Name: Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprenda a quantificar níveis proteicos em centrossomas de células RPE1 fixas usando imunofluorescência indireta com normalização por padrão interno. Este método permite medir regulação proteica em diferentes condições experimentais.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do National Institutes of Health (GM77311) e uma doação inicial do The Ohio Cancer Research Associates (para HAF). A SM foi parcialmente apoiada por uma bolsa Up on the Roof do Programa de Genética do Câncer Humano do Centro Abrangente de Câncer da Universidade Estadual de Ohio.

1. Cultura celular <ol><li> Use telomerase humana transcriptase reversa (hTERT) nas células epiteliais pigmentares da retina imortalizadas (hTERT-RPE1; referido aqui como RPE1). NOTA: células RPE1 são células humanas quase diplóides, não transformadas que são comumente usados ​​para estudar a montagem centríolo e ciliogênese. Estas células seguem um ciclo de duplicação centríolo normais coordenado com um ciclo celular regulamentado. </li><li> Uma passagem quase confluentes 100 milímetros prato de cultura de células de células RPE1 a 1: 5 de diluição da cultura original para uma nova placa de 100 mm contendo 10 ml de meio DME / F-12 (1: 1) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 100 U / ml de penicilina G e 100 ug / ml de estreptomicina (meio completo é referido como DME / meio F-12). Crescer as células a 37 ° C na presença de 5% de CO 2. <ol><li> Incubar 12 milímetros lamelas de vidro redondas com 50 ml de HCl 1 N num copo de vidro coberto, S / N, sem agitação, a 60 ° C em um banho-maria ou incubadora. </li><li> After descartando a solução de ácido, lavar as lamelas três vezes em 100 ml de água destilada, por incubação durante 15 minutos com agitação ocasional. Repetir a lavagem de modo semelhante em 70% de etanol e 95% de etanol. </li><li> Secam-se as lamelas de cobertura, espalhando-os individualmente para fora em um papel mata-borrão em laboratório uma cabine de segurança biológica, seguido por esterilização por radiação UV durante 60 min. </li></ol></li><li> Coloque 2-4 lamelas secas em um 35 milímetros de cultura de células prato. Dilui-se a solução de fibronectina ou fibronectina como polímero de engenharia (concentração estoque de 1 mg / ml) para uma concentração de 25 ug / ml em cultura de células de PBS. <ol><li> Coloque 80-100 ul da solução diluída em cada lamela e incubar durante 60 min a revestir o lado superior da lamela. Lave as lamelas três vezes usando PBS antes de adicionar meio completo. </li></ol></li></ol> 2. Células crescendo e tratamento de células com inibidores de proteassoma <ol><li> Passagem 2 x 10 5 assincronamente crescercélulas ing RPE1 em cada 35 milímetros prato contendo lamelas e crescer as células em 2 ml de meio completo. Substituir o meio de cultura a cada 24 horas com meio completo fresco pré-aquecido. <ol><li> Para analisar o efeito de inibição do proteassoma no nível centrosomal da proteína de teste (aqui VDAC3 ou γ-tubulina), crescem as células em dois pratos de 35 mm para 44 hr. Substituir o meio de cultura com meio completo e adicione ou MG115 ou DMSO como controlo do solvente a uma concentração final de 5 uM ou 0,05%, respectivamente. Ao mesmo tempo, adicionar BrdU para as células a uma concentração final de 40 uM e incubar as células durante 4 horas. </li><li> Transferência de cada lamela em uma placa de 24 poços. Adicionar 500 mL de metanol arrefecido a cada poço e incubar a placa à temperatura de -20 ° C durante 10 minutos para fixar as células sobre as lamelas. Lavar imediatamente as lamelas três vezes com 500 ul de tampão de lavagem (1x PBS contendo 0,5 mM MgCl2 e 0,05% de Triton X-100). </li></ol></li><li> Colha o residualas células a partir da placa de 35 mm e centrifugação das células a 1000 xg durante 5 min. Usar o sedimento celular para avaliar a proteína total por Western blotting (passo 6). </li></ol> 3. BrdU de pulso e Chase Ensaio para analisar os níveis de proteínas em diferentes fases do ciclo celular <ol><li> Para analisar a variação do nível de uma proteína (aqui VDAC3, SAS6 ou Cep135) em centrossomas em diferentes fases do ciclo celular, as células crescer em dois pratos de 35 mm contendo lamelas de 44 horas. Substituir o meio de cultura com meio completo contendo 40 uM de BrdU e incubar as células durante 4 horas na incubadora de cultura de células. </li><li> A partir de um prato, transferir