1.3: Imageamento de cálcio em neurônios

A imagem de cálcio é uma técnica extremamente útil para investigar a variedade de papéis que os íons de cálcio têm no funcionamento dos neurônios. Os íons de cálcio geram uma infinidade de sinais intracelulares que controlam funções-chave, como a liberação de neurotransmissores das vesículas sinápticas. Os métodos de imagem de cálcio permitem a medição direta do fluxo dinâmico de cálcio dentro dos neurônios e do tecido neuronal. Este vídeo fornece uma visão geral de como os corantes indicadores de cálcio funcionam, como um experimento de imagem de cálcio é concluído e, finalmente, discute algumas das aplicações dessa técnica.

Primeiro, vamos revisar os princípios bioquímicos dos corantes indicadores de cálcio.

Os corantes indicadores de cálcio são moléculas quelantes modificadas, como o Fura-2, que são compostas por dois componentes principais. O primeiro é o local quelante que se liga ao cálcio de forma seletiva. O segundo é um local fluorescente que emite luz em um comprimento de onda específico quando iluminado por um comprimento de onda de excitação de luz ultravioleta.

A ligação do cálcio ao corante altera suas propriedades de fluorescência, o que fornece uma maneira de quantificar as mudanças na concentração de cálcio, que é representada aqui pela diferença na intensidade fluorescente emitida por esse neurônio em dois comprimentos de onda de excitação diferentes.

A maioria dos corantes indicadores de cálcio é modificada para permitir que eles atravessem prontamente a membrana celular e são introduzidos na solução do banho com os neurônios ou injetados no tecido cerebral para estudos com animais inteiros.

Alguns corantes têm propriedades de excitação dupla ou emissão dupla, dependendo se o cálcio está ou não ligado. Tomemos, por exemplo, o corante Fura-2, que tem um comprimento de onda de excitação diferente quando o cálcio está ligado e quando não está. Tomando a razão da intensidade de emissão nos dois comprimentos de onda de excitação, uma estimativa muito mais precisa da concentração de cálcio pode ser feita.

Corantes de excitação dupla ou emissão, como o Fura-2, são chamados de indicadores raciométricos de cálcio. Existem corantes não raciométricos que possuem comprimentos de onda de excitação e emissão únicos. No entanto, eles são mais suscetíveis ao fotobranqueamento, que é o enfraquecimento ou perda de fluorescência com a exposição prolongada à luz.

Um passo fundamental antes de usar um corante em um experimento é calibrar as medições de fluorescência feitas do corante com soluções de concentrações de cálcio conhecidas. Isso permitirá que os cientistas estimem com precisão as concentrações de cálcio intracelular com base nas intensidades de emissão medidas durante os experimentos.

Agora que aprendemos como funcionam os indicadores de cálcio, vamos explorar como obter imagens do fluxo de cálcio em neurônios revestidos.

Comece preparando o corante indicador de cálcio de sua escolha, como Fura-2, e misturando-o com soluções fisiológicas adicionais. Vortex a solução para garantir a mistura adequada. Depois de suficientemente misturado, transfira para um prato. Agora coloque a lamínula com os neurônios cultivados no prato com a solução de corante. Em seguida, incube os neurônios no escuro pelo tempo necessário na temperatura apropriada, que neste caso é de 30 minutos a 37 °C. Após o período de incubação, transfira a lamínula para um prato sem o corante.

O próximo passo é montar a lamínula na câmara de imagem do microscópio. Uma vez montado, conecte a linha de entrada do sistema de perfusão e encha lentamente a câmara. Prenda a câmara ao estágio do microscópio e instale as linhas de perfusão de saída, garantindo um fluxo contínuo em todo o sistema de perfusão.

Agora que o estágio do microscópio está pronto, coloque os neurônios em foco usando luz visível. Teste o corante iluminando as células nos comprimentos de onda de 340 e 380 nm. Lembre-se de que, com o Fura-2, os neurônios não ativados devem emitir mais luz quando excitados por 380 nm, pois o cálcio não está ligado.

Em seguida, ajuste as configurações da câmera para otimizar a faixa dinâmica antes de iniciar o experimento. Colete uma imagem em cada comprimento de onda e use a região de interesse ou a ferramenta ROI para medir a intensidade do plano de fundo em cada comprimento de onda. Insira os valores de fundo no software de controle para que possam ser subtraídos das imagens subsequentes.

Quando a configuração inicial estiver concluída, escolha os cinco ou mais campos de visão que devem ser fotografados para o experimento e salve as coordenadas no software de controle. Durante o experimento, o estágio automatizado se move para um campo, coleta uma proporção da intensidade do campo em comprimentos de onda de 340 e 380 nm e passa para o próximo campo até que todos os campos sejam coletados.

Em alguns experimentos, um agente farmacológico é adicionado ao fluido de perfusão que causa alterações nos níveis de cálcio intracelular. Uma solução com alto teor de potássio, que despolariza os neurônios, pode fazer com que a concentração de cálcio intracelular aumente, como mostrado nesta série de imagens de lapso de tempo, e serve como um bom controle positivo. Assim que a coleta de dados for concluída, prossiga para a análise.

Para analisar os resultados, selecione regiões de interesse que incluam neurônios ou partes de neurônios usando o software. Em seguida, use o software para medir as informações de intensidade raciométrica da imagem de ambos os comprimentos de onda em cada ROI em todas as imagens coletadas. Com essas informações, pode-se fazer uma avaliação quantitativa das mudanças nas concentrações intracelulares de cálcio ao longo do tempo.

Agora que você tem uma compreensão de como a imagem de cálcio nos neurônios é alcançada, vejamos algumas das maneiras pelas quais esse método valioso é aplicado na pesquisa hoje.

Em primeiro lugar, a imagem de cálcio é usada para investigar como o cálcio intracelular flui em relação à atividade neural.

Neste estudo, neurônios individuais foram preenchidos com um corante indicador de cálcio enquanto eram registrados no patch-clamp. O controle preciso do potencial de membrana habilitado pela técnica patch-clamp fornece informações sobre a dinâmica do fluxo de cálcio.

A imagem de cálcio permite que os pesquisadores investiguem a atividade de rede altamente síncrona dos neurônios.

Aqui, os neurocientistas usaram imagens de cálcio para avaliar o sinal fluorescente de 40 neurônios. Com essas informações, as propriedades da rede, como propagação de sinal e correlações neurais, podem ser determinadas.

A dinâmica do cálcio também pode revelar como os neurônios processam sinais do mundo exterior, como cheiros.

Neste experimento, órgãos sensíveis a feromônios extraídos de um nariz de camundongo foram cultivados em cultura. Os neurônios dentro do tecido foram incubados com Fura-2 e fotografados enquanto eram apresentados a odores como urina ou feromônios purificados. Ao manipular a expressão de proteínas receptoras de odor em neurônios olfativos, é possível visualizar diretamente como uma única proteína influencia a capacidade de uma célula de responder a cheiros únicos.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à imagem de cálcio em neurônios. Neste vídeo, discutimos as propriedades por trás da técnica e revisamos um experimento típico.

Dado o papel importante do cálcio, a imagem do cálcio continuará sendo uma ferramenta vital na compreensão dos neurônios e como eles interagem uns com os outros.

Obrigado por assistir!