aspecto inovador deste estudo é que as alterações dos vasos sanguíneos do cérebro são estudadas, além de alterações neuronais ea reação tanto do compartimento neuronal e compartimento vascular podem ser comparados e correlacionados. Os métodos apresentados neste protocolo ampliar substancialmente as aplicações potenciais da ouabordagem da cultura fatia ganotypic. A indução de hipoxia ou OGD por si só pode ser aplicado por meios bastante simples em culturas organotípicas de fatias e leva a danos de confiança e reprodutível no tecido neural. Isto está em contraste com os experimentos em animais complexos e problemáticos induzindo acidente vascular cerebral e isquemia in vivo. Ao ampliar a análise para incluir o estudo da reação da vasculatura poderia fornecer novas maneiras de como preservar e restaurar as funções cerebrais. A abordagem da cultura fatia apresentado aqui pode se transformar em uma ferramenta atrativa e importante para o estudo da lesão isquêmica cerebral e pode ser útil para testar medidas terapêuticas potenciais com vistas a neuroproteção.

Oxygen privação de glicose e hipóxia induzir a morte neuronal e redução dos vasos sanguíneos, especificamente na região CA1 do hipocampo. OGD ou privação de oxigénio e durante 15 min, sozinho induziu uma forte indução de morte celular como observado por coloração com iodeto de propídio, especificamente na área CA1 do hipocampo (Figura 3), semelhante ao descrito anteriormente 7. Com marcadores para visualizar a rede de vasos sanguíneos, verificou-se que a densidade dos vasos sang...

Um protocolo para culturas fatia organotípica entorhino-hipocampal, que permite a reprodução de muitos aspectos da lesão cerebral isquêmica, é apresentado. Ao estudar as mudanças do neurovasculature além de alterações nos neurônios, este protocolo é uma ferramenta versátil para estudar mudanças plásticas no tecido neural após lesão.

