Geração de pluripotentes induzidas células-tronco de distrofia muscular pacientes: Reprogramação livre de integração eficiente de urina células derivadas

O objetivo geral do experimento a seguir é gerar eficientemente células-tronco pluripotentes induzidas ou IPSC de pacientes com distrofia muscular a partir de culturas de células derivadas de urina e um método de reprogramação livre de integração. Isso é conseguido coletando primeiro amostras de urina de pacientes com distrofia muscular. Como segunda etapa, as células da urina são isoladas e expandidas em culturas de células derivadas da urina.

Em seguida, as células derivadas da urina são transduzidas com o vírus Sendai contendo fatores Yamanaka e colônias pluripotentes típicas emergem após 12 dias. Em última análise, pela passagem 13, o estado livre de transgenes das células-tronco pluripotentes pode ser confirmado pela análise R-T-P-C-R. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a reprogramação de fibroblastos isolados da pele usando vetores lentivirais, é que, com esta técnica, as células somáticas podem ser obtidas de forma não invasiva dos pacientes e usadas para gerar eficientemente os IPCs usando um método de pegada zero de reprogramação viral.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da distrofia muscular, como a forma como essas condições são modeladas in vitro sem preocupações de segurança para aplicação em humanos. Demonstrando os procedimentos estarão Mohammad Zishan Al, um pós-doutorando Courtney Guesting, um técnico, e Melanie Ryder, estudante de pós-graduação, todos os três do meu laboratório Para coletar uma amostra de urina, comece aconselhando o paciente a beber líquidos 30 minutos antes da coleta para garantir que cerca de 30 a 40 mililitros de urina possam ser coletados. Quando o paciente estiver pronto, dê ao paciente um kit de coleta de urina contendo os seguintes itens, instruções escritas sobre como obter vasos sanitários antibacterianos úmidos estéreis ou limpos e um copo de coleta de amostras estéreis de 100 mililitros.

Quando a amostra tiver sido coletada, coloque imediatamente o copo de coleta no gelo e transfira a amostra para o laboratório em um refrigerador. Em seguida, use pipetas estéreis para transferir a amostra de urina para tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros e gire os tubos a 400 vezes G por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, em um BSL, dois gabinetes de segurança biológica aspiram todos, exceto o último, mililitro do sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet.

Em seguida, lave as células em sete mililitros de tampão de lavagem e gire as células novamente. Desta vez, aspirando todos, exceto o último, cerca de 0,2 a 0,5 mililitros do sobrenadante. Agora reutilize o pellet em dois a três mililitros de célula progenitora urinária ou meio UPC e transfira a suspensão para quatro a seis poços de uma placa de 24 poços não revestida após 72 horas, complemente a cultura com 0,5 mililitros de meio UPC fresco por poço.

Monitore a cultura por quatro a seis dias de incubação. Pequenas colônias de células de duas a quatro células arredondadas ou alongadas representando células epiteliais renais do tipo um ou tipo dois, respectivamente, devem começar a aparecer. Continue a trocar o meio a cada dois ou três dias.

Como as colônias passarão por uma fase de expansão rápida em torno de nove a 15 dias de cultivo, as células devem ser 80 a 90% confluentes neste ponto, dividir as células em dois a quatro poços de uma placa de 24 poços para expansão adicional. Marcando esta cultura como passagem celular um, as células da urina podem então ser caracterizadas para marcadores específicos da linhagem por meio de análise citométrica de fluxo, coloração imuno-histoquímica ou por meio de reação em cadeia da polimerase transcriptase reversa para garantir uma reprogramação de alta eficiência para dias antes da semente de transdução, 60.000 células por poço. De uma cultura de passagem um a cinco em dois poços de uma placa de seis poços no dia zero.

