Name: Estereológica e Citometria de Fluxo Caracterização de Leucócitos subpopulações em modelos de transitórias ou permanentes Cerebral Isquemia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Aprenda a caracterizar subpopulações de leucócitos mieloides em modelos de isquemia cerebral usando estereologia e citometria de fluxo. Este método permite quantificação precisa e análise fenotípica detalhada.

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Este trabalho foi apoiado por doações do Ministério da Economia e Competitividade da Espanha CSD2010-00045 (MAM), SAF2012-33216 (MAM), SAF2011-23354 (IL) e RENEVAS RD06/0026/0005 (IL), e do Governo Local de Madri S2010/BMD-2336 (MAM) e S2010/BMD-2349 (IL). IB e MIC são bolsistas do Ministério da Economia e Competitividade da Espanha.

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O modelo de isquemia cerebral introduzido aqui dá volumes de infarto altamente reprodutíveis determinada 24-48 horas e 7 dias após a ligadura MCA por diferentes abordagens 8,15,17. Este modelo MCAO tem uma baixa taxa de mortalidade (menos de 1%) em comparação com os outros, minimizando o número de animais utilizados nos estudos. Uma etapa fundamental para se obter esta baixa taxa de mortalidade é de manter as condições de assepsia adequadas para evitar infecções que poderiam prejudicar a sobrevivência após a indução acidente vascular cerebral. Este modelo MCAO pode não só ser usado como um modelo MCAO permanente, que é considerado um modelo clinicamente relevante para a investigação de translação 18, mas também como um modelo de transição por ligadura temporária da ACC e da MCA com um nó corrediço e posterior reperfusão no momento desejado 19. Este método tem sido utilizado com sucesso em ratinhos e ratos 17,20. Todas essas evidências indica que MCAO por ligação é um modelo versátil alta de isquemia cerebral com múltiplas aplicações. A critical passo desta técnica é que não requer cirurgia invasiva sob um estereomicroscópio; a craniotomia deve ser realizada com muito cuidado, para não danificar o osso zigomática bem como a MCA. No entanto, a utilização de animais sham (os quais são submetidos ao procedimento cirúrgico e da MCA mas CCA ligadura não é executada) proporciona uma ferramenta útil para discriminar efeitos dependentes de procedimentos cirúrgicos. A extensão da lesão cerebral após esta técnica pode ser quantificada por vários métodos. Nosso protocolo de seccionamento do cérebro, coloração de Nissl e subsequente estimativa do volume por Cavalieri permite uma quantificação exacta da região danificada e minimiza o número de ratos utilizados neste tipo de estudos desde secções de cérebro de série também pode ser utilizado para a análise imuno-histoquímica diferente. Para um melhor desempenho desta metodologia, é importante escolher os parâmetros apropriados utilizados no software estereologia (Tabela 1), que será necessária para a estimativa the volume das diferentes regiões pela fórmula: V = 1 / * ssf um f * t * i ΣP (SSF é a fracção de amostragem fatia, t é a espessura média das secções, uma f é a área do espaçamento da grelha e ΣP o número de pontos que afectam a estrutura). A MCAO distal por ligação pode ser útil para caracterizar o infiltrado de leucócitos e subpopulações de células imunes que 8,13 participar no processo inflamatório após lesão cerebral 1-4. Aqui, propomos duas metodologias diferentes para a caracterização do cérebro de células imunes, uma abordagem estereológica precisa e uma análise de citometria de fluxo para melhor caracterizar vários leucócitos as subpopulações. Tirando vantagem da série de corte cerebral, a quantificação do número total de neutrófilos pode ser conseguida pelo método de fraccionamento óptico 16, o qual calcula o número total de células a partir do número de células wit amostradoha aleatoriamente amostradas (SRS) conjunto sistemático de espaços virtuais imparciais contagem abrangendo toda a região de interesse, no nosso caso, a região de infarto, com distância uniforme entre os espaços virtuais de contagem imparciais em direções X, Y e Z. Este método fornece uma ferramenta precisa para estimar o número total de neutrófilos no cérebro isquémico em diferentes momentos após a ligação. Embora ainda não tenha sido demonstrado neste estudo, este protocolo pode também ser usado para a estimativa dos diferentes sub-populações de neutrófilos após isquemia e 21 para uma quantificação precisa de qualquer outra população de células encontradas no cérebro isquémico como outros leucócitos infiltrados (monócitos / macrófagos) e também para estimar neurônios sobreviventes ou mesmo para a neurogênese quantificação após acidente vascular cerebral. O passo mais importante para uma estimativa