Name: O isolamento de populações de células distintas do cerebelo em desenvolvimento por Microdissecção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda a isolar populações de células progenitoras do cerebelo em desenvolvimento de camundongos neonatos usando microdissecação e citometria de fluxo. Esta técnica permite obter células vivas para estudos de neurociência e biologia do desenvolvimento.

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Os autores gostariam de agradecer a James Oesterling para citometria de fluxo assistência. Esta pesquisa foi suportada por uma concessão do Instituto Nacional do Câncer (R01-CA178380, ZY) e uma bolsa de US National Institutes de Pós-Doutorado formação (5T32CA009035-37, Lwy).

A utilização de animais neste protocolo foi realizado de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê Cancer Center, Animal Care and Use a Fox Chase. 1. preparação de instrumentos, Solutions e Lamelas <ol><li> Limpe dois conjuntos de # 5 pinça fina, um conjunto de # 7 pinças curvas finas, uma grande tesoura cirúrgica, uma tesoura microdissecting, uma espátula e uma colher perfurada. Coloque os instrumentos em uma auto-selante bolsa de esterilização e autoclave. Mantenha instrumentos em bolsa até que esteja pronto para uso. </li><li> Prepara-se uma solução de agarose de baixo ponto de fusão de 3%. <ol><li> Adicionar 1,5 g de agarose em 50 ml de tampão fosfato salina estéril por Dulbecco (DPBS) em seguida, coloque no microondas e aqueça até que apareçam bolhas. Frasco do redemoinho e reaquecimento até que todos agarose foi dissolvida. Misturar a solução com uma barra de agitação, antes do aquecimento, se aglomerados aparecer. </li><li> Solução da loja em um banho de água a 37 ° C até ser necessário. </li><li> Para armaze longo prazoe, armazenar a solução de agarose para uso futuro, à temperatura ambiente ou a 4 ° C, durante meses. Reaquecimento no microondas para liquefazer. Para o aquecimento repetido da solução de agarose, pesar o frasco antes de aquecimento para manter o seu peso inicial, com água destilada estéril quente. </li></ol></li><li> Preparar as seguintes soluções para a dissociação de células à base de papaína como descrito previamente 2: <ol><li> A solução de papaína com papaína (100 U / ml), cisteína (0,2 mg / ml) e ADNase (250 U / ml) em fenol vermelho estéril contendo DPBS. </li><li> Uma solução ovomucóide com albumina de soro bovino (BSA, 8 mg / ml), inibidor de tripsina de soja (8 mg / ml)) e DNase (250 U / ml) em fenol estéril contendo vermelho-DPBS. Filtrar esterilizar ambas as soluções e ajustar o pH para retornar cor original de fenol contendo vermelho-DPBS. </li></ol></li><li> Preparar meios de cultura de células (NB / B27): complementar meio basal com piruvato de sódio 1 mM, 2 mM de L-glutamina, 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) e suplemento de B27. Filter esterilizar e proteger da luz. Equilibrar media a 37 ° C e 5% de CO 2 antes da sua utilização. </li><li> Preparar tampão de FACS: 5% de soro fetal bovino (FBS) em DPBS. Adicionar 2,5 ml de FBS a 47,5 ml de DPBS. </li><li> Prepare a poli-D-lisina (PDL) -Revestido lamelas. <ol><li> Autoclave novas lamelas de vidro. </li><li> Revestir as lamelas com PDL (100 ug / ml em água destilada estéril) e incubar durante 2 horas a 37 ° C ou à temperatura ambiente durante a noite. </li><li> Lavar lamelas com água destilada estéril. Lave uma vez com meio NB / B27. Vamos lamelas secar completamente no tecido de cultura capa antes de usar. </li></ol></li></ol> 2 Dissecção e Preparação de fatias de tecido <ol><li> No dia da dissecção, limpe a área de dissecção com etanol e 70% de cobertura com um pano absorvente. </li><li> Remover ferramentas de dissecção da bolsa de esterilização. Adicionar gelada, DPBS estéril / 1% P / S para uma pequena placa de Petri e colocar no gelo. </li><li> Decapitaria P4 Math1-GFP / nestin-PCP filhotes de rato com grandes tesouras cirúrgicas em seguida, mantenha a cabeça para baixo com uma pinça curva finas. Retire a pele e descascar delicadamente fora o crânio com # 5 pinça fina, em seguida retire o cérebro do crânio utilizando uma espátula e transfira-o para a placa de Petri contendo DPBS / 1% P / S. <ol><li> Usando # 5 fórceps finos, cuidadosamente separar o cerebelo a partir do resto do cérebro. Certifique-se de dissecar um filhote de cada vez mais rápido possível. </li><li> Recolha um mínimo de 8 cerebelo, a fim de obter NEPs suficientes para análises moleculares e funcionais. </li></ol></li><li> Encher um molde medindo a incorporação de 2 x 2 x 2 cm de altura com uma solução de agarose de baixo ponto de fusão de 3%. Certifique-se de que a temperatura de agarose é não mais do que 37 ° C. </li><li> Retire o excesso de líquido do cerebelo, esfregando suavemente sobre um tecido de laboratório. Coloque cerebelo em molde na posição vertical. Coloque o molde em gelo para permitir que solidifique rapidamente. Use ~ 4 cerebelo por bloco. </li><li> Obter licortes de tecido ving com uma lâmina vibratome vibrando. Apare contendo cerebelo bloco de agarose com uma lâmina de barbear. Cole o bloco de agarose para a placa com vibratome orientada na posição vertical, os cerebelos. </li><li> Encha a bandeja do vibratome com geladas DPBS estéril / 1% P / S e local de gelo embaixo. <ol><li> Cortar 600 uM secções através de todo o comprimento do cerebelo. Colete seções da bandeja de gelo utilizando uma colher perfurada. Seções coloque em um prato de Petri cheia de DPBS / 1% P / S no gelo. </li></ol></li></ol> 3. Microdissecção e dissociação celular <ol><li> Coloque a placa de Petri contendo fatias de tecido sob um microscópio de dissecação fluorescente. <ol><li> Cuidadosamente separar o EGL do resto da secção de cerebelar usando uma pinça fina dissecando entre o PCP + camada molecular e a GFP + EGL (referem-se a linha a tracejado na Figura 1). Ter cuidado para não incluir qualquer parte da camada molecular, o que irá resultar emcontaminação de expressando nestina Bergmann glia. </li><li> Conclua esta etapa, tão rapidamente quanto possível e manter o tecido em gelo para evitar a morte celular. </li><li> Retire a agarose em torno do tecido antes de prosseguir para a próxima etapa. </li></ol></li><li> Digerir o tecido EGL microdissecados utilizando um protocolo baseado em papaína como descrito previamente 2 para se obter uma suspensão de célula única. <ol><li> Re-suspender as células em tampão FACS para a coleta de células CFP-positivos através de FACS. </li></ol></li></ol> 4 células de triagem e Galvanização <ol><li> Ordenação de células de fluorescência utilizando um PCP e de alta velocidade de fluxo estéril citómetro contendo um filtro apropriado PCP e recolher células em tampão de SCAF em gelo. Obter aproximadamente 100.000 NEPs de cada cerebelo P4. </li><li> Células centrifugar a 300 xg por 5 min. Utilizar imediatamente células para análise molecular ou cultura para mais experimentação. </li><li> Para células de cultura, re-suspender as células pré-aquecido NB / B27 mEDIA e placa em lamelas PDL-revestidos como descrito anteriormente 2. </li></ol>