Prepare o vetor de reprogramação de Sendai adicionando cada um dos quatro fatores OSKM em um MLI apropriado para reprogramação a um mililitro de mídia UPC pré-aquecida, aspire a mídia de suspense e adicione lentamente a suspensão do vírus a um poço das células da urina pelos próximos seis dias. Substitua o sobrenadante diariamente por meio UPC fresco no MES tratado com semente de mitomicina no quinto dia em placas de cultura quadradas de 100 milímetros revestidas com gelatina no sexto dia. Dissocie as células da urina com tripsina, ressuspenda-as em meio UPC e coloque-as em cinco vezes 10 da quarta a duas vezes 10 das quintas células por placa alimentadora de metanfetamina.

No dia seguinte, substitua o meio UPC pelo estágio embrionário humano ou meio HES e monitore as células ao microscópio para observar as células transformadas por volta de 12 a 18 dias. Após a transdução, as células devem formar agregados clonais com uma morfologia característica de paralelepípedos e uma proporção núcleo/citoplasma mais alta. Para identificar os clones IPSC reprogramados, execute a coloração de células vivas para um anticorpo TRA 180 1.

Em seguida, use uma agulha de calibre 26 de meia polegada para hachura dos agregados clonais positivos TRA 180 1 em quatro a seis pequenos pedaços de tamanho igual por clone. Em seguida, use uma ponta de pipeta estéril para pegar e transferir 10 a 20 pedaços hachurados de vários clones para cada poço Uma placa revestida de matrigel de 24 poços com HESC. Médio, 24 a 48 horas após os clones reprogramados serem plaqueados na superfície do matrigel.

Substitua o meio por meio IPSC. Use uma ponta de pipeta para raspar manualmente quaisquer células diferenciadas ou células contaminantes alimentadoras de metanfetamina para ajudar na purificação dos clones IPSC distróficos totalmente reprogramados e pluripotentes. Depois que os clones atingirem cerca de 100 micrômetros de tamanho, dissocie as células com EDTA por três minutos e, em seguida, coloque pequenos agregados de células do IPSC distrófico reprogramado, suspenso em meio IPSC suplementado com inibidor de RO quinase em uma placa de 12 folhas revestidas com matrigel fresco.

Finalmente, confirme a pluripotência de cada clone por análise de expressão gênica e coloração imuno-histoquímica. Para marcadores pluripotentes, a maioria das células isoladas da urina humana é positiva para marcadores progenitores e de células-tronco, como CD 44, CD 73 e CD 1 46. As células também exibem marcadores mesenquimais, como alfa, músculo liso, actina e menton.

R-T-P-C-R das células isoladas fornece evidências de uma população mista de células nas culturas. Em que há fraca expressão de citoqueratina sete e UIN um A e três marcadores a de células epiteliais euro. As células da urina se transformam de células alongadas do tipo dois no dia zero em um padrão de paralelepípedos no quarto dia de reprogramação.

No dia 12, clones pluripotentes típicos são observados e são capazes de manter sua morfologia pluripotente em condições livres de alimentador. A coloração de células vivas para TRA 180 1 pode ser usada para identificar os clones reprogramados. Para confirmar a geração de clones pluripotentes livres de vetores e transgenes, o R-T-P-C-R pode ser realizado usando primers contra o genoma do vírus Sendai e cada um dos fatores exógenos do OSKM.

A expressão gênica exógena não é mais detectada pela passagem 13, mas a regulação positiva de fatores endógenos pode ser observada. A coloração imunofluorescente confirma a expressão de marcadores pluripotentes nas CPIs, mas não nas células urinárias. A expressão da proteína e do gene da distrofina pode então ser verificada por mais coloração imunofluorescente, western blotting e R-T-P-C-R, respectivamente, conforme demonstrado com essas imagens representativas de um controle de tipo selvagem e linhagens celulares distróficas.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser empregada para alcançar uma reprogramação livre de UCS. Dentro de algumas semanas Após este procedimento, podemos diferenciar os IPCs em cardiomiócitos ou miócitos esqueléticos, a fim de promover nossos mecanismos por trás da distrofia muscular.