O isolamento de populações de células distintas do cerebelo em desenvolvimento por Microdissecção
21 de setembro de 2014
Progenitores que expressam nestina são uma população recentemente identificada de progenitores neuronais no cerebelo em desenvolvimento. Usando a técnica de microdissecção aqui apresentados em combinação com separação de células activada por fluorescência, esta população de células pode ser purificado sem contaminação de outras regiões do cerebelo e podem ser cultivadas para estudos posteriores.
O objetivo geral deste procedimento é isolar populações de células específicas do cerebelo em desenvolvimento. Isso é feito pela primeira colheita de cerebelo de camundongos neonatais portadores de proteínas fluorescentes. O segundo passo do procedimento é obter seções de tecido vivo usando um vibrato.
O terceiro passo é microdissecar a camada germinativa externa do cerebelo sob um microscópio de dissecação fluorescente. As etapas finais são dissociar o tecido em uma única suspensão celular e coletar células por classificação de células ativadas por fluorescência. Em última análise, os resultados podem mostrar que populações de células específicas podem ser isoladas do cerebelo.
A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como captura a laser, microdissecação, é que as células estão vivas e podem ser cultivadas. Para mais experimentação Para este procedimento, esterilize as ferramentas cirúrgicas usando uma autoclave. Obtenha aros frescos ou reaquecidos a 3% de baixo ponto de fusão prontos para uso em banho-maria a 37 graus Celsius.
Prepare as soluções necessárias para a dissociação celular à base de mamão. Prepare meios de cultura NBB 27 frescos. Em seguida, filtre, esterilize e armazene em uma incubadora.
Prepare o buffer de fax e prepare as lamínulas de polietileno. Primeiras lamínulas de autoclave com 100 microgramas de poli de licina por mililitro de água estéril. Em seguida, incube as lamínulas por duas horas a 37 graus Celsius ou durante a noite em temperatura ambiente.
Posteriormente, lave as lamínulas com água destilada seguida de mídia NBB 27 antes de usar as lamínulas. Seque-os completamente. Isso levará pelo menos uma hora antes de começar.
Prepare a área de dissecação primeiro. Limpe-o com 70% de etanol. Em seguida, cubra-o com uma almofada absorvente.
Em segundo lugar, remova as ferramentas da bolsa de esterilização e posicione-as para uso. Terceiro, carregue um prato com DPBS estéril gelado com 1% de tira de caneta e coloque-o no gelo. Disseque o cérebro de um filhote de P quatro que expressa marcadores fluorescentes.
Em seguida, transfira-o para o prato preparado de DPBS. Use uma pinça para separar cuidadosamente o cerebelo do resto do cérebro. Esses cerebelos expressam os marcadores math one, GFP, e nidificam em CFP em que o EGL expressa GFP e a camada molecular é positiva para CFP.
Em seguida, preencha um molde de incorporação em cubos de dois centímetros com a solução agrícola. Certifique-se de que não esteja mais quente do que 37 graus Celsius. Pegue um cerebelo com uma colher perfurada e seque-o com um leve toque de tecido.
Em seguida, usando uma pinça, coloque-a no molde. Use uma agulha para colocar o cerebelo em orientações verticais. Uma vez que cerca de quatro são carregados no molde.
Coloque o molde no gelo para que solidifique rapidamente Usando uma lâmina de barbear. Apare o bloco para reduzir o tempo de seccionamento. Em seguida, cole o bloco na placa orientada para que o cerebelo fique na vertical.
Carregue a bandeja de enchimento com DPBS gelada com alça de 1% e coloque gelo sob a bandeja para que fique fria. Agora divida os blocos com um vibrador. Corte e colete seções de 600 mícrons.
Retire-os da bandeja de gelo usando uma colher perfurada e transfira-os para um prato cheio de A-D-P-B-S com gelo. Sob microscópio de dissecação fluorescente. Examine as fatias o mais rápido possível.
Separe cuidadosamente o EGL do resto da seção cerebelar. Use uma pinça fina para dissecar entre a camada molecular positiva para CFP e o EGL positivo para GFP. Seja muito conservador durante a microdissecção para evitar a contaminação de regiões adjacentes.
Transfira o tecido EGL positivo para GFP para um novo prato cheio de DPBS no gelo. Evite incluir qualquer tecido da camada molecular, pois isso contaminará a cultura com nidificação expressando a glia de Bergman. Em seguida, remova os agros ao redor do tecido EGL isolado.
O EGL agora pode ser dissociado usando um protocolo baseado em paan para uma suspensão de célula única. Quando isso for concluído, resus suspende as células no buffer de fax. Prossiga com a coleta das células CFP usando fax.
Classifique-os usando um citômetro de alta velocidade e um filtro CFP e coloque-os em um buffer de fax gelado. Cerca de 100.000 NPS devem ser obtidos por P quatro cerebelo. Em seguida, centrifugue as células agrupadas a 300 Gs durante cinco minutos.
Faça uso imediato das células para cultivá-las resus. Suspenda-os em meios NBB 27 pré-aquecidos. Em seguida, carregue-os nas lamínulas revestidas de poli D lisina.