<ol><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neuronal+precursor+proliferation+in+the+cerebellum+by+Sonic+Hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog.</a> Neuron. 22, 103-114 (1999).</li>
<li>Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li>
<li>Riobo, N. A., Manning, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+signal+transduction+employed+by+vertebrate+Hedgehogs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs.</a> Biochem J. 403, 369-379 (2007).</li>
<li>Dahmane, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sonic+Hedgehog-Gli+pathway+regulates+dorsal+brain+growth+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Sonic Hedgehog-Gli pathway regulates dorsal brain growth and tumorigenesis.</a> Development. 128, 5201-5212 (2001).</li>
<li>Marino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medulloblastoma%3A+developmental+mechanisms+out+of+control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Medulloblastoma: developmental mechanisms out of control.</a> Trends Mol Med. 11, 17-22 (2005).</li>
<li>Yang, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medulloblastoma+can+be+initiated+by+deletion+of+Patched+in+lineage-restricted+progenitors+or+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Medulloblastoma can be initiated by deletion of Patched in lineage-restricted progenitors or stem cells.</a> Cancer Cell. 14, 135-145 (2008).</li>
<li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+population+of+Nestin-expressing+progenitors+in+the+cerebellum+exhibits+increased+tumorigenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A population of Nestin-expressing progenitors in the cerebellum exhibits increased tumorigenicity.</a> Nat Neurosci. 16, 1737-1744 (2013).</li>
<li>Ben-Arie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+essential+for+genesis+of+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons.</a> Nature. 390, 169-172 (1997).</li>
<li>Sutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+stem+cells+act+as+medulloblastoma-initiating+cells+in+a+mouse+model+and+a+neural+stem+cell+signature+characterizes+a+subset+of+human+medulloblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cerebellar stem cells act as medulloblastoma-initiating cells in a mouse model and a neural stem cell signature characterizes a subset of human medulloblastomas.</a> Oncogene. 29, 1845-1856 (2010).</li>
<li>Sotelo, C., Alvarado-Mallart, R. M., Frain, M., Vernet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+plasticity+of+adult+Bergmann+fibers+is+associated+with+radial+migration+of+grafted+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular plasticity of adult Bergmann fibers is associated with radial migration of grafted Purkinje cells.</a> J Neurosci. 14, 124-133 (1994).</li>
<li>Lumpkin, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1-driven+GFP+expression+in+the+developing+nervous+system+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Math1-driven GFP expression in the developing nervous system of transgenic mice.</a> Gene Expr Patterns. 3, 389-395 (2003).</li>
<li>Encinas, J. M., Vaahtokari, A., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoxetine+targets+early+progenitor+cells+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8233-8238 (2006).</li>
<li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+astroglial+morphology+and+proliferation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro.</a> J Cell Biol. 100, 384-396 (1985).</li>
<li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J Vis Exp. (23), (2009).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nat Protoc. 1, 586-603 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O método descrito aqui é microdissecção o primeiro procedimento capaz de isolar uma população pura de células vivas para utilização em análises moleculares e funcionais. Como demonstrado por Li et al. 9, NEPs obtidos por este método podem ser cultivadas e retomado em diferentes experiências e por causa do seu elevado grau de pureza, pode também ser utilizado para a análise de microarray. É muito importante ter tempo para se tornar proficientes com esta técnica ...