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar simultaneamente as alterações de neurônios e vasos sanguíneos em um modelo de cultura de tecidos de lesão cerebral isquêmica. Isso é feito primeiro configurando culturas de fatias de hipocampo rinoceronte. O segundo passo é mimetizar a lesão cerebral isquêmica, expondo as culturas a condições hipóxicas.A etapa final é analisar e correlacionar a sobrevida neuronal e as alterações vasculares. Em última análise, uma abordagem in vitro baseada em culturas orgânicas de fatias de hipocampo é usada para mostrar as complexas interações entre os neurônios e a vasculatura em condições isquêmicas. A principal vantagem desta técnica é que, após um desafio hipóxico, a sobrevivência neuronal e as alterações dos vasos sanguíneos podem ser estudadas simultaneamente em um sistema modelo de cultura de fatias.Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuroisquemia, como revelar as complexas interações entre neurônios e vasculatura e as condições isquêmicas. Para começar, prepare-se, insira culturas de fatias organotípicas do hipocampo rinoceronte de pops de camundongos pós-natais. Depois de remover o crânio, identifique a fissura entre a extremidade cordal dos hemisférios cerebrais e o mesencéfalo.Remova cuidadosamente as partes do cérebro rostral ao mesencéfalo e coloque-o em meio de preparação gelado consistindo de MEM suplementado. Continue a dissecção sob um microscópio estéreo, mantendo o cérebro imerso no meio de preparação gelado. Remova as meninges restantes dos hemisférios corticais.Em seguida, identifique o hipocampo na superfície cordal medial do hemisfério e separe-o junto com o córtex RH adjacente do restante do cérebro. Transfira o tecido para um picador de tecidos e corte fatias de 400 mícrons de espessura transversais ao eixo temporal septal do hipocampo. Coloque as fatias em inserções de cultura de células e incube-as em placas de seis poços com um mililitro de meio de incubação em uma atmosfera umidificada.Troque o meio no dia seguinte e depois em dias alternados até uma semana Em seguida, prepare o meio OGD. Adicione um mililitro de meio OGD a cada poço de dois seis. Placas de cultura de tecidos de poço perfundem o meio OGG com nitrogênio por uma hora em uma câmara de hipóxia e antes de selar e armazenar durante a noite Em uma incubadora a 37 graus Celsius, use tiras anaeróbicas como indicadores hipóxicos.Considere o meio livre de oxigênio quando a cor das tiras muda de rosa para branco. Quando estiver pronto, selecione células saudáveis por iodeto de propídio ou coloração PI. Adicionar pi durante 30 minutos ao meio de cultura a uma concentração de dois microgramas por mililitro.Visualize as culturas vivas com um microscópio invertido equipado apenas com óptica de fluorescência. Fatias com poucas células marcadas, como mostrado aqui, devem ser selecionadas para estudos posteriores, fatias com muitas células marcadas, conforme mostrado aqui. Não deve ser usado para indução de OGD.Transfira as fatias para o meio OGD e mantenha por 15 minutos na câmara de hipóxia, certifique-se de que todos os fluidos que permanecem nas laterais do inserto sejam aspirados nas culturas do interruptor. Do meio regular para o meio OGD e vice-versa após o OGD, substitua o meio OGD por meio livre de soro oxigenado e permita que as culturas se recuperem por 3, 24 ou 48 horas. Em meio livre de soro, adicione pi novamente antes da fixação para a determinação da morte celular.Se o estudo exigir tratamentos farmacológicos, inicie-os durante o OGD ou imediatamente após, quando as fatias forem transferidas para o soro livre. Meio para coloração PI. Em combinação com imuno-histoquímica, adicionar a solução de IP 30 minutos antes da fixação das culturas.Depois de fixar as células durante a noite, remova a solução de PFA e lave as fatias três a quatro vezes. Com PBS, inicie o procedimento de bloqueio destacando cuidadosamente as fatias das inserções de cultura e transferindo-as para um poço de uma placa de 96 poços preenchida com tampão de bloqueio. Manter as fatias no tampão de bloqueio durante duas horas à temperatura ambiente, sob agitação constante por um agitador orbital.Depois de adicionar os anticorpos primários de escolha, incubar por 48 horas a quatro graus Celsius com agitação constante após o período de incubação. Lave-os em PBS com 0,5% Triton X 103 a quatro vezes. Em seguida, siga os procedimentos padrão em todo o anticorpo secundário antes de montar as seções de mancha em lâminas de vidro com lamínulas.Visualize as fatias coradas em um microscópio padrão com equipamento de epifluorescência ou com um microscópio confocal. Para algumas imagens, inverta o contraste de fluorescência para produzir vasos com coloração escura em um fundo brilhante usando fatias coradas para laminina. Imagens gravadas sobrepostas de ampliação de 10 x com uma sobreposição de grade de seis por seis três dessas grades na região ca um, CA três DG e DC.E contar os navios que cruzam as linhas da grade para obter resultados com boa relevância estatística. Faça medições de pelo menos três experimentos independentes, cada um incluindo dados de três puffs de camundongos com três fatias por filhote de camundongo. A comparação das culturas de controle com as tratadas revela que a hipóxia induz a morte neuronal e a perda de vasos sanguíneos na região do hipocampo.Nestes exemplos, a coloração PI é mostrada em vermelho e mesclada com a coloração de laminina em verde três horas após o tratamento da hipóxia, não há coloração PI visível e nenhuma alteração vascular é evidente. Após 24 horas, surge coloração PI e a perda de vasos sanguíneos também é evidente. Tanto a coloração IP quanto a perda de vasos sanguíneos tornam-se mais evidentes após 48 horas.A OGD sozinha induz perda neuronal e perda de vasos sanguíneos. Em cerca de uma aplicação de TTX ou CN QX evitou tanto a perda neuronal observada com a coloração PI quanto a perda de vasos sanguíneos revelada pelo tratamento com coloração com laminina com 100 micromolares A MPA por 30 minutos induziu perda neuronal generalizada na maioria das áreas do hipocampo, mas a perda de vasos sanguíneos permaneceu restrita à área CA um. A quantificação dos vasos sanguíneos confirma a perda seletiva na área de CA um.Após esse procedimento, tratamentos medicamentosos ou modificações genéticas podem ser realizados para identificar agentes neuroprotetores eficazes e entender melhor os mecanismos de remodelação vascular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar culturas semelhantes a hipocampos e induzir OGD seguido de análise da sobrevivência neuronal e alterações vasculares.

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O modelo de cultura organoptypic hipocampo é uma...