exacta da área desejada é a selecção dos parâmetros apropriados, como os mostrados na Tabela 3, para a quantificação de neutrófilos na região isquémica.Estes parâmetros serão usados ​​para o software de estereologia para calcular o número total de células positivas para (N), usando a equação N = ΣQ- x 1 / ssf x 1 / asf x 1 / tsf (ΣQ- é o número total de células contadas com o de fraccionamento, SSF é a fração de amostragem seção, asf é a área fração de amostragem, e tsf é a espessura fração de amostragem) 5. Embora esta metodologia é mais lento do que outras técnicas de quantificação (por exemplo, análise de marcadores de neutrófilos por mg de tecido, densitometria de imagens ou o número de neutrófilos por campo representativo), que tem a vantagem de ser uma técnica imparcial e um sólido que proporciona uma precisão quantificação do número de células. A abordagem isolamento de leucócitos cérebro permite uma identificação e quantificação simultânea de vários subtipos de células imunológicas, sem a necessidade de influenciar o sistema por coloração in vivo ou manipulações genéticas. Célula subsequente triagem do mielóide p caracterizadoopulations ou a sua separação imunomagnética pode ser usado para várias aplicações a jusante, tais como outros estudos sobre gene ou expressão da proteína. A caracterização precisa de neutrófilos, monócitos e microglia obtidos com este método proporciona uma elevada especificidade em relação a métodos existentes, tais como os estudos de imuno-histoquímica, uma vantagem que permite a atribuição de funções específicas para as diferentes células mielóides cérebro que medeiam a resposta imune inata. Além disso, ela pode ser alargada de modo a caracterizar outras populações de cérebro com o rótulo adequado, como através do sangue, macrófagos (CD11b CD45 + CD68 + oi), e pode ser aplicado para o estudo de outras patologias do SNC ou ferimentos. Portanto, esta técnica fornece uma ferramenta essencial para explorar a heterogeneidade da resposta inflamatória no cérebro. A principal limitação desta técnica reside na preparação das suspensões de leucócitos a partir de tecido cerebral fresco, o que pode alterar oestado de activação das células ou das suas alterações antigénio. Embora esta técnica permite uma caracterização qualitativa mais detalhada em relação aos estudos de imuno-histoquímica, ele fornece uma quantificação menos precisas com base em isolamento celular. Apesar disso, a eficiência de nosso protocolo de isolamento de células é semelhante a outras metodologias publicadas e 9 pode ser eficientemente usado para detectar diferenças no número de células do sistema imunológico do cérebro entre o controlo e grupos MCAO ou mesmo entre grupos MCAO submetidos a diferentes tratamentos 8. As etapas críticas do presente protocolo são a dissecção dos tecidos, o procedimento de rompimento do tecido, e a remoção da mielina. Em relação à coleta de tecido, uma etapa de normalização podem ser incluídos (por pesagem do tecido coletado) para evitar a variabilidade devido a diferentes performances de dissecação. Além disso, a normalização entre diferentes grupos MCAO também pode ocorrer através do volume de enfarte (previamente determinada por R Magnéticaesonance). Outra maneira de resolver este problema é a utilização de todo o hemisfério ipsilateral de ambos os grupos isquémicos e de controlo, ou mesmo utilizar o hemisfério contralateral do rato isquémica como controlo, para minimizar o número de animais utilizados. Embora esta abordagem evita a diferenças entre cada dissecção, tem uma desvantagem principal; um factor de diluição é adicionado através do aumento do número total de células, mas não o número de células mielóides, que estão localizados exclusivamente no núcleo e peri-enfarte áreas do córtex ipsilateral. Quanto rompimento do tecido, este protocolo ilustra as etapas para a ruptura mecânica das células do cérebro, evitando tratamentos enzimáticos e prevenir superfície antígeno alteração 9,22, uma questão essencial para posterior análise qualitativa e quantitativa das subpopulações de células inflamatórias. Para além da preparação da suspensão de células de interesse, a remoção de amostras de cérebro de mielina é um passo altamente recomendado para evitar a interferência com downstaplicações resma, como a separação de células imunomagnï¿½ica ou citometria de fluxo 23,24. Isto pode ser realizado através de diferentes métodos, tais sacarose ou gradientes de Percoll, ou grânulos anti-mielina. Aqui, e com base em estudos anteriores que comparam diferentes métodos para isolamento suspensão de células do cérebro, ruptura mecânica em combinação com o uso de Percoll para remover mielina é usado para melhorar a produção e viabilidade celular 25.