O cerebelo é composta de várias camadas de células, cada uma contendo tipos celulares distintas. Durante o desenvolvimento, a EGL contém proliferando grânulos dos neurônios precursores (PNB), enquanto a camada molecular e camada de Purkinje conter Bergmann glia e neurônios de Purkinje, respectivamente. Profundamente dentro do cerebelo encontra-se a substância branca, que contém células-tronco neurais (NCCC) e oligodendrócitos 1. Sonic hedgehog (Shh) desempenha um papel fundamental na regulação do desenvolvimento do cerebelo e, em particular, que promove a proliferação de PNB através da ligação ao seu receptor de Patched (Ptc), um regulador negativo da sinalização Shh 2-4. A ativação anormal de sinalização Shh gera meduloblastoma (MB), o tumor cerebral maligno mais comum em crianças 5,6. PTC MB mutantes modelos transgênicos são ferramentas poderosas para o estudo da MB e desenvolver tumores que lembram MB humano 7,8. Usando estesratos, foi descoberto que PNB são a célula de origem para hedgehog de ​​tipo MB 7. Além disso, em adição ao PNB, que recentemente identificada uma população única de células progenitoras neuronais dentro da EGL do cerebelo em desenvolvimento, que também pode dar origem a MB. Estas células expressam níveis elevados da proteína de tipo VI filamento intermediário, nestina, e são denominados NEPs 9. NEPs estão localizados na parte profunda da EGL existir transitoriamente e apenas durante o desenvolvimento do cerebelo neonatal. Eles estão comprometidos com a linhagem de células granulares como PNB, mas são distintos como eles estão quietos e não expressam Math1, um marcador bem estabelecido para PNB convencionais 10. Além disso, NEPs dar origem a MB de forma mais eficiente do que o PNB após a ativação da via de sinalização Shh 9, que lhes uma nova origem para MB tumorigenesis faz. Nós NEPs da EGL cerebelar previamente isolada no dia pós-natal 4 (P4) pela técnica de microdissecçãodescrito aqui 9. Microdissecção visualização microscópica directa através do tecido permite a dissecção específica da EGL cerebelar. Isto é necessário porque Nestin também é expressa por NSC na substância branca do cerebelo e por Bergmann glia na camada molecular 1,7,11,12 e era crucial que estas células não ser incluídos, como eles iriam confundir análise. As células isoladas a partir de tecido microdissecados pode ser imediatamente utilizado para a análise molecular, ou podem ser cultivadas para outras aplicações. Para ajudar na especificamente microdissecting a EGL e para purificar ainda mais NEPs, ratos Math1-GFP (proteína fluorescente verde) foram cruzados com camundongos Nestin-CFP (proteína fluorescente ciano). O factor de transcrição de Math1 é especificamente expresso por PNB e expressão da GFP é claramente visível na EGL 9,13. Ratinhos nestina-PCP expressar uma forma nuclear de PCP e podem ser facilmente visualizadas na camada molecular 9,14. Juntos, GFP e expressão PCP criar limites para microdissecção do EGL (ver Figura 1). NEPs PCP-positivos foram então isolados por FACS, após dissociação enzimática das GECV dissecados. Actualmente, o método mais bem utilizados para isolar células da EGL é centrifugação em gradiente de Percoll de tecido cerebelar toda 15,16. Este método, no entanto, não é capaz de excluir completamente populações celulares nestina + a partir da camada molecular e da matéria branca e, portanto, não pode ser usado para o estudo de NEPs. Microdissecção captura a laser, que utiliza a transferência de energia laser para remover as células de interesse, é outro método usado para isolar células específicas dentro de um tecido heterogéneo 17,18 mas apenas células capturadas podem ser usadas para a recuperação de ADN, ARN e proteína e não está capazes de ser cultivadas. Este protocolo fornece uma maneira de isolar especificamente um puro população vivo, de NEPs da EGL.Esta técnica também pode ser aplicado para diferentes tipos de tecidos que tenham ou arquitectura anatómica reconhecível ou marcados com fluorescência células / regiões. Por conseguinte, a principal vantagem de incorporar esta técnica microdissecção novo em protocolos de isolamento de células é que as células podem ser isoladas a partir de regiões específicas do tecido para eliminar os contaminantes de tecidos vizinhos e as células podem ser recolhidas para análise imediatamente ou cultivadas durante outras aplicações.