as lamelas a uma placa de 24 poços para fixar as células utilizando metanol arrefecido tal como descrito no passo 2.1.2. </li><li> Após o pulso de BrdU 4 h, remover o meio contendo BrdU, lave as células uma vez com PBS e uma vez com meio completo, adicionar meio fresco, e depois crescer as células na ausência de BrdU durante vários tempos (geralmente mais 4 hpara células RPE1) antes de fixar as células tal como descrito no passo 2.1.2. NOTA: Para as células RPE1, a maioria das células positivas para BrdU são em S tardia ou fase G2 após uma perseguição de 4 h. Isso deve ser determinada de forma independente para cada tipo de célula. </li></ol> 4. Immunostaining <ol><li> Incubar as células fixadas em lamelas em 200 ul de tampão de bloqueio (2% de BSA e 0,1% de Triton X-100 em PBS 1x), durante 30 min. <ol><li> Incubar as células com uma mistura de anticorpos primários (tipicamente uma produzidos em coelho e outra levantada em rato) diluído em tampão de bloqueio O / N a 4 ° C numa câmara humidificada. </li><li> Para fazer uma câmara úmida, colocar uma toalha de papel molhado na metade inferior de uma caixa de ponta da pipeta vazio 1.000 l. Coloque uma tira de Parafilm na superfície da cremalheira, e detectar uma gota (15-20 ul) da solução de anticorpo para o Parafilm para cada lamela para ser incubados. Inverter uma lamela para uma gota de solução de anticorpo (de modo que as células estão imersos) e pertoa tampa da caixa de ponta. </li><li> Inverta lamelas novamente e devolvê-los de volta para o 24 bem prato. Lavar as lamelas e, em seguida, incuba-los na mistura de 150 ul de anticorpo secundário (aqui corante conjugado anti-coelho verde-fluorescente e o corante vermelho fluorescente conjugado anti-rato diluído em tampão de bloqueio) durante 1 h à TA. Lavam-se as lamelas três vezes. NOTA: Os anticorpos secundários fluoróforos são sensíveis à luz. Proteja as amostras da luz durante os passos 4.1.3-5.1.2. </li></ol></li><li> Preparar para a coloração anti-BrdU por fixação das células coradas RPE1 novamente com 500 mL de metanol arrefecido a -20 ° C durante 10 min, tal como descrito no passo 2.1.2. Lavam-se as lamelas três vezes. NOTA: Este fixação prende a marcação com anticorpos primários e secundários da proteína (s) de interesse durante o processo de hidrólise ácida no passo seguinte. <ol><li> Incubar as células em 200 ul de HCI 2 N durante 30 min à TA. Neutraliza-se com 300 ul de 1 M de Tris-Cl, pH 8, umad lavar as células por três vezes com tampão de lavagem. </li><li> Bloquear as células novamente usando 200 ul de tampão de bloqueio durante 30 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Incubar as células com anticorpo de rato anti-BrdU (diluído em tampão de bloqueio) durante 45 min a 37 ° C numa câmara humidificada. Devolver as lamelas de volta para o prato de 24 poços, lavá-los e depois incubar com o corante azul-anticorpo conjugado fluorescente anti-rato secundária (diluído em 150 ul de tampão de 24 poços prato de bloqueio durante 1 h à TA. </li></ol></li><li> Lavam-se as lamelas três vezes. Detectar uma gota (aproximadamente 3-6 L) de uma solução de montagem antifade contendo reagente sobre uma lâmina de vidro de microscópio. Inverter uma lamela, com o lado da célula a virada para baixo, para a solução de montagem. Limpe o excesso de líquido, pressionando suavemente a lamela contra o slide usando tecido de limpeza suave. Aplicar transparente unha polonês ao longo da borda da lamela para selá-lo para a lâmina de microscópio. </li></ol> 5. Imunofluorescência Imagem acquisition e Análise <ol><li> Utilize uma objectiva de imersão em óleo de 100X Plano Apo (com uma abertura numérica de 1,4) para adquirir as imagens de células positivas para BrdU RPE1 à temperatura ambiente. <ol><li> Coloque uma lâmina no microscópio (veja equipamentos) ligados com uma câmera capaz de imagem digital. Para cada fluoróforo, determinar o tempo de exposição apropriado (tipicamente entre 300-1,000 mseg) através do exame manualmente todas as amostras de uma experiência. Antes da aquisição de imagens de uma célula, determinar manualmente o topo do apropriado e plano focal inferior ao longo do eixo Z (tipicamente de 0,2 um tamanho de passo). Aquisição de imagens de diferentes amostras que estão em lamelas separadas, usando o tempo de exposição idênticos para diferentes fluoróforos ao longo do eixo Z, usando um pacote de software de imagem digital microscopia. </li></ol></li><li> Execute