Morfológicas fenotípica, e expressão do gene de alterações da microglia, bem como o extravasamento e a activação de macrófagos e neutrófilos haematogï¿½ea Acredita-se que desempenham um papel fundamental na cascata fisiopatológica após lesão cerebral 1-4. Este protocolo prevê duas abordagens para estimar o número de diferentes subpopulações de células mielóides do cérebro isquêmico e para realizar sua caracterização fenotípica. Além disso, também proporciona uma descrição de um modelo experimental de isquemia cerebral em ratos, que consiste na ligação permanente ou transitória de ambas Artéria Cerebral Média distal (ACM) e da artéria carótida comum (ACC), incluindo a forma de avaliar a enfarte pelo método Cavalieri precisa utilizando um software de estereologia. A primeira abordagem para caracterizar as subpopulações de células mielóides do cérebro isquémico é um método de estereologia com base na abordagem de fraccionamento óptico 5. Este é o maiscomumente usado sonda estereologia em ciências da vida e fornece um alto grau de precisão, com baixos coeficientes de erro 5-7. Esta é a melhor escolha para quantificação celular quando o tecido é cortado em secções, uma vez que evita o viés sobre a estimativa da célula devido à fragmentação do tecido em secções. Este método é uma forma muito poderosa para caracterizar os números, a dinâmica e as mudanças fenotípicas de subpopulações de neutrófilos infiltrados do tecido isquêmico 8. A segunda abordagem baseia-se na caracterização de um protocolo modificado a partir Campanella e colaboradores 9 que proporciona um modo simples para isolar suspensões cerebrais de leucócitos e para os caracterizar por citometria de fluxo. Em contraste com técnicas de imunohistoquímica convencionais, citometria de fluxo caracterização permite a diferenciação entre microglia (CD45 lo CD11b +) e infiltrado células mielóides (CD45 oi CD11b +) com base em sua diffos níveis de expressão de CD45 erent 9-13. Além disso, os monócitos pró-inflamatórias (CD45 oi CD11b + Ly-6G - Ly-6C oi), neutrófilos (CD45 oi CD11b + Ly-6G +) e outros subconjuntos de leucócitos no tecido isquémico podem ser distinguidos. Esta abordagem proporciona um ensaio rápido e fiável para avaliar neuroinflamaï¿½o em modelos de isquemia cerebral. No entanto, o processamento de tecidos podem influenciar o estado de activação e os números das diferentes populações de células presentes no tecido isquémico fornecendo uma caracterização semi-quantitativa.

<table><tbody><tr>Controlador de Temperatura de <td>Equipamento Photonic Led F1</td><td>WPI</td><td>571329-8</td><td></td></tr>&<tr><td>nbsp;</td><td>Panlab&nbsp;</td><td>HB 101/2</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Volvere GX</td><td>NSK</td><td>Ne22L</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td></td><td>Microscópio WPI</td><td>PZMIII-BS</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Aço Inoxidável Burrs</td><td>FST</td><td>19007-14</td><td>Material cirúrgico</td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #5/45&nbsp;</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td>Material cirúrgico</td></tr><tr><td>Fórceps Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td>Material cirúrgico</td></tr><tr><td>Sutura 6/0</td><td>LorcaMarin</td><td>55108</td><td>Material cirúrgico</td></tr><tr><td>Sutura 9/0</td><td>LorcaMarin</td><td>61966</td><td>Material cirúrgico</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>TE300</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Esteve</td><td>571329-8</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Pentobarbital de Sódio</td><td>Vetoquinol</td><td>570681</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo de Congelamento Químico</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>SM2000R</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Superfrost slides</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>2014-07 Material de</td><td>laboratório</td></tr><tr><td>Acetato violeta</td><td>Cresyl Sigma</td><td>C5042</td><td>Microscópio Químico</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TE300</td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>XYZ estágio de computador motorizado e controlador</td><td>Ludl electronics Produtos</td><td></td><td>Equipamento</td></tr><tr><td>Sistema de Investigação Estéreo</td><td>Microbrightfield</td><td>Versão 7.003 Software</td><td>Software</td></tr><tr><td>5 ml Moedor de tecidos, Potter-Elv com pilão de teflon</td><td>Thomas Scientific</td><td>0913X70</td><td>Material</td></tr><tr><td>de laboratório Polipropileno 50 ml Oak Ridge Tubo de Centrífuga</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050&nbsp;</td><td>Material de laboratório</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma</td><td>p1644-100</td><td>Químico</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifugue</td><td>Beckman Coulter Equipamento Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ultracentrífuga 45 Ti Beckman</td><td>Coulter</td><td></td><td>Equipamento</td></tr> BD <tr><td>Filtro de células estéreis, 