<table><tbody><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Millipore</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Agarose ultrapuro de baixa temperatura de fusão</td><td>Invitrogen</td><td>16520-050</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr></tbody></table>

o isolamento de populações de células distintas do cerebelo em desenvolvimento por microdissecção

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissecção é uma nova técnica que pode isolar regiões específicas de um tecido e eliminar a contaminação a partir de fontes celulares em áreas adjacentes. Este método foi utilizado pela primeira vez no estudo de nestina expressa progenitoras (NEPs), uma população de células recentemente identificados na camada germinal externa cerebelar (EGL). Usando microdissecção em combinação com separação de células activada por fluorescência (FACS), uma população pura de NEPs foi recolhido separadamente, a partir de precursores neuronais dos grânulos convencionais na EGL e de outros contaminantes células que expressam nestina-no cerebelo. Sem microdissecção, análises funcionais de NEPs não teria sido possível com os atuais métodos disponíveis, tais como a centrifugação em gradiente de Percoll e captura a laser microdissecção. Esta técnica também pode ser aplicado para utilização com vários tecidos que contêm tanto regiões conhecidas ou células marcadas fluorescentemente. Mais importante ainda, uma grande vantagem do presente microdissection técnica é que as células isoladas são de vida e pode ser cultivado para experimentação posterior, o que não é actualmente possível com os outros métodos descritos.

Como mostrado na Figura 1A, as fatias de cerebelo foram preparadas a partir de P4 Math1-GFP / mice nestina-PCP, em que a EGL cerebelar foram dominados por PNB-expressando GFP e a camada molecular foi enriquecida por células gliais PCP-positivos. Para isolar NEPs que estão localizadas na parte profunda da EGL, fatias foram microdissecadas entre o EGL e a camada molecular (ao longo da linha tracejada, Figura 1A). GECV dissecado (Figura 1B) foram, em segu...