deconvolution (nesses casos, não usando nenhum algoritmo do vizinho) de todas as pilhas de imagens adquiridas ao longo do eixo Z. <ol><li> Obter a projeção total de intensidade de cada pilha de imagens ao longoo eixo Z. </li></ol></li><li> Nas células onde centrosomes estão próximos (distância entre dois centrossomas é inferior a 2 mm), desenhe um pequeno quadrado (tipicamente 20-30 pixels de cada lado) em torno de ambos os centrossomas e marcar a área selecionada. <ol><li> Desenhe um quadrado maior (tipicamente 24-35 pixels de cada lado) em torno do primeiro quadrado e marcar a área selecionada da grande praça. </li><li> Obter a área (A) e a intensidade de fluorescência total (F) de cada fluoróforo em cada caixa (S indica a pequena caixa e L indica a caixa grande). </li><li> Analisar o fundo corrigida intensidade de fluorescência de cada fluoróforo utilizando a fórmula descrita por Howell et al. 29: F = F S - [(F L - F S) x A S / (A L - A S)]. </li><li> Obter a intensidade de fluorescência normalizada da proteína de interesse (aqui VDAC3 ou SAS6) através do cálculo da razão entre a intensidade de fluorescência corrigida dos seus fl-fundouorophore ao do fluoróforo utilizado para o padrão interno escolhido (aqui γ-tubulina, ou SAS6 Cep135). </li></ol></li><li> No caso de análise de células, onde os centrossomas estão bem separadas (distância entre dois centrossomas é superior a 2 mm), analisar cada centrossoma separadamente por desenho dois conjuntos separados de caixas. Desenha um pequeno quadrado (tipicamente 15-25 pixels de cada lado) em torno de cada centrosome e marcar a área selecionada. Desenhe um quadrado maior (20-30 pixels de cada lado) em torno do primeiro quadrado e marcar a área selecionada. <ol><li> Obter a área (A) e a intensidade de fluorescência total (F) de cada fluoróforo em cada caixa, e calcular as intensidades de fluorescência de fundo corrigido de cada fluoróforo, separadamente para cada centrossoma, conforme descrito no passo 5.3.3. </li><li> Combina-se as intensidades de fluorescência de fundo corrigido de cada uma das proteínas a partir das duas centrossomas para obter o nível centrosomal total de proteína em que essa célula. </li><li> Obter aintensidade normalizada para a proteína de interesse por cálculo da razão da sua intensidade centrosomal total e intensidade centrosomal total do padrão interno. </li></ol></li><li> Analise pelo menos 15-25 células para cada condição experimental e traçar o gráfico em uma planilha. </li></ol> 6. Analisando proteína total Usando Western Blotting <ol><li> Ressuspender as células em tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) contendo 50 mM de Tris-HCl a pH 8, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P-40, 1% desoxicolato de sódio, 0,1% dodecilsulfato de sódio (SDS) e incubar durante 10 min em gelo para lisar as células. <ol><li> Centrifuga-se a mistura a 10.000 xg durante 10 min, separar o lisado a partir da fracção sedimento e medir a concentração de proteína total de cada lisado usando um ácido bicinconínico (BCA) Kit de ensaio. </li></ol></li><li> Misturar 40 ug de lisado 4x com tampão de carga de SDS-PAGE (50 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 10% de glicerol, ditiotreitol 100 mM, 0,1% Bromophenol azul). <ol><li> Ferver as amostras durante 10 min e executar as amostras sobre um 12,5% de desnaturação de SDS-PAGE a uma voltagem constante de 200 V. </li></ol></li><li> Transferem-se as proteínas separadas em SDS-PAGE para uma membrana de nitrocelulose usando a técnica de transferência de western (a uma voltagem constante de 90 V durante 1 hora em frio). <ol><li> Bloquear a membrana com 3% de leite desnatado em PBS 1x, e então incubar a membrana com soluções de anticorpos primários diluídos (neste caso de coelho anti-VDAC3, de coelho anti-γ-tubulina e de ratinho anti-α-tubulina) durante 1 h à TA. </li><li> Depois de lavar a membrana três vezes (5 min cada incubação sob agitação), utilizando tampão PBS-T (PBS 1x e 0,2% de Tween-20), incubar a membrana numa mistura de infravermelho próximo, (IV) corante fluorescente conjugada com anti-coelho e corante fluorescente de IV anticorpos secundários anti-murganho conjugados (diluídos em PBS-T) durante 1 hora. </li><li> Lava-se a membrana três vezes e, em seguida, analisar a membrana para analisar as bandas utilizando um f infravermelhosistema de imagem luorescence adequado para a detecção de immunoblot. </li></ol></li></ol>