40 mícrons</td><td>BD</td><td>BD 352340</td><td>Material</td></tr> <tr><td>de laboratórioAlbumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A3733-500G</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>FcR bloqueando reagente, camundongo</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-575</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>CD11b-FITC, humano e camundongo</td><td>Miltenyi</td><td>130-098-085</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>CD45-PE, camundongo</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-596</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Anti-Ly-6G-APC, camundongo</td><td>Miltenyi</td><td>130-102-936</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 anti-rato Ly-6C</td><td>Biolegend</td><td>128012</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>BD FACS Flow</td><td>BD</td><td>342003</td><td>Reagment</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur; Equipamento BD 342975 de 4 cores</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Cell Quest Pro Software</td><td>BD</td><td>Software</td>FlowJo <td></td></tr><tr><td>software</td><td>Treestar inc.</td><td></td><td>software</td></tr></tbody></table>

estereológica e citometria de fluxo caracterização de leucócitos subpopulações em modelos de transitórias ou permanentes cerebral isquemia

Stereological and Flow Cytometry Characterization of Leukocyte Subpopulations in Models of Transient or Permanent Cerebral Ischemia

Activação da microglia, bem como o extravasamento de neutrófilos e macrófagos haematogï¿½ea, acredita-se desempenhar um papel crucial na lesão cerebral após apoplexia. Estas subpopulações de células mielóides pode exibir diferentes fenótipos e funções e devem ser diferenciadas e caracterizados para estudar sua regulação e contribuição para o dano tecidual. Este protocolo prevê duas metodologias diferentes para cérebro caracterização de células imunes: uma abordagem da estereologia precisa e uma análise de citometria de fluxo. A abordagem estereologia baseia-se no método de fraccionamento da óptica, o qual calcula o número total de células em uma área de interesse (cérebro enfartado) estimada por amostragem aleatória sistemática. A segunda abordagem caracterização oferece uma maneira simples para isolar suspensões de leucócitos cérebro e caracterizá-los por citometria de fluxo, permitindo a caracterização de microglia, monócitos e neutrófilos infiltrados do tecido isquémico. Além disso, também details um modelo de isquemia cerebral em camundongos que afeta exclusivamente córtex cerebral, gerando infartos altamente reprodutíveis com uma baixa taxa de mortalidade, bem como o procedimento para o processamento cerebral histológico para caracterizar o volume de enfarte pelo método de Cavalieri.

O modelo de isquemia cerebral mostrado aqui gera enfarte observados exclusivamente no córtex sem afectar o tecido estriado uma vez que os ramos lenticulostriatal da MCA que irrigam o corpo estriado não são ocluídas (Figura 1). Por coloração de Nissl, a área danificada pode ser identificado como uma área cortical hipocrômico (Figura 2). Este modelo caracteriza-se por os volumes de enfarte altamente reprodutíveis às 24 horas após a MCAO (IH 15,89% ± 0,28) estimada pelo método de Nissl Cavalieri em secções coradas (Figura 2). A estimativa do volume enfartada pelo método Cavalieri é uma abordagem precisa com um erro de baixo que se reflecte no coeficiente de erros (CE) de Gundersen nos hemisférios contralesional e ipsilesional, bem como na área enfartada (Tabela 2). Volume de tecido danificado pode ser expressa em mm 3, mas também como% IH usando a fórmula na secção 3.2.13. Além disso, a estimativado volume total das regiões ipsilesional contralesional e permitem o cálculo do índice do edema para corrigir o volume com enfarte e para evitar uma sobreavaliação do tecido danificado (Tabela 2). Dado o processamento cortes seriados do tecido cerebral, o que pode ser aproveitado para realizar uma estimativa exacta do número total de sub-populações de células, como os neutrófilos infiltrados, na área isquémica, utilizando a abordagem Fracionador óptica (Figura 3 e Tabela 4) com os parâmetros apresentados na Tabela 3. Este protocolo prevê um número total de neutrófilos (glóbulos Ly6G-positivos) na área infartada de 23.328 ± 3.623 às 24 horas e 82.856 ± 8.143 em 48 horas em camundongos após pMCAO (Figura 3D). De acordo com estudos anteriores, a infiltração de neutrófilos está diretamente relacionada com o tamanho do infarto (Figura 3E). Estimativa de tele número de neutrófilos pelo método Fracionador óptica é uma abordagem precisa com um erro baixa que é reflectida pela CE de Gundersen (Tabela 4). O isolamento de leucócitos por citometria de fluxo e caracterização protocolo permite o isolamento de 47.922 ± 23.174 células mielóides do córtex do hemisfério ipsilesional de ratos isquémicos. Este compreende 10-30% do total de eventos encontrados na suspensão de células. A grande maioria dos eventos capturados usando esse protocolo de presente um parâmetro baixo