Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as mudanças relativas no nível de uma proteína nos centrossomas sob várias condições. Por exemplo, em um ponto específico do ciclo celular após a inibição do proteassoma, isso é feito primeiro tratando as células que estão crescendo em lamínulas com o inibidor de proteassoma MG one 15 ou com o solvente de controle DMSO. Em seguida, adicionar imediatamente BRDU a ambas as células e incubá-las por quatro horas em uma incubadora de cultura de células.

O segundo passo é transferir as lamínulas para uma placa de 24 poços para fixar as células. Em seguida, as células são coradas com anticorpos contra BRDU e as proteínas de interesse e, em seguida, com anticorpos secundários correspondentes. A etapa final é adquirir imagens de células BRDU positivas usando um microscópio de fluorescência e um software de imagem digital para aplicar tempo de exposição e comprimento do eixo Z idênticos às células de cada amostra.