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<li>Buck, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+S-phase+cell+cycle+progression+using+5-ethynyl-2%27-deoxyuridine+incorporation+with+click+chemistry%2C+an+alternative+to+using+5-bromo-2%27-deoxyuridine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2'-deoxyuridine antibodies.</a> Biotechniques. 44, 927-929 (2008).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Microscopia quantitativa em biologia celular é comumente associado com ensaios de imagem em células vivas, como a fluorescência de Ressonância Energia Transferência (FRET), Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP), etc. No entanto, há exemplos de crescimento de biólogos celulares em desenvolvimento diferentes ensaios de microscopia quantitativos para fixo células nos últimos anos 27,34-36. É importante ressaltar que o progresso na compreensão da biologia centrosome muitas vezes requer ...

Centrossomas consistem em um par de centríolos cercados por material de pericentriolar (PCM). Sendo os principais centros de microtúbulos organizadoras (MTOCs) em células de mamíferos, centrosomes servem como os dois pólos de fusos mitóticos em células em divisão, e, assim, ajudar a manter a integridade genômica 1. Em células quiescentes (por exemplo, durante a fase G0), um dos dois centrioles do centrossoma, a saber, a centriole mãe, é transformado em um corpo de base, ao montar o cílio primário, um organelo sensorial salientes para fora a partir da superfície de células 2. Uma vez que as células re-entrar no ciclo celular, os cílios são desmontados e cada centriole dirige a montagem de um procentriole na sua extremidade proximal que, gradualmente, se alonga para formar um centriole 3 madura. No início da fase S, uma estrutura semelhante a cambalhota que fornece a simetria de 9 vezes para a centriole é formada sobre a superfície de cada centriole existente e irá tornar-se a base de cada procentriole. SAS6 tchapéu é indispensável para a montagem centríolo é recrutado para formar o cubo da roda de carroça 4-6. Outras proteínas centriolar são então montados para a cambalhota em um ambiente altamente regulado, proximal para distal maneira 7. Depois de completar precisamente duplicação centríolo, células montar materiais pericentriolar adicionais para construir dois centrossomas funcionais até o final da fase G2 8. Em adição aos componentes principais centriolar 9-11, várias outras proteínas, incluindo cinases, fosfatases, chaperones, componentes de andaime, proteínas de membrana associadas a degradação e máquinas estão associados com centrioles, corpos basais e PCM em alturas diferentes do ciclo celular 12-16. Ele é frequentemente observado que os níveis de centrosomal muitas proteínas são temporalmente regulados por mecanismos de segmentação centrosomal e / ou degradação no proteossómica centrossomas. É importante ressaltar que as flutuações no nível centrosomal de várias proteínas, como Plk4, MPS1, SAS6 e CP110 umt diferentes pontos do ciclo celular parece ser crucial para regular montagem centriole 5,17-22, e no caso de MPS1 prevenir essa degradação centrosomal leva à formação de um excesso de 19 centrioles. Por outro lado, as fracções centrosomal de várias proteínas são menos lábeis em relação a piscinas citosólicas. Por exemplo siRNA mediada down-regulação da Centrin 2 (Cetn2) levou a apenas uma diminuição moderada do nível de proteína nas centrioles apesar de grande redução em toda a sua níveis de células 23. É, portanto, essencial para medir as mudanças no nível de proteínas centrosomal no centrosome em vez de medir os níveis de proteínas inteiras celular ao avaliar suas funções específicas do centrossoma. Neste estudo foi desenvolvido um ensaio utilizando imunofluorescência indireta (IFI) para quantificar o nível relativo de uma proteína no centrosomes. Este ensaio é desenvolvido particularmente para analisar as células que são a partir de diferentes amostrase, portanto, não pode ser trabalhada ao mesmo tempo. Estas amostras podem ser células que foram tratadas com diferentes reagentes (isto é, a droga versus controlo), recolhidas a diferentes pontos de tempo (isto é, contra perseguição de impulso), ou estão em diferentes fases do ciclo celular. O princípio deste ensaio encontra-se na medição da intensidade de fluorescência de fundo corrigido correspondente a uma proteína com uma região pequena e para normalizar o valor contra o mesmo para uma outra proteína cujos níveis não variam de acordo com as condições experimentais escolhidas. Vários estudos em biologia do centrossoma recentemente utilizados várias técnicas de microscopia quantitativa, em ambas as células vivas ou fixadas, para determinar a função específica do centrossoma de proteínas candidatas 24-27. Semelhante aos ensaios, a presente técnica também mede a intensidade de fluorescência de fundo corrigido da proteína a testar. No entanto, a inclusão da normalização utilizando um padrão interno no presente ensaio seria provável oferecer maiorprecisão e confiança na análise de duas amostras diferentes que estão em duas lamelas diferentes. Além disso, em adição ao exame do nível de proteína no centrossomas, com pequenos ajustes este método pode ser aplicado a um conjunto diversificado de condições experimentais ou em outros locais celulares. Aqui, nós combinamos nosso ensaio microscopia quantitativa, com uma estratégia de pulso-chase BrdU para comparar as células de diferentes fases do ciclo celular. Em vez de utilizar técnicas de paragem do ciclo celular e padrão de libertação para o estudo de vários pontos de tempo do ciclo celular, as células que crescem de forma assíncrona são incubadas com BrdU para marcar as células em fase S, e as células marcadas são perseguidos durante vários tempos (tipicamente 4-6 h). A maioria das células marcadas estará em fase S imediatamente após o pulso. O comprimento da perseguição é escolhida de modo que após a perseguição, células marcadas será no final de S, G2 ou mitose, o que pode ser verificado por características morfológicas, tais como- posição de centrossomas no que diz respeito ao nuclei, a distância entre os centrossomas, condensação de cromossomas, etc. Assim, o comprimento da perseguição depende da duração média de S, G2 e M de fase num tipo de célula particular. Uma vez que esta abordagem evita a inibidores do ciclo celular, tais como a hidroxiureia, a afidicolina, nocodazol, etc, que permite uma análise mais fisiologicamente relevante do ciclo celular. Assim, demonstramos aqui que o ensaio de microscopia de fluorescência quantitativa sozinho, ou em combinação com BrdU de pulso-caça ensaio, é uma técnica simples e poderosa para medir com precisão as mudanças relativas no nível centrosomal de uma proteína candidata durante um ciclo celular perturbado. Foi medido o nível de centrosomal VDAC3, uma proteína que, recentemente identificado em centrossomas além de mitocôndrias 16,28, utilizando estes ensaios. Os resultados obtidos aqui verificar a nossa observação anterior de que a piscina centrosomal de VDAC3 é regulada pela degradação, e também varia em um dependen ciclo celulart modo 16, além disso validando a aplicabilidade deste método.

