Quantitative Reação de Imunofluorescência Indireta para medir a variação nos níveis de proteína no centrossomas

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as mudanças relativas no nível de uma proteína nos centrossomas sob várias condições. Por exemplo, em um ponto específico do ciclo celular após a inibição do proteassoma, isso é feito primeiro tratando as células que estão crescendo em lamínulas com o inibidor de proteassoma MG one 15 ou com o solvente de controle DMSO. Em seguida, adicionar imediatamente BRDU a ambas as células e incubá-las por quatro horas em uma incubadora de cultura de células.

O segundo passo é transferir as lamínulas para uma placa de 24 poços para fixar as células. Em seguida, as células são coradas com anticorpos contra BRDU e as proteínas de interesse e, em seguida, com anticorpos secundários correspondentes. A etapa final é adquirir imagens de células BRDU positivas usando um microscópio de fluorescência e um software de imagem digital para aplicar tempo de exposição e comprimento do eixo Z idênticos às células de cada amostra.

Em seguida, analisando as imagens para quantificar o nível relativo de romal VDA C3. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência quantitativa é usada para mostrar que o pool centrosomal de VDA C3 é aumentado em duas vezes quando o proteassoma é inibido durante a fase S. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como citometria de fluxo, immunoblotting ou microscópio quantitativo, é que essa técnica analisa o nível romal relativo da proteína em duas amostras tratadas de forma diferente que são processadas em duas lamínulas diferentes. Este método usa a normalização para um padrão interno para controlar a necessidade de processar as duas populações de células experimentais.

Separadamente, embora este método possa fornecer informações sobre a regulação de proteínas específicas nos centrossomas. Também pode ser aplicado a outras situações, como outras estruturas subcelulares ou examinar pools específicos de proteínas que são encontradas em vários locais dentro da célula. Demonstrando o procedimento será schu majumder, um pós-doutorado do meu laboratório Para começar a passagem do experimento duas vezes 10 para o quinto crescimento assíncrono de células RPE uma em pratos de 35 milímetros previamente preparados com lábios de cobertura e crescer as células em dois mililitros de meio completo.

Substitua o meio de cultura a cada 24 horas por meio pré-aquecido fresco Após 44 horas. Substitua o meio de cultura por meio completo contendo 0,05% DMSO ou MG um 15 a uma concentração final de cinco micromolares e, simultaneamente, adicione BRDU às células a uma concentração final de 40 micromolares incube as células por quatro horas. Em seguida, transfira cada lamínula para uma placa de 24 poços.

Adicione 500 microlitros de metanol pré-cultivado a cada poço e incube a placa a menos 20 graus Celsius para fixar as células. Após 10 minutos, lave imediatamente as lamínulas três vezes com 500 microlitros de tampão de lavagem. Incube as células fixas na tampa, deslize em 200 microlitros de tampão de bloqueio por 30 minutos enquanto as células estão incubando.

Prepare uma câmara umidificada colocando uma toalha de papel molhada na metade inferior de uma caixa vazia de ponteiras de pipeta de 1000 microlitros. Coloque uma tira de parfum na superfície do rack e adicione uma gota de 20 microlitros do anticorpo anti V DDA três de coelho e anticorpo anti-tubulina gama de camundongo diluído em tampão de bloqueio na paraforma. Após o bloqueio, inverta uma lamínula em cada gota de solução de anticorpos.

Certifique-se de que as células estejam imersas e feche a tampa da caixa de pontas. Incube as células com anticorpos primários durante a noite a quatro graus Celsius na câmara umidificada. Inverta as lamínulas novamente e devolva-as ao 24.

Bem, lave as lamínulas e incuba-as em uma solução de 150 microlitros de anticorpos secundários, diluída em tampão de bloqueio por uma hora em temperatura ambiente Após a incubação, lave as lamínulas três vezes com tampão de lavagem. Fixe as células RPE coradas com 500 microlitros de metanol resfriado a menos 20 graus Celsius. Depois que as células estiverem fixadas por 10 minutos, lave-as três vezes em tampão de lavagem.

Em seguida, incube as células em 200 microlitros de dois HCL normais por 30 minutos. À temperatura ambiente, neutralize as células com 300 microlitros de um molar tris CL pH oito e lave as células três vezes. Com tampão de lavagem, bloqueie as células com 200 microlitros de tampão de bloqueio por 30 minutos em temperatura ambiente.

Após o bloqueio, incubar as células com anticorpo anti-BRDU de rato e tampão de bloqueio por 45 minutos a 37 graus Celsius na câmara umidificada. Retorne as lamínulas de volta para o 24. Bem, lave as células.

Em seguida, incube-os com anticorpo secundário diluído em 150 microlitros de tampão de bloqueio. Em um prato de 24 poços por uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, lave as lamínulas três vezes com um ponto XPBS, uma gota de seis microlitros de uma solução de montagem contendo o reagente Antifa em um microscópio de vidro.

Deslize inverter uma lamínula com o lado da célula voltado para baixo na solução de montagem. Com um pano de limpeza macio, pressione suavemente a lamínula contra a lâmina para remover o excesso de líquido, sele a lamínula no microscópio. Deslize aplicando esmalte ao longo da borda da lamínula.

Use uma objetiva de imersão em óleo APO de 100 x plano com uma abertura numérica de 1,4 para adquirir as imagens de células BRDU RPE positivas uma à temperatura ambiente. Determine o plano focal superior e inferior apropriado ao longo do eixo Z com o tamanho do passo de 0,2 mícron e adquira imagens ao longo do eixo Z. Em seguida, execute a deconvolução de todas as pilhas de imagens adquiridas ao longo do eixo Z.

Obtenha a projeção de intensidade total de cada imagem. Empilhe ao longo do eixo Z para células cujos centrossomas estão separados por menos de dois mícrons. Desenhe um pequeno quadrado de 20 a 30 pixels de cada lado ao redor de ambos os centrossomas e marque a área selecionada.

Desenhe um quadrado maior de 24 a 35 pixels de cada lado ao redor do primeiro quadrado e marque a área selecionada do quadrado grande. Em seguida, obter a área e a intensidade total de fluorescência de cada quatro flúor. Em cada caixa, calcule a intensidade de fluorescência corrigida de fundo de cada fluor. Quatro.

Finalmente, obtenha a intensidade de fluorescência normalizada de VDA C3 calculando a razão da intensidade de fluorescência corrigida de fundo de seu fluoro. Quatro para o fluoro quatro usado para as imagens padrão interno escolhidas foram capturados de campos aleatórios de células RPE um de crescimento assíncrono incubadas com BRDU e o inibidor de proteassoma MG one 15 ou o solvente de controle DMSO e exibem DNA e BRDU. A intensidade de fluorescência corrigida de fundo correspondente ao Centro Somal.

VD três foi aproximadamente 2,5 vezes maior em MG um 15 células tratadas do que em células de controle, conforme demonstrado por este diagrama de caixa e bigode. Quando os dados foram normalizados para a fluorescência total da VD três em relação à da tubulina gama, a dobra aumentou, caiu ligeiramente para cerca de duas vezes. A coloração de VD C3 em citos não romais ou o nível celular total de VD três não foi afetada pela inibição do proteassoma.

Assim, o pool romal de VDA C3 é regulado pela degradação mediada por proteassoma. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os anticorpos contra a proteína de teste e o padrão interno devem ser levantados em diferentes espécies hospedeiras e que as imagens de ambas as amostras devem ser adquiridas usando parâmetros de imagem idênticos, como o número de cesarianas e tempos de exposição, a fim de minimizar o efeito da imagem digital.