Fatias de bella celular foram preparadas a partir de P quatro math um ninho GFP em camundongos CFP. O EGL cerebelar continha principalmente GFP expressando GMPs e poderia ser facilmente separado da camada molecular enriquecida em CFP expressando glia A análise dos fatos mostrou que mais de 85% das células do EGL eram GNPs convencionais. Os NEPs foram isolados das partes profundas do EGL por microdissecação, seguida de fatos.
Essas células representaram cerca de 5% das células no EGL quatro dias de cultivo. Os fatos isolados NPS deram origem a neurônios que expressam beta tubulina. Isso é característico de células progenitoras neuronais restritas à linhagem.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar rapidamente e manter o tecido no gelo o máximo possível.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método para isolar progenitores expressando nestina do cerebelo em desenvolvimento de camundangos neonatais. A técnica combina microdissecção e triagem celular ativada por fluorescência para purificar esses progenitores para estudos adicionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia do Desenvolvimento
Fundo
- Progenitores expressando nestina são uma população recentemente identificada no cerebelo.
- Entender esses progenitores pode fornecer insights sobre o desenvolvimento neuronal.
- Métodos existentes para isolamento celular frequentemente resultam em contaminação.
- Este estudo visa melhorar a pureza das populações celulares isoladas.
Propósito do Estudo
- Isolar populações específicas de progenitores neuronais do cerebelo.
- Permitir experimentação e análise adicionais dessas células.
- Demonstrar uma técnica que mantém a viabilidade celular para cultura.
Métodos Usados
- Colheita de cerebélo de camundangos neonatais com marcadores fluorescentes.
- Microdissecção da camada germinativa externa sob um microscópio fluorescente.
- Dissociation do tecido em uma suspensão de células únicas.
- Triagem celular ativada por fluorescência para coletar populações celulares específicas.
Principais Resultados
- Populações celulares específicas foram isoladas com sucesso do cerebelo.
- Mais de 85% das células isoladas foram confirmadas como GNPs convencionais.
- NEPs foram isoladas e representaram cerca de 5% das células EGL.
- Progenitores isolados deram origem a neurônios expressando beta tubulina.
Conclusões
- O método permite o isolamento de progenitores neuronais vivos.
- Esta técnica pode melhorar o estudo do desenvolvimento cerebelar.
- Manter a viabilidade do tecido é crucial para o sucesso da cultura celular.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Isolating specific cell populations from heterogeneous tissues remains a critical challenge in early-stage target validation and assay development. This microdissection-FACS workflow enables the recovery of live, contamination-free progenitors, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in neuronal lineage studies. The ability to culture isolated cells bridges discovery biology with translational biomarker exploration in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Nestin-expressing progenitors as a distinct therapeutic hypothesis in cerebellar development.
- Operational Value: Provides a purified cell population free from contaminating granule neuron precursors and Bergman glia for functional target assessment.
- Predictive Value: Supports lineage-restricted progenitor validation through beta-tubulin+ neuronal differentiation readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a live, single-cell suspension suitable for downstream fluorescent-activated sorting and phenotypic screening.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation through vibratome sectioning and microdissection under fluorescence guidance for reproducible EGL isolation.
- Assay Readiness: Yields approximately 100,000 viable progenitors per P4 cerebellum, enabling scalable compound testing in culture.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Isolated Nestin-expressing progenitors maintain viability for at least four days in culture, supporting preclinical phenotypic analysis.
- Biomarker Alignment: Beta-tubulin expression serves as a measurable readout for neuronal differentiation, aligning with translational biomarker strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Pure progenitor isolation reduces mechanistic ambiguity in de-risking neuronal differentiation pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven isolation of rare cell populations prior to functional screening and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of progenitor identity and spatial localization within the external germinal layer.
- Screening: Produces a standardized, live cell suspension compatible with FACS-based sorting and compound exposure assays.
- Analytics: Enables quantitative measurement of progenitor frequency (~5% of EGL) and differentiation outcomes via beta-tubulin expression.
- Translational Research: Connects isolated progenitors to preclinical validation through sustained culture and lineage-specific marker expression.
- Enterprise Reuse: The microdissection-FACS workflow is adaptable to other fluorescently labeled tissues, supporting platform-level application across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating live Nestin-expressing progenitors free from adjacent cellular contamination.
- Operational Value: Standardizes tissue viability preservation through ice-cold handling and rapid processing, enabling consistent culture initiation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence in neuronal progenitor studies by providing purified, functional cell inputs.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of cerebellar development targets through reliable, contamination-free cellular models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescent tissue dissection and microdissection under stereomicroscopy to maintain spatial precision.
- Dependent on cryostat-compatible embedding media (low-melting agarose) and vibratome sectioning at 600-micron thickness.
- Necessitates standardized FACS setup with CFP and GFP filters for parallel isolation of molecular layer and EGL populations.
- Requires poly-D-lysine coating and NBB 27 media preparation for adherent progenitor culture and differentiation assays.
- Practical limitation: Tissue must be processed rapidly on ice to prevent viability loss, restricting batch size without coordinated workflow.