<table><tbody><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F8141</td><td>Estoque de 1 mg/ml em água</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>MG115</td><td>Sigma</td><td>SCP0005</td><td>Estoque de 10 mM em DMSO</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td>Estoque de 10 mM em DMSO</td></tr><tr><td>Anti-&#947;-tubulina (monoclonal de camundongo, clone GTU 88)</td><td>Sigma</td><td>T 6557</td><td>1:200 in tampão de bloqueio IIF&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-VDAC3 (policlonal de coelho)&nbsp;</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>ARP35180-P050</td><td>1:50 in IIF blocking buffer, 1:1,000 in WB blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-Sas6 (mouse monoclonal)&nbsp;</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>sc-81431</td><td>1:100 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-Cep135 (coelho policlonal)</td><td>Abcam</td><td>ab-75005</td><td>1:500 in IIF blocking buffer</td></tr><tr><td>Anti-BrdU (rato monoclonal)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1:250 in buffer de bloqueio IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A21093</td><td>1:200 in buffer de bloqueio IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21202</td><td>1:1,000 in buffer de bloqueio IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21203</td><td>1:1,000 in IIF tampão de bloqueio</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21206</td><td>1:1,000 in buffer de bloqueio IIF</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A21207</td><td>1:1,000 in buffer de bloqueio IIF</td></tr><tr><td>Anti-&#947;-tubulina (policlonal de coelho)</td><td>Sigma</td><td>T5192</td><td>1:1,000 in buffer</td></tr> <tr><td>de bloqueio WBAnti-&#945;-tubulina (monoclonal de camundongo, DM1A)</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>1:20,000 in buffer de bloqueio WB</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Life technologies</td><td>A10043</td><td>1:10,000 in buffer de bloqueio WB</td></tr><tr><td>Mouse IgG (H& L) Anticorpo IRDye800CW Anticorpos Rockland Conjugados</td><td></td><td>610-731-002</td><td>1:10,000 in WB bloqueando buffer</td></tr><tr><td>Reagente Antifade Gold SlowFade&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>S36936</td><td>Mídia de montagem</td></tr><tr><td>de lamínulas redondas 12CIR.-1</td><td>Microscópio Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-81</td><td>Câmera IR Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga ExiFAST 1394</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>32-0082B-238</td><td></td></tr><tr><td>100X Plano Apo objetivo de imersão em óleo</td><td>Olympus</td><td></td><td>1.4 abertura numérica</td></tr><tr><td>Pacote de software Slidebook</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey IR Imaging System</td><td>Li-cor Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de ácido bicinchonínico (BCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Cubo</td> <td>UV estreitoFiltro Olympus</td><td>U-M622</td><td></td></tr><tr><td>U-MNU2 Cubo azul estreito</td><td>Filtro Olympus</td><td>U-M643</td><td>Cubo</td></tr><tr><td>verde estreito</td><td>Olympus</td><td>U-M663</td><td>Filtro</td></tr></tbody></table>