FSC, associado a restos celulares (Figura 4). CD11b coloração mostra que as células CD11b + tem um valor maior do FSC (Figura 4), ​​sugerindo que os detritos celulares não é marcado com este marcador e, como indicado anteriormente, que podem ser excluídos de análises posteriores definindo o limite FSC em 200 9. O montante variável de restos celulares obtidos com este método sugere que as diferenças no processo de amostraing (calendário, conservação de tecidos, a temperatura da amostra, a remoção da mielina eficiente, etc.) podem ser responsáveis ​​por isso. Além disso, também é necessário o uso de filtros de células para evitar a presença de grampos celulares nas amostras; este passo tem de ser feito antes da coloração das células. Usando a estratégia de gating mostrado na Figura 5, que é baseado em CD11b e expressão de CD45, que pode discriminar entre residentes e células mielóides infiltradas no tecido isquémico. Esta população CD11b + aumentos no hemisfério isquêmico quando comparado com o ingênuo e com o grupo sham, em que estas células são geralmente associada a uma baixa expressão de CD45 indicando que microglia está proliferando após isquemia (Figura 4, Figura 5 e Tabela 5) . Esta diferença é provavelmente devido à infiltração de células a partir da periferia, como evidenciado pelo aparecimento de um CD11b CD45 + subpopulação de células oi no cérebro isquémico (Figura 4, A Figura 5 e Tabela 5) que é baixa no número ingênua e em cérebros sham. A contribuição de infiltrados para a população de células CD11b + em isquemia cerebral é um processo muito dinâmico 4. No modelo MCAO por ligadura, que pode variar de 30% a 60% do total de células CD11b +, dependendo do tamanho da lesão e do momento em que a caracterização foi feita. Os neutrófilos, caracterizadas como células Ly-6G +, são a população de células mais numerosas infiltrada encontradas em 24 horas após a MCAO no cérebro isquémico rato usando este modelo de isquemia cerebral, uma vez que compreendem a 70-80% do CD11b CD45 + oi. O restante das células são na sua maioria uma subpopulação de CD11b CD45 + hi Ly-6G - Ly-6C hi monócitos pró-inflamatórias. Neste modelo, a população vai aumentar em número em áreas cerebrais isquémicos de 24 a 48 horas após a MCAO. Figura 1:. O procedimento cirúrgico para a ligadura MCA (A) Após a retracção do músculo temporal, uma pequena craniotomia é realizada no crânio do rato. MCA é ligado por um nó ou um nó corrediço usando uma sutura 9/0. (B) Imagens representativas da lesão cortical gerado pelo modelo MCAO. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig2.jpg"> Figura 2: Quantificação do volume de infarto por Cavalieri. (A) Imagens representativas de secções de cérebro coradas Nissl-24 h após a ligadura permanente da MCA. A alta ampliação mostra a área hipocromatic após coloração Nissl queidentifica a área danificada (núcleo) após MCAO. O (PI) região peri-enfarte também é mostrada. (B) Quantificação do volume de enfarte representado como% Hemisfério enfarte (% IH), utilizando o método Cavalieri, em secções coradas Nissl-série, 24 horas após a MCAO (n = 50 murganhos ). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig3.jpg"> Figura 3: Estereológica quantificação de neutrófilos na área enfartada 24 e 48 horas após a ligação, utilizando o método Fracionador óptica. (A) Imagem representativa de neutrófilos infiltrados (células Ly6G-positivos) na área isquêmica em 24 horas após MCAO. Delimitação mostra a área enfartada. (B, C) ​​Exemplos de um dissector óptico para quantificação de neutrófilos pelo fraccionador óptico. (D) Quantificação de neutrófilos totais da região enfartada em 24 e 48 h (n = 4 ratos). (E)A correlação entre o número de neutrófilos com o tamanho do infarto em 24 e 48 horas após a ligadura MCA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig4.jpg"> Figura 4:. Análise dot-gráfico de dispersão representativas de leucócitos cerebrais obtidos a partir de hemisférios naïve, sham e isquémica (24 horas após a MCAO) sobre a base de parâmetros físicos (SSC e FSC) Uma população de eventos que expressam CD11b (vermelho) foi identificado em todos os grupos. Essa população foi fechado e caracterizados de acordo com a expressão de CD45. As células que expressam níveis baixos de CD45 (verde) estavam presentes no córtex isquémico e não-isquémica cerebral e correspondeu às células microgliais. Em contraste, as células que expressam níveis elevados de CD45 (amarelo) foram apenasencontrada no hemisfério isquêmica e em menor grau no grupo sham. Uma análise mais aprofundada da população oi CD11b + CD45 indica que os neutrófilos (Ly-6G + células, azul) e pró-inflamatórios monócitos (células Ly-6C hi, laranja) são os principais subpopulações de células encontradas no cérebro infiltra 24 horas após o AVC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52031/52031fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52031/52031fig5.jpg"> Figura 5:. Gating estratégias para diferenciar residente de células mielóides infiltradas no tecido isquémico CD11b + células foram primeiro fechado de