Progenitores que expressam nestina são uma população recentemente identificada de progenitores neuronais no cerebelo em desenvolvimento. Usando a técnica de microdissecção aqui apresentados em combinação com separação de células activada por fluorescência, esta população de células pode ser purificado sem contaminação de outras regiões do cerebelo e podem ser cultivadas para estudos posteriores.

O isolamento de populações de células distintas do cerebelo em desenvolvimento por Microdissecção

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar populações de células específicas do cerebelo em desenvolvimento. Isso é feito pela primeira colheita de cerebelo de camundongos neonatais portadores de proteínas fluorescentes. O segundo passo do procedimento é obter seções de tecido vivo usando um vibrato.O terceiro passo é microdissecar a camada germinativa externa do cerebelo sob um microscópio de dissecação fluorescente. As etapas finais são dissociar o tecido em uma única suspensão celular e coletar células por classificação de células ativadas por fluorescência. Em última análise, os resultados podem mostrar que populações de células específicas podem ser isoladas do cerebelo.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como captura a laser, microdissecação, é que as células estão vivas e podem ser cultivadas. Para mais experimentação Para este procedimento, esterilize as ferramentas cirúrgicas usando uma autoclave. Obtenha aros frescos ou reaquecidos a 3% de baixo ponto de fusão prontos para uso em banho-maria a 37 graus Celsius.Prepare as soluções necessárias para a dissociação celular à base de mamão. Prepare meios de cultura NBB 27 frescos. Em seguida, filtr

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Neurociência

Aqui apresentamos um método para isolar e cultivar células granulares do cerebelo e neurônio progenitor neurônios granulares do cerebelo de rato pós-natal.

Isolamento e Cultura de Pós-Natal do rato Cerebelar Granule Células Progenitoras Neuron e Neurônios

Este vídeo descreve um método para gerar fatias de tecido a partir do cerebelo do camundongo. As fatias cerebelares podem ser usadas para cultura organotípica que fornece informações sobre os mecanismos de neurodesenvolvimento, incluindo a dinâmica da mielinização.

Dissecção do cerebelo e preparação de fatias: um método para gerar fatias de tecido a partir de cerebelo de camundongo

Este vídeo demonstra a técnica para isolar e cultivar neurônios granulares cerebelares primários de camundongos. As células são tratadas com um antimetabólito para eliminar as células gliais em proliferação e produzir uma cultura pura de neurônios granulares cerebelares.

Isolamento e cultura de neurônios granulares cerebelares primários de camundongos

Este vídeo demonstra um método para isolar células-tronco do cerebelo pós-natal de camundongos e diferenciá-las em células neurais. As células-tronco da suspensão de células isoladas são purificadas usando esferas magnéticas revestidas com anticorpos e são cultivadas para formar neuroesferas. As neuroesferas são então mantidas em um meio de diferenciação para gerar células neurais.

Isolamento de células-tronco do cerebelo pós-natal de camundongo e diferenciação em células neurais

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Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

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Realizar experimentos in vitro para refletir as condições in vivo da forma mais adequada possível não é uma tarefa fácil. O uso de culturas celulares primárias é um passo importante para a compreensão da biologia celular em um organismo inteiro. O protocolo fornecido descreve como crescer com sucesso e cultura embrionária mouse neurônios cerebelares.

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Aqui, apresentamos um protocolo de eletroporação in vitro reprodutível para manipulação genética de precursores primários de células de grânulo cerebelar (GCPs) que é econômico, eficiente e viável. Além disso, este protocolo também demonstra um método simples para o estudo molecular de vias primárias de sinalização de Ouriço dependentes de cílios em células GCP primárias.

Método de eletroporação eficiente e econômico para estudar vias de sinalização dependentes de cítio primário no precursor da célula de grânulo

Aprenda a isolar populações de células progenitoras do cerebelo em desenvolvimento de camundongos neonatos usando microdissecação e citometria de fluxo. Esta técnica permite obter células vivas para estudos de neurociência e biologia do desenvolvimento.

O isolamento de populações de células distintas do cerebelo em desenvolvimento por Microdissecção

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