quantitative reação de imunofluorescência indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrossomas são pequenas, mas importantes organelas que servem como os pólos do fuso mitótico para manter a integridade genômica ou montar cílios para facilitar funções sensoriais nas células. O nível de uma proteína pode ser regulado de forma diferente em centrossomas do que em outros locais .cellular, e a variação no nível centrosomal de várias proteínas em diferentes pontos do ciclo celular parece ser crucial para a regulação correcta da montagem centriole. Foi desenvolvido um ensaio de microscopia de fluorescência quantitativa que mede as mudanças relativas no nível de uma proteína na centrossomas em células fixadas a partir de diferentes amostras, tais como em diferentes fases do ciclo celular, ou após tratamento com vários reagentes. O princípio deste ensaio encontra-se na medição da intensidade de fluorescência de fundo corrigido correspondente a uma proteína com uma pequena região, e que normalizar medição contra o mesmo para uma outra proteína que não varia no âmbito do c experimental escolhidoondition. Utilizando este ensaio, em combinação com BrdU de pulso e caça estratégia para estudar os ciclos celulares não perturbados, temos quantitativamente validado nossa observação recente de que o conjunto de centrosomal VDAC3 é regulada a centrossomas durante o ciclo celular, provavelmente pela degradação mediada por proteassoma especificamente em centrossomas.

Os nossos estudos recentes identificaram novos centrosomal localização e função de VDAC3, uma das porinas mitocondriais 16,28. A imunocoloração de várias células de mamíferos, incluindo células RPE1 utilizando um anticorpo específico VDAC3-centrosomal apresentaram coloração proeminente e coloração mitocondrial comparativamente fraca. Nós também mostrou que VDAC3 centrosomal é preferencialmente associado ao centríolo mãe, ea piscina centrosomal tanto da endógeno e ectopically expressa VDAC3 é regulada pela deg...

Aqui, um novo ensaio quantitativo de fluorescência é desenvolvido para medir mudanças no nível de uma proteína especificamente nos centrossomas, normalizando a intensidade de fluorescência dessa proteína para a de um padrão interno apropriado.

Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as mudanças relativas no nível de uma proteína nos centrossomas sob várias condições. Por exemplo, em um ponto específico do ciclo celular após a inibição do proteassoma, isso é feito primeiro tratando as células que estão crescendo em lamínulas com o inibidor de proteassoma MG one 15 ou com o solvente de controle DMSO. Em seguida, adicionar imediatamente BRDU a ambas as células e incubá-las por quatro horas em uma incubadora de cultura de células.O segundo passo é transferir as lamínulas para uma placa de 24 poços para fixar as células. Em seguida, as células são coradas com anticorpos contra BRDU e as proteínas de interesse e, em seguida, com anticorpos secundários correspondentes. A etapa final é adquirir imagens de células BRDU positivas usando um microscópio de fluorescência e um software de imagem digital para aplicar tempo de exposição e comprimento do eixo Z idênticos às células de cada amostra.Em seguida, analisando as imagens para quantificar o nível relativo de romal VDA C3. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência quantitativa é usada para mostrar que o pool centrosomal de VDA C3 é aumentado em duas vezes quando o proteassoma é inibido durante a fase S. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como citometria de fluxo, immunoblotting ou microscópio quantitativo, é que essa técnica analisa o nível romal relativo da proteína em duas amostras tratadas de forma diferente que são processadas em duas lamínulas diferentes. Este método usa a normalização para um padrão interno para controlar a necessidade de processar as duas populações de células experimentais.Separadamente, embora este método possa fornecer informações sobre a regulação de proteínas específicas nos centrossomas. Também pode ser aplicado a outras situações, como outras estruturas subcelulares ou examinar pools específicos de proteínas que são encontradas em vários locais dentro da célula. Demonstrando o procedimento será schu majumder, um pós-doutorado do meu laboratório Para começar a passagem do experimento duas vezes 10 para o quinto crescimento assíncrono de células RPE uma em pratos de 35 milímetros previamente preparados com lábios de cobertura e crescer as células em dois mililitros de meio completo.Substitua o meio de cultura a cada 24 horas por meio pré-aquecido fresco Após 44 horas. Substitua o meio de cultura por meio completo contendo 0,05% DMSO ou MG um 15 a uma concentração final de cinco micromolares e, simultaneamente, adicione BRDU às células a uma concentração final de 40 micromolares incube as células por quatro horas. Em seguida, transfira cada lamínula para uma placa de 24 poços.Adicione 500 microlitros de metanol pré-cultivado a cada poço e incube a placa a menos 20 graus Celsius para fixar as células. Após 10 minutos, lave imediatamente as lamínulas três vezes com 500 microlitros de tampão de lavagem. Incube as células fixas na tampa, deslize em 200 microlitros de tampão de bloqueio por 30 minutos enquanto as células estão incubando.Prepare uma câmara umidificada colocando uma toalha de papel molhada na metade inferior de uma caixa vazia de ponteiras de pipeta de 1000 microlitros. Coloque uma tira de parfum na superfície do rack e adicione uma gota de 20 microlitros do anticorpo anti V DDA três de coelho e anticorpo anti-tubulina gama de camundongo diluído em tampão de bloqueio na paraforma. Após o bloqueio, inverta uma lamínula em cada gota de solução de anticorpos.Certifique-se de que as células estejam imersas e feche a tampa da caixa de pontas. Incube as células com anticorpos primários durante a noite a quatro graus Celsius na câmara umidificada. Inverta as lamínulas novamente e devolva-as ao 24.Bem, lave as lamínulas e incuba-as em uma solução de 150 microlitros de anticorpos secundários, diluída em tampão de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente Após a incubação, lave as lamínulas três vezes com tampão de lavagem. Fixe as células RPE coradas com 500 microlitros de metanol resfriado a menos 20 graus Celsius. Depois que as células estiverem fixadas por 10 minutos, lave-as três vezes em tampão de lavagem.Em seguida, incube as células em 200 microlitros de dois HCL normais por 30 minutos. À temperatura ambiente, neutralize as células com 300 microlitros de um molar tris CL pH oito e lave as células três vezes. Com tampão de lavagem, bloqueie as células com 200 microlitros de tampão de bloqueio por 30 minutos em temperatura ambiente.Após o bloqueio, incubar as células com anticorpo anti-BRDU de rato e tampão de bloqueio por 45 minutos a 37 graus Celsius na câmara umidificada. Retorne as lamínulas de volta para o 24. Bem, lave as células.Em seguida, incube-os com anticorpo secundário diluído em 150 microlitros de tampão de bloqueio. Em um prato de 24 poços por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, lave as lamínulas três vezes com um ponto XPBS, uma gota de seis microlitros de uma solução de montagem contendo o reagente Antifa em um microscópio de vidro.Deslize inverter uma lamínula com o lado da célula voltado para baixo na solução de montagem. Com um pano de limpeza macio, pressione suavemente a lamínula contra a lâmina para remover o excesso de líquido, sele a lamínula no microscópio. Deslize aplicando esmalte ao longo da borda da lamínula.Use uma objetiva de imersão em óleo APO de 100 x plano com uma abertura numérica de 1,4 para adquirir as imagens de células BRDU RPE positivas uma à temperatura ambiente. Determine o plano focal superior e inferior apropriado ao longo do eixo Z com o tamanho do passo de 0,2 mícron e adquira imagens ao longo do eixo Z. Em seguida, execute a deconvolução de todas as pilhas de imagens adquiridas ao longo do eixo Z.Obtenha a projeção de intensidade total de cada imagem. Empilhe ao longo do eixo Z para células cujos centrossomas estão separados por menos de dois mícrons. Desenhe um pequeno quadrado de 20 a 30 pixels de cada lado ao redor de ambos os centrossomas e marque a área selecionada.Desenhe um quadrado maior de 24 a 35 pixels de cada lado ao redor do primeiro quadrado e marque a área selecionada do quadrado grande. Em seguida, obter a área e a intensidade total de fluorescência de cada quatro flúor. Em cada caixa, calcule a intensidade de fluorescência corrigida de fundo de cada fluor. Quatro.Finalmente, obtenha a intensidade de fluorescência normalizada de VDA C3 calculando a razão da intensidade de fluorescência corrigida de fundo de seu fluoro. Quatro para o fluoro quatro usado para as imagens padrão interno escolhidas foram capturados de campos aleatórios de células RPE um de crescimento assíncrono incubadas com BRDU e o inibidor de proteassoma MG one 15 ou o solvente de controle DMSO e exibem DNA e BRDU. A intensidade de fluorescência corrigida de fundo correspondente ao Centro Somal.VD três foi aproximadamente 2,5 vezes maior em MG um 15 células tratadas do que em células de controle, conforme demonstrado por este diagrama de caixa e bigode. Quando os dados foram normalizados para a fluorescência total da VD três em relação à da tubulina gama, a dobra aumentou, caiu ligeiramente para cerca de duas vezes. A coloração de VD C3 em citos não romais ou o nível celular total de VD três não foi afetada pela inibição do proteassoma.Assim, o pool romal de VDA C3 é regulado pela degradação mediada por proteassoma. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os anticorpos contra a proteína de teste e o padrão interno devem ser levantados em diferentes espécies hospedeiras e que as imagens de ambas as amostras devem ser adquiridas usando parâmetros de imagem idênticos, como o número de cesarianas e tempos de exposição, a fim de minimizar o efeito da imagem digital.

quantitative-immunofluorescence-assay-to-measure-variation-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo demonstra um método para monitorar a proteína 0 da célula infectada, o tráfego de ICP0 na infecção pelo vírus herpes simplex-1. Após a síntese de novo, a ICP0 se transloca para o núcleo, movendo-se posteriormente para o citoplasma durante a progressão da infecção. A microscopia de imunofluorescência revela e analisa a localização subcelular da proteína, oferecendo informações sobre seu tráfego nas fases de infecção.

