Estereológica e Citometria de Fluxo Caracterização de Leucócitos subpopulações em modelos de transitórias ou permanentes Cerebral Isquemia

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar subconjuntos de células mieloides de camundongos do cérebro isquêmico por duas metodologias diferentes. Primeiro, um modelo permanente de isquemia cerebral é introduzido por oclusão, tanto a artéria carótida comum ou CCA quanto o tronco distal da artéria cerebral média ou MCA, gerando infarto que afeta principalmente o córtex cerebral. Então, para a quantificação estereológica dos subconjuntos de células mieloides, seções coronais seriais do cérebro são imunocoradas para as células de interesse e, em seguida, as células infiltradas são quantificadas pela abordagem do fracionador óptico.

Alternativamente, as células mieloides podem ser isoladas do tecido cerebral fresco por dissociação mecânica e, em seguida, coradas e analisadas por citometria de fluxo. Em última análise, uma quantificação precisa e uma caracterização qualitativa detalhada dos subconjuntos específicos de células mieloides que se infiltram no cérebro do camundongo após isquemia cerebral podem ser alcançadas por quantificação estéreo e citometria de fluxo multiparamétrica, respectivamente. A principal vantagem deste modelo seriado de isquemia em relação a outros existentes é que nossa técnica tem taxas de mortalidade significativamente menores do que outros métodos, minimizando o número de animais necessários para o estudo.

Esta área me dá um método que pode ajudar a responder a questões-chave no campo do AVC, como quais são os papéis da microrreativação, extravasamento de macrófagos hematogênicos ou neutrófilos na lesão cerebral? A quantificação teológica precisa nas abordagens de citometria multiparamétrica demonstradas neste artigo pode fornecer informações sobre o número, fenótipo e função da população de células mielóides em ambas as respostas imunes inatas à isquemia CE. Para ligar o CCA primeiro, faça uma incisão na linha média de um centímetro ao redor da superfície ventral do pescoço do animal sob um microscópio cirúrgico.

Uma vez dissecado, use uma sutura de náilon de seis zero para ocluir a ACC esquerda com um nó permanente para ligar a ACM distal. Em seguida, faça uma incisão horizontal no músculo temporal da direita para a esquerda. Em seguida, faça uma segunda incisão vertical no lado direito do músculo temporal.

Tomando cuidado para evitar cortar a veia temporal. Separe o músculo temporal do crânio e segure-o com uma sutura para manter a superfície do crânio limpa. Em seguida, limpe o crânio com solução salina estéril fria para detectar a posição exata da ACM esquerda por meio da transparência do crânio.

Uma vez identificada a ACM, use uma broca de aço inoxidável para realizar uma craniotomia redonda de um milímetro no lobo frontal entre o arco zigomático e o osso escamal. Remova cuidadosamente o crânio expondo o MCA. Em seguida, use uma sutura de náilon com nove zero para ocluir a ACM esquerda no tronco distal imediatamente antes da bifurcação entre os ramos frontal e posterior da ACM com um nó permanente.

Para remover o cérebro, decapite o camundongo sacrificado logo acima da medula espinhal e faça uma incisão anterior posterior na pele para expor o crânio. Em seguida, faça dois cortes laterais na junção das paredes laterais e da base do crânio e remova o pequeno pedaço de osso. Em seguida, faça um corte no crânio ao longo da sutura sagital e use uma pinça para remover o crânio que cobre cada hemisfério para expor o cérebro.

Use uma espátula para separar o cérebro do crânio e transfira-o para uma solução de PFA a 4%. Após três horas, remova o PFA e incube o cérebro em uma solução de sacarose a 30% para crioproteger o cérebro. Após 48 horas, remova a solução de sacarose e congele o cérebro rapidamente em pentano isop negativo de 40 graus Celsius e, em seguida, use um micrótomo de congelamento para fazer seções cerebrais coronais de 30 micrômetros.

Coleta de 10 conjuntos seriais em uma solução crioconservante. Cada conjunto serial é composto por cerca de 14 a 16 cortes coronais com uma distância entre cortes de 300 micrômetros. Garantir uma amostragem adequada do cérebro do camundongo entre 1,94 e 2,46 negativos posterior ao bgma para estimar o número total de neutrófilos infiltrados.

Após a oclusão da MCA por um fracionador óptico, primeiro imunocorar os neutrófilos com o anticorpo anti LY seis G de rato e o anticorpo secundário apropriado em seções flutuantes pela técnica convencional de imunofluorescência. Em seguida, monte as seções cerebrais em lâminas de microscópio super frosts com a área infartada colocada à direita e abra o software de investigação estéreo. Em seguida, clique no menu do gerenciador de seção serial de ferramentas e adicione uma nova seção com o botão de nova seção.