O modelo de Cultura organotípicas Hippocampal Slice para o exame das lesões neuronais

Nós descrevemos um método para preparar organotípicas fatias do hipocampo que pode ser facilmente adaptado a outras regiões do cérebro. Fatias de cérebro são colocadas em membranas porosas e meios de cultura está autorizado a formar uma interface. Este método preserva a arquitetura bruta do hipocampo para até duas semanas em cultura.

Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

Este protocolo descreve um ensaio fatia organotípicas otimizado para o cérebro pós-natal e imagens de alta resolução de lapso de tempo de migração neuroblastos no fluxo migratório rostral.

Um Ensaio Slice organotípicas para High-Resolution Imaging Time Lapse de migração neuronal no cérebro pós-natal

Uma técnica para estudar células NG2 e oligodendrócitos usando um sistema de cultura de fatias do prosencéfalo e cerebelo é descrita.  Este método permite o exame da dinâmica de proliferação e diferenciação de células dentro da linhagem de oligodendrócitos, onde o ambiente extracelular pode ser facilmente manipulado, mantendo a citoarquitetura do tecido.

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

Aqui nós descrevemos uma técnica para estudar a neurogênese pós-natal do hipocampo utilizando a técnica de cultura fatia organotípica. Este método permite a manipulação in vitro da neurogénese adulto e permite a aplicação directa de agentes farmacológicos para o hipocampo cultivadas.

Cultures Organotípicas fatia de Estudos de Pós-natal Neurogênese

Culturas de fatias hippocampal organotypic (OHSC) representam um modelo in vitro que simula a situação na vivo muito bem. Aqui descrevemos uma vibratome de base melhorada fatiar protocolo para obter fatias de alta qualidade para uso em avaliar o potencial neuroprotetor do romance substâncias ou o comportamento biológico das células tumorais.

Organotypic fatias Hippocampal culturas como um modelo para estudo neuroproteção e invasão de células tumorais

Este protocolo fornece instruções para a observação direta de neurônios corticais que migram radialmente. A eletroporação in utero , a cultura de fatia organotípica e a imagem confocal de lapso de tempo são combinadas para estudar de forma direta e dinâmica os efeitos da sobre-expressão ou downregulation de genes de interesse em neurônios migratórios e analisar sua diferenciação durante o desenvolvimento.

Imaginação confocal de lapso de tempo de neurônios migratórios na cultura de fatias organotípicas do cérebro de mouse embrionário Usando<em&gt; Em Utero</em&gt; Electroporação

Um protocolo para preparar culturas de fatias flutuantes do cérebro humano adulto é apresentado. O protocolo é uma variação do método de cultura de fatia amplamente utilizado usando inserções de membrana. É simples, rentável, e recomendado para a execução de ensaios de curto prazo destinadas a desvendar mecanismos de neurodegeneração por trás de doenças cerebrais associadas à idade.

Culturas de fatias flutuantes de curto prazo do cérebro humano adulto

Descrevemos um protocolo para a expressão específica do tipo celular do sensor geneticamente codificado baseado em FRET ATeam1.03YEMK em culturas organotípicas do antecérebro do rato. Além disso, mostramos como usar este sensor para imagens dinâmicas dos níveis de ATP celular em neurônios e astrócitos.

Imagem de ATP intracelular em fatias organotípicas do tecido do cérebro do rato usando o sensor ateam1.03yEMK baseado em FRET

Aqui, descrevemos a preparação de fatias organotipicas do córtex-hipocampo rhinal. Sob uma privação gradual e controlada de soro, essas fatias retratam eventos epilépticos em evolução e podem ser consideradas um modelo ex vivo de episetogênese. Este sistema representa uma excelente ferramenta para monitorar a dinâmica da atividade espontânea, bem como para avaliar a progressão das características neuroinflamatórias ao longo do curso da epipesogênese.

Um Modelo de Epipetogênese em Culturas de Fatia Organotipica Do Cortex-Hipocampo Rhinal

Neste artigo, fornecemos um método reprodutível para gerar e manter fatias organotípicas da medula espinhal de longo prazo transplantadas com células-tronco neurais como um modelo ex vivo para testar terapias de reposição celular.

Cultura de fatias organotípicas da medula espinhal de camundongo de longo prazo como plataforma para validação de transplante de células em lesão medular

Aprenda a analisar simultaneamente neurônios e vasos sanguíneos em culturas de fatias organotípicas entorrino-hipocampais para estudar lesão cerebral isquêmica. Este método permite investigar remodelação neurovascular.

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

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