Uma técnica de imunofluorescência para localização de proteínas virais em células infectadas

Apresentado é um informática fluxo de trabalho flexível permitindo uma análise baseada em imagem multiplexado de células marcadas com fluorescência. O fluxo de trabalho quantifica marcadores nucleares e citoplasmáticos e calcula marcador translocação entre esses compartimentos. Os procedimentos são fornecidos por perturbação das células utilizando metodologia de siRNA e fiável para a detecção do marcador através de imunofluorescência indirecta em formatos de 96 poços.

Fluxo de trabalho para de alta conteúdo, Quantificação de células individuais de marcadores fluorescentes de Microscópio Universal Data, apoiada pela Open Source Software

Aqui relatamos protocolos para detectar proteínas endógenas e exógenas de centrômero-cinetócoro em células humanas e quantificar esses níveis de proteína em centrômeros-cinetocoros por coloração imunofluorescente indireta através do uso de fixação (fixação de paraformaldeído, acetona ou metanol).

Proteínas Análise de imunofluorescência de endógenos e exógenos Centromere-cinetócoro

Este manuscrito descreve um método para visualizar e quantificar eventos tradução localizada em compartimentos subcellular. A abordagem proposta neste manuscrito requer um sistema básico de imagens confocal e reagentes e é rápido e econômico.

Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução

Nós desenvolvemos uma estratégia para purificar e um grande número de centríolos em diferentes orientações favoráveis para microscopia de super-resolução e único-partícula média da imagem.

Imagem de fluorescência para a reconstrução da único-partícula de Chlamydomonas centríolos e isolamento

Este protocolo descreve uma abordagem de baseados em espectroscopia de flutuação de fluorescência para investigar interações entre proteínas mediando as interações célula-célula, ou seja, as proteínas localizadas em cruzamentos de célula, diretamente em células vivas. Nós fornecemos orientações detalhadas na calibração de instrumentos, aquisição de dados e análise, incluindo correcções de fontes possível artefato.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

Nós descrevemos o uso de immunoblotting quantitativa para validar a histologia de imunofluorescência, juntamente com a análise de imagens como meio de quantificar uma proteína de interesse em amostras de tecido fixada em formol, parafina (FFPE). Nossos resultados demonstram a utilidade da histologia de imunofluorescência para determinar a quantidade relativa de proteínas biomarcador em amostras de biópsia de rotina.

Immunoblotting quantitativa de linhas celulares como um padrão para validar a imunofluorescência para quantificar proteínas biomarcador em amostras de tecido de rotina

Aqui, descrevemos uma abordagem quantitativa para determinar a distribuição de uma proteína sináptica em relação uma proteína de marcador usando a mancha da imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseada em computador.

Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

Nós descrevemos um protocolo que utiliza a hibridação in situ da fluorescência (peixes) para visualizar RNAs herpética múltiplas dentro das pilhas humanas liticamente contaminadas, na suspensão ou no aderente. Este protocolo inclui a quantificação da fluorescência produzindo uma relação Mimivírus e pode ser estendido para o visualização simultâneo do anfitrião e das proteínas virais com imunofluorescência (se).

Hibridação in situ da fluorescência quantitativa (peixes) e immunofluorescence (se) de produtos específicos do gene em pilhas KSHV-infectadas

A ubiquização CENP-A é um importante requisito para a deposição do CENP-A no centromere, herdada por dimerização entre divisão celular e indispensável à viabilidade celular. Aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização da proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) marcada pela EYFP.

Análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do CENP-A marcado pelo EYFP (EYFP-CENP-A)

Este método descreve um protocolo de imunofluorescência e pipeline de quantificação para avaliar a distribuição de proteínas com padrões variados de organização nuclear em linfócitos T humanos. Este protocolo fornece orientação passo a passo, começando pela preparação da amostra e continuando com a execução da análise semiautomatizada em Fiji, concluindo com o tratamento de dados por um notebook Google Colab.

Um pipeline versátil para analisar mudanças dinâmicas em corpos nucleares em uma variedade de tipos de células

Aprenda a quantificar níveis proteicos em centrossomas de células RPE1 fixas usando imunofluorescência indireta com normalização por padrão interno. Este método permite medir regulação proteica em diferentes condições experimentais.

Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

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