Defina o intervalo de avaliação como 10 para uma fração de amostragem de uma 10ª fatia. E, em seguida, no menu de contorno para baixo, selecione a ferramenta de contorno de área infartada. Desenhe um contorno para delinear a área infartada sob a objetiva 10 x.

Em seguida, mude para a objetiva de 100 x no microscópio e no menu da objetiva. Para quantificar os neutrófilos no menu de sondas, agora selecione o fracionador óptico e defina o posicionamento XY dos quadros de contagem para 230 para os tamanhos de grade X e Y. Agora selecione o botão de neutrófilos na barra de marcação e marque os neutrófilos corados na área infartada.

Exporte os resultados da quantificação para um arquivo de planilha para dissociar o cérebro em uma única suspensão celular. Depois de remover o cérebro como acabamos de demonstrar, disseque as áreas central e perfarto do córtex ipsilateral do cérebro de um camundongo isquêmico cerebral. Pese o tecido cerebral e coloque-o em cinco mililitros de RPMI gelado por chamada para normalização entre os grupos experimentais e, em seguida, use um moedor de tecido com pilões de Teflon para dissociar o tecido em uma única suspensão celular.

Transfira as suspensões de células para um tubo de ultracentrífuga de 50 mililitros e adicione mais cinco mililitros de RPMI por solução de chamada às amostras. Em seguida, depois de centrifugar as suspensões celulares por 30 minutos a 7.800 GS e 25 graus Celsius. Certifique-se de que uma camada de cor branca correspondente à mielina apareça na parte superior da solução.

Remova cuidadosamente a camada de mielina e filtre toda a suspensão celular, incluindo as células peletizadas, através de um filtro de malha de nylon de 40 micrômetros. Lave o filtro com 10 mililitros de RPMI para garantir que todas as células sejam filtradas através da malha e, em seguida, transfira a solução para um tubo de 50 mililitros. Adicione 20 mililitros de RPMI às células e, depois de girar para baixo, as células ressuspendem o pellet leucocitário.

Em um mililitro de PBS, incube as células por dois a três minutos em quatro mililitros de tampão de lise à temperatura ambiente para alimentar os eritrócitos e, em seguida, girar as células. Rotule as células em 200 microlitros de PBS contendo 1% de BSA e os anticorpos apropriados no gelo. Em seguida, após 45 minutos, lave as amostras com um mililitro de PBS frio e ressuspenda novamente os pellets em 100 microlitros de tampão de fluxo de fax para análise de citometria de fluxo.

Este modelo é caracterizado por volumes de infarto altamente reprodutíveis 24 horas após a oclusão da artéria cerebral média, conforme estimado pelo método cavalieri. Em cortes corados nial, de acordo com estudos anteriores, a infiltração de neutrófilos está diretamente correlacionada com o tamanho do infarto. Além disso, o isolamento leucocitário e a caracterização por citometria de fluxo permitem o isolamento de células mieloides do córtex do hemisfério lesional do IPS de camundongos isquêmicos, que compreendem 10 a 30% do total de eventos encontrados na suspensão celular e apresentam um parâmetro de baixo espalhamento frontal associado a detritos celulares.

As células CD 11 B positivas têm um valor de dispersão frontal mais alto, sugerindo que os detritos celulares não são marcados com este marcador e, como indicado anteriormente, que podem ser excluídos de análises posteriores definindo o limite FSC em 200 neutrófilos caracterizados como LY seis células G positivas são a população de células infiltradas mais numerosa encontrada 24 horas após a oclusão da MCA no cérebro isquêmico de camundongos usando este modelo de isquemia cerebral e compreendem 70 a 80% das células CD 11 B positivas para CD 45 altas. O resto das células são principalmente uma subpopulação de CD 11 B, CD 45 positivo, LY alto seis G, negativamente seis C monócitos pró-inflamatórios altos, que são encontrados em números elevados nas áreas isquêmicas do cérebro de 24 a 48 horas após a oclusão da artéria cerebral média. Este modelo P-M-C-A-O pode ser realizado em 30 minutos se for realizado corretamente seguindo o procedimento de citometria de fluxo.

Outros métodos, como a classificação de um subconjunto de células específico, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais são os padrões de expressão, alterações metabólicas ou atividades acéticas das células mieloides neste sistema modelo. Depois de assistir a este vídeo, apenas para ter uma boa compreensão de como criar um modelo de isquemia e, o mais importante, como caracterizar o número e o fenótipo das células mieloides infiltrantes por duas abordagens diferentes em uma lesão cerebral de camundongo ou tpe após modelo de isquemia cere.