acordo com a intensidade de fluorescência do isotipo (O). Um gráfico representativo do ponto de suspensões de células do cérebro isquémico é mostrado no canto superior direito do painel. EmAdicionalmente, os valores típicos para o número total de eventos e para o número de CD11b + fenómenos adquiridos usando esta técnica é mostrado (não de células / hemisfério cerebral isquémica;. (A) análise de intensidade de fluorescência de CD45 das células CD11b + é mostrada no painel B. A análise de gráfico representativo do ponto de CD45 e CD11b expressão do CD11b + subpopulação fechado é mostrado no canto superior direito do painel. Além disso, o número típico de células CD45 hi lo CD45 adquiridos por hemisfério cerebral isquêmico usando esta técnica é mostrado (B). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="2"></colgroup><tbody><tr><td colspan="2"> Parâmetros utilizados para o método de Cavalieri </td></tr><tr><td> Seção de espessura (t) </td><td> 30 pm </td></tr><tr><td> Objetivo </td><td> 10X </td></tr><tr><td> Fração de amostragem Slice (SSF) </td><td> 1/ 20 </td></tr><tr><td> Distância entre as seções </td><td> 600 pm </td></tr><tr><td> Espaço da Grelha </td><td> 100 pm </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Parâmetros utilizados para a quantificação da estereologia do tecido enfartado. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Resultados </td><td> Contralesional </td><td> Ipsilesional </td><td> Infarto </td></tr><tr><td> Área (μm²) </td><td> 151460000 </td><td> 155060000 </td><td> 22600000 </td></tr><tr><td> Volume (μm³) </td><td> 90876000000 </td><td> 93036000000 </td><td> 13560000000 </td></tr><tr><td> Volume Corrigido para Ao longo da projeção (μm³) </td><td> 89957100000 </td><td> 92046300000 </td><td> &lt;strong&gt; 13416600000 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), m = 0 </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), m = 1 </td><td> 0,015 </td><td> 0,017 </td><td> 0,015 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), alfa (q) </td><td> 0,068 </td><td> 0,077 </td><td> 0,067 </td></tr><tr><td colspan="2"> % Hemisfério Infarto </td><td colspan="2"> 14.90 </td></tr><tr><td colspan="2"> Cérebro Edema (Ips Vol / Vol Cont) </td><td colspan="2"> 1.02 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: Exemplos representativos de volumes contralesional, ipsilesional e infarto pelo método de Cavalieri usando o Software Investigador Stereo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colde span='"2"&gt;'>parâmetros usados ​​para o fraccionamento da Optical </td></tr><tr><td> Seção Espessura (TSF) </td><td> 30 pm </td></tr><tr><td> Objetivo </td><td> 100X </td></tr><tr><td> Fração de amostragem Slice (SSF) </td><td> 1/10 </td></tr><tr><td> Contando Quadro Altura </td><td> 40 pm </td></tr><tr><td> Contando Largura do quadro </td><td> 40 pm </td></tr><tr><td> Tamanho da grade X </td><td> 230 pm </td></tr><tr><td> Tamanho da grade X </td><td> 230 pm </td></tr><tr><td> Safe Guard </td><td> 2 pm </td></tr><tr><td> Optical Disector Altura </td><td> 14 mm </td></tr></tbody></table> Tabela 3: Parâmetros utilizados para a quantificação estereológica de neutrófilos infiltrados após isquemia cerebral com a sonda de fraccionamento da óptica usando o Software Investigador Stereo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing='"0"&gt;'><tr><td colspan="2"> Estimativa de neutrófilos pelo Fracionador óptica </td></tr><tr><td> Número de locais de amostragem </td><td> 430 </td></tr><tr><td> Forma Fator </td><td> 6.24 </td></tr><tr><td> Total de marcadores Contado </td><td> 166 </td></tr><tr><td> Os neutrófilos estimadas por Fracionador Optical </td><td> 117,608.03 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), m = 0 </td><td> 0,22 </td></tr><tr><td> Coeficiente de Erro (Gundersen), m = 1 </td><td> 0,09 </td></tr></table> Tabela 4: Exemplo representativo dos neutrófilos infiltrados estimado após isquemia cerebral com a sonda Fracionador óptica usando o Software Investigador Stereo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> CD11b + </td><td> Os neutrófilos </td><td> Os monócitos </td><td> Microglia </td></tr><tr><td> Ingénuo </td><td> 25.863 ± 4,575.8 </td><td> 473 ± 75,8 </td><td> 525 ± 191,4 </td><td> 19.012 ± 1.523 </td></tr><tr><td> Sham 24 hr </td><td> 24.563 ± 5.263 </td><td> 873 ± 192,5 </td><td> 1.124 ± 391,5 </td><td> 23.734 ± 2.910 </td></tr><tr><td> pMCAO 24 hr </td><td> 47.922 ± 23.174 </td><td> 4874 ± 748,7 </td><td> 4,826 ± 1,345 </td><td> 35.395 ± 10.833 </td></tr></tbody></table> Tabela 5: Resultados representativos das células mielóides estimados após a isquemia cerebral com a abordagem por citometria de fluxo.

Cérebro células mielóides caracterização de acidente vascular cerebral pode ser realizada por estereologia usando o método de fraccionamento da óptica, ou por uma análise de citometria de fluxo de suspensões cérebro leucócitos. Ambos são técnicas úteis para realizar uma distinção fenotípica acurada dos principais subpopulações de células mielóides encontrados no cérebro isquêmico.

