Name: Imunoterapia sublingual como uma alternativa para induzir protecção contra Infecções Respiratórias Agudas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 56 s
Description: Aprenda a usar imunoterapia sublingual para potencializar a resposta imune inata nos pulmões e proteger contra pneumonia pneumocócica letal em camundongos. Este método não invasivo oferece uma alternativa segura à administração intranasal.

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Agradecemos ao Dr. Jean-Claude Sirard, do Centro de Infecção e Imunidade de Lille, Instituto Pasteur de Lille-França, por gentilmente fornecer a flagelina purificada e à Dra. Teresa Camou, Diretora do Laboratório Nacional de Referência, Ministério da Saúde do Uruguai, por gentilmente fornecer a cepa pneumocócica. 
Os autores agradecem ao Sr. Diego Acosta e ao Sr. Ignacio Turel da BichoFeo Producciones-Uruguay por seu compromisso e trabalho árduo durante toda a produção e edição do vídeo. 
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas PR_FCE_2009_1_2783 e BE_POS_2010_1_2544 da Agência Nacional de Pesquisa e Inovação, ANII do Uruguai, do Programa de Desenvolvimento das Ciências Básicas, PEDECIBA do Uruguai e Comissão Setorial de Pesquisa Científica, CSIC-Universidad de la República, Uruguai.

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Os autores não têm nada a divulgar.

A administração sublingual de agentes terapêuticos tem sido provado como um meio útil para modular a resposta imunitária no tracto respiratório. A principal vantagem de ITSL para o tratamento de doenças respiratórias é de que não envolve a entrega directa de compostos para os pulmões ou nariz, sendo mais seguro do que os tratamentos baseados em administração intranasal 31. Imunoterapia sublingual pode ser utilizado para modular a resposta imunitária de diferentes maneiras, quer para a indução de respostas de regulação que pode melhorar os sintomas da inflamação alérgica e asma 32 ou para induzir a activação transiente de mecanismos da imunidade inata para o tratamento de infecções pulmonares agudas, como mostrado aqui. O modelo de rato apresentadas nesta vídeo é um método conveniente para o rastreio de compostos, como agentes terapêuticos para a ITSL. Este modelo animal oferece um meio útil para determinar o impactode corte na resposta imune dos pulmões, bem como noutros órgãos (por exemplo,. nódulos linfáticos drenantes ou mucosas distais) que não podem ser imitados pela utilização de modelos in vitro. Apesar de existirem vários trabalhos que descrevem os resultados obtidos com a imunoterapia sublingual, métodos de aplicação dos procedimentos de administração sublingual não foram disponibilizados ainda. Além disso, o modelo pode ser utilizado para a avaliação de vacinas sublinguais destinadas a conferir protecção sistémica, bem como local no trato respiratório. Como mostrado no vídeo acompanhante, administração sublingual de compostos é um processo simples que pode ser facilmente realizada sem a necessidade de formação extensiva. Tipicamente, uma pessoa competente na manipulação dos animais requer 1 hora para efectuar a ITSL num grupo de 10 ratinhos usando anestésicos injectáveis, tal como descrito no presente protocolo. Se desafio pneumocócica é realizada, bem como, 90 minutos adicionais serão necessários para preparara suspensão bacteriana e executar intranasal desafio dos animais. Os protocolos FACS aqui apresentados permitem a caracterização conveniente de impacto da SLIT no site local de administração, os linfonodos de drenagem, bem como seus efeitos sobre a dinâmica das células dos pulmões. A análise separada do parênquima pulmonar e conteúdo broncoalveolar é importante para discriminar residente imune as vias aéreas e se infiltrar tipos de células a partir de aqueles que permanecem dentro do tecido. A análise do conteúdo BAL permite o estudo da rotatividade dos macrófagos alveolares bem como a dinâmica do recrutamento de células para os espaços alveolares induzidas por diferentes tratamentos, por exemplo,. PMN, eosinófilos, monócitos. BAL também pode ser usado para avaliar a presença de citocinas e quimiocinas secretadas por Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ou de detecção de anticorpos IgA segregados induzidos após a vacinação sublingual. Estudo de tecido dos pulmõesvai permitir a caracterização de outros tipos de células, as células dendríticas, classicamente, células T e células B. Preparação de amostras de BAL e nódulos linfáticos para análise FACS é simples. Após a coleta da amostra, normalmente 60 minutos são necessários para completar o protocolo de coloração por 10-20 amostras. Em contraste, o isolamento de células a partir de tecido dos pulmões ou sublingual estarão requerem mais tempo que é necessária a digestão da matriz extracelular. Absorção do agente terapêutico entregues por via sublingual pode ser abordada por rastreamento de moléculas fluorescente ou marcadas radioactivamente usando em sistemas de imagem vivo. Imunoterapia sublingual é um método atraente para induzir eficazmente respostas imunes no tracto respiratório, bem como sistemicamente que pode ser usado para tratar ou prevenir doenças respiratórias. A elucidação dos mecanismos que determinam a activação vs tolerância da resposta imunitária no tracto respiratório após a ITSL ié essencial para permitir que o desenho racional de novas estratégias terapêuticas que podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com tratamentos disponíveis contra diferentes condições respiratórias.