Estereológica e Citometria de Fluxo Caracterização de Leucócitos subpopulações em modelos de transitórias ou permanentes Cerebral Isquemia

Microglia activation, as well as extravasation of haematogenous macrophages and neutrophils, is believed to play a pivotal role in brain injury after ...

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar subconjuntos de células mieloides de camundongos do cérebro isquêmico por duas metodologias diferentes. Primeiro, um modelo permanente de isquemia cerebral é introduzido por oclusão, tanto a artéria carótida comum ou CCA quanto o tronco distal da artéria cerebral média ou MCA, gerando infarto que afeta principalmente o córtex cerebral. Então, para a quantificação estereológica dos subconjuntos de células mieloides, seções coronais seriais do cérebro são imunocoradas para as células de interesse e, em seguida, as células infiltradas são quantificadas pela abordagem do fracionador óptico.Alternativamente, as células mieloides podem ser isoladas do tecido cerebral fresco por dissociação mecânica e, em seguida, coradas e analisadas por citometria de fluxo. Em última análise, uma quantificação precisa e uma caracterização qualitativa detalhada dos subconjuntos específicos de células mieloides que se infiltram no cérebro do camundongo após isquemia cerebral podem ser alcançadas por quantificação estéreo e citometria de fluxo multiparamétrica, respectivamente. A principal vantagem deste modelo seriado de isquemia em relação a outros existentes é que nossa técnica tem taxas de mortalidade significativamente menores do que outros métodos, minimizando o número de animais necessários para o estudo.Esta área me dá um método que pode ajudar a responder a questões-chave no campo do AVC, como quais são os papéis da microrreativação, extravasamento de macrófagos hematogênicos ou neutrófilos na lesão cerebral? A quantificação teológica precisa nas abordagens de citometria multiparamétrica demonstradas neste artigo pode fornecer informações sobre o número, fenótipo e função da população de células mielóides em ambas as respostas imunes inatas à isquemia CE. Para ligar o CCA primeiro, faça uma incisão na linha média de um centímetro ao redor da superfície ventral do pescoço do animal sob um microscópio cirúrgico.Uma vez dissecado, use uma sutura de náilon de seis zero para ocluir a ACC esquerda com um nó permanente para ligar a ACM distal. Em seguida, faça uma incisão horizontal no músculo temporal da direita para a esquerda. Em seguida, faça uma segunda incisão vertical no lado direito do músculo temporal.Tomando cuidado para evitar cortar a veia temporal. Separe o músculo temporal do crânio e segure-o com uma sutura para manter a superfície do crânio limpa. Em seguida, limpe o crânio com solução salina estéril fria para detectar a posição exata da ACM esquerda por meio da transparência do crânio.Uma vez identificada a ACM, use uma broca de aço inoxidável para realizar uma craniotomia redonda de um milímetro no lobo frontal entre o arco zigomático e o osso escamal. Remova cuidadosamente o crânio expondo o MCA. Em seguida, use uma sutura de náilon com nove zero para ocluir a ACM esquerda no tronco distal imediatamente antes da bifurcação entre os ramos frontal e posterior da ACM com um nó permanente.Para remover o cérebro, decapite o camundongo sacrificado logo acima da medula espinhal e faça uma incisão anterior posterior na pele para expor o crânio. Em seguida, faça dois cortes laterais na junção das paredes laterais e da base do crânio e remova o pequeno pedaço de osso. Em seguida, faça um corte no crânio ao longo da sutura sagital e use uma pinça para remover o crânio que cobre cada hemisfério para expor o cérebro.Use uma espátula para separar o cérebro do crânio e transfira-o para uma solução de PFA a 4%. Após três horas, remova o PFA e incube o cérebro em uma solução de sacarose a 30% para crioproteger o cérebro. Após 48 horas, remova a solução de sacarose e congele o cérebro rapidamente em pentano isop negativo de 40 graus Celsius e, em seguida, use um micrótomo de congelamento para fazer seções cerebrais coronais de 30 micrômetros.Coleta de 10 conjuntos seriais em uma solução crioconservante. Cada conjunto serial é composto por cerca de 14 a 16 cortes coronais com uma distância entre cortes de 300 micrômetros. Garantir uma amostragem adequada do cérebro do camundongo entre 1,94 e 2,46 negativos posterior ao bgma para estimar o número total de neutrófilos infiltrados.Após a oclusão da MCA por um fracionador óptico, primeiro imunocorar os neutrófilos com o anticorpo anti LY seis G de rato e o anticorpo secundário apropriado em seções flutuantes pela técnica convencional de imunofluorescência. Em seguida, monte as seções cerebrais em lâminas de microscópio super frosts com a área infartada colocada à direita e abra o software de investigação estéreo. Em seguida, clique no menu do gerenciador de seção serial de ferramentas e adicione uma nova seção com