O objetivo geral deste trabalho é ilustrar os benefícios da imunoterapia sublingual para o tratamento de infeções respiratórias agudas (IRA) e apresentar as vantagens desta via de administração em comparação com outras vias de administração, nomeadamente intranasal.
ARI causam milhões de mortes todos os anos, especialmente em crianças menores de cinco anos. O Streptococcus pneumoniae permanece como um dos principais agentes etiológicos da pneumonia bacteriana em lactentes eidosos1,2. Até o momento, o principal tratamento disponível depende do uso de antibióticos, mas cepas resistentes estão surgindo continuamente3,4.
SLIT induz respostas amplas em nível sistêmico e também mucoso, particularmente no trato respiratório5. Tem eficácia comprovada contra a infecção por influenza, promovendo proteção a longo prazo com produção de respostas humorais e celulares6,7. Além disso, foi demonstrado que o tratamento profilático com lisados bacterianos administrados por via sublingual reduziu as exacerbações da bronquite obstrutiva crônica em idosos8 e preveniu infecções respiratórias recorrentes em crianças9. A SLIT tem sido amplamente utilizada para o tratamento de alergias e asma. Estudos clínicos não apenas demonstraram sua eficácia para modular a resposta imune no trato respiratório, mas também sua segurança10. Apesar do crescente interesse de empresas farmacêuticas e pesquisadores em SLIT, os mecanismos envolvidos na indução de respostas imunes da mucosa após a entrega sublingual de compostos permanecem obscuros. Recentemente, a atenção tem se concentrado nos mecanismos que promovem a tolerância associada à dessensibilização a alérgenos. Tem sido proposto que células residentes e recrutadas na mucosa sublingual, como células dendríticas e macrófagos, podem promover tolerância após SLIT11-13. As células dendríticas da mucosa oral podem promover células T auxiliares produtoras de IFN-gama e IL-1011, bem como recircular para a mucosa genital distal e promover células T CD8+ 14. No entanto, pouco se sabe sobre o impacto da ITSL nas células inatas ou sua capacidade de melhorar a depuração do patógeno durante infecções respiratórias agudas.
O controle natural da infecção pneumocócica nos pulmões depende muito da ativação eficiente e rápida das defesas inatas locais. Mostramos anteriormente que o aumento da imunidade inata dos pulmões por uma única dose intranasal de flagelina (FliC), um agonista TLR5 e NLRC4, protege 75-100% dos camundongos desafiados com uma dose letal de um isolado clínico de Streptococcus pneumoniae sorotipo 1. Essa proteção mostrou-se dependente do recrutamento local de células GR1+ (provavelmente neutrófilos polimorfonucleares, PMNs) e não dependente de anticorpos, células B ou T15. 
A flagelina é o componente estrutural do flagelo bacteriano. Em sua forma monomérica, é reconhecido por dois Receptores de Reconhecimento de Patógenos (PRRs), TLR5 que detecta FliC16 extracelular e inflamassoma NLRC4/NAIP5 que detecta flagelina intracelular17,18. Quando o FliC é detectado pelos PRRs, uma importante resposta inflamatória é desencadeada. Nós e outros demonstramos que a instilação de FliC purificado do sorovar Typhimurium de Salmonella enterica nos pulmões impulsiona a produção rápida de quimiocinas e citocinas, especialmente quando reconhecidas pelo epitélio dos pulmões que, por sua vez, orquestram o recrutamento de células imunes para as vias aéreas, principalmente PMNs15,19-21. Embora transitória, a infiltração substancial de neutrófilos que ocorre nas vias aéreas após a administração nasal de FliC pode ser uma preocupação se avançar para terapias clínicas para uso humano. A inflamação excessiva pode ser prejudicial para a função dos pulmões. Além disso, foi demonstrado que a administração intranasal de moléculas imunoestimuladoras pode causar paralisia facial e/ou toxicidade cerebral22-24. 
A imunoterapia sublingual oferece uma alternativa mais segura para modular a resposta imune no trato respiratório em comparação com a via intranasal. É não invasivo, indolor, simples e tem boa adesão do paciente25. Além disso, como mencionado anteriormente, pode induzir respostas protetoras na mucosa respiratória sem os riscos associados à administração direta intranasal ou intrapulmonar de formulações. A via sublingual pode ser usada alternativamente para fornecer moléculas que têm grandes efeitos no sistema imunológico do pulmão, mas que comprovadamente são tóxicas ou provocam grande inflamação quando administradas por via intranasal. Além dessas vantagens, as formulações para imunoterapia sublingual têm menor custo de fabricação, uma vez que produtos não estéreis podem ser entregues por essa via e o choque endotóxico não é uma preocupação para o SLIT. Por outro lado, vale ressaltar que doses mais altas dos compostos imunoestimulantes em comparação com as utilizadas por via intranasal ou parenteral são necessárias para induzir uma resposta imune nos pulmões; também são necessárias soluções altamente concentradas ao usar o modelo de camundongo de SLIT, uma vez que o local anatômico onde as formulações são depositadas é pequeno. 
Com base em nossos dados publicados anteriormente, desenvolvemos um modelo de proteção usando imunoterapia sublingual com flagelina como imunoestimulante modelo. Demonstramos que uma única dose de flagelina induziu 60% de sobrevida contra pneumonia pneumocócica invasiva causada