o botão de nova seção.Defina o intervalo de avaliação como 10 para uma fração de amostragem de uma 10ª fatia. E, em seguida, no menu de contorno para baixo, selecione a ferramenta de contorno de área infartada. Desenhe um contorno para delinear a área infartada sob a objetiva 10 x.Em seguida, mude para a objetiva de 100 x no microscópio e no menu da objetiva. Para quantificar os neutrófilos no menu de sondas, agora selecione o fracionador óptico e defina o posicionamento XY dos quadros de contagem para 230 para os tamanhos de grade X e Y. Agora selecione o botão de neutrófilos na barra de marcação e marque os neutrófilos corados na área infartada.Exporte os resultados da quantificação para um arquivo de planilha para dissociar o cérebro em uma única suspensão celular. Depois de remover o cérebro como acabamos de demonstrar, disseque as áreas central e perfarto do córtex ipsilateral do cérebro de um camundongo isquêmico cerebral. Pese o tecido cerebral e coloque-o em cinco mililitros de RPMI gelado por chamada para normalização entre os grupos experimentais e, em seguida, use um moedor de tecido com pilões de Teflon para dissociar o tecido em uma única suspensão celular.Transfira as suspensões de células para um tubo de ultracentrífuga de 50 mililitros e adicione mais cinco mililitros de RPMI por solução de chamada às amostras. Em seguida, depois de centrifugar as suspensões celulares por 30 minutos a 7.800 GS e 25 graus Celsius. Certifique-se de que uma camada de cor branca correspondente à mielina apareça na parte superior da solução.Remova cuidadosamente a camada de mielina e filtre toda a suspensão celular, incluindo as células peletizadas, através de um filtro de malha de nylon de 40 micrômetros. Lave o filtro com 10 mililitros de RPMI para garantir que todas as células sejam filtradas através da malha e, em seguida, transfira a solução para um tubo de 50 mililitros. Adicione 20 mililitros de RPMI às células e, depois de girar para baixo, as células ressuspendem o pellet leucocitário.Em um mililitro de PBS, incube as células por dois a três minutos em quatro mililitros de tampão de lise à temperatura ambiente para alimentar os eritrócitos e, em seguida, girar as células. Rotule as células em 200 microlitros de PBS contendo 1% de BSA e os anticorpos apropriados no gelo. Em seguida, após 45 minutos, lave as amostras com um mililitro de PBS frio e ressuspenda novamente os pellets em 100 microlitros de tampão de fluxo de fax para análise de citometria de fluxo.Este modelo é caracterizado por volumes de infarto altamente reprodutíveis 24 horas após a oclusão da artéria cerebral média, conforme estimado pelo método cavalieri. Em cortes corados nial, de acordo com estudos anteriores, a infiltração de neutrófilos está diretamente correlacionada com o tamanho do infarto. Além disso, o isolamento leucocitário e a caracterização por citometria de fluxo permitem o isolamento de células mieloides do córtex do hemisfério lesional do IPS de camundongos isquêmicos, que compreendem 10 a 30% do total de eventos encontrados na suspensão celular e apresentam um parâmetro de baixo espalhamento frontal associado a detritos celulares.As células CD 11 B positivas têm um valor de dispersão frontal mais alto, sugerindo que os detritos celulares não são marcados com este marcador e, como indicado anteriormente, que podem ser excluídos de análises posteriores definindo o limite FSC em 200 neutrófilos caracterizados como LY seis células G positivas são a população de células infiltradas mais numerosa encontrada 24 horas após a oclusão da MCA no cérebro isquêmico de camundongos usando este modelo de isquemia cerebral e compreendem 70 a 80% das células CD 11 B positivas para CD 45 altas. O resto das células são principalmente uma subpopulação de CD 11 B, CD 45 positivo, LY alto seis G, negativamente seis C monócitos pró-inflamatórios altos, que são encontrados em números elevados nas áreas isquêmicas do cérebro de 24 a 48 horas após a oclusão da artéria cerebral média. Este modelo P-M-C-A-O pode ser realizado em 30 minutos se for realizado corretamente seguindo o procedimento de citometria de fluxo.Outros métodos, como a classificação de um subconjunto de células específico, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais são os padrões de expressão, alterações metabólicas ou atividades acéticas das células mieloides neste sistema modelo. Depois de assistir a este vídeo, apenas para ter uma boa compreensão de como criar um modelo de isquemia e, o mais importante, como caracterizar o número e o fenótipo das células mieloides infiltrantes por duas abordagens diferentes em uma lesão cerebral de camundongo ou tpe após modelo de isquemia cere.

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Estereológica e Citometria de Fluxo Caracterização de Leucócitos subpopulações em modelos de transitórias ou permanentes Cerebral Isquemia (Vídeo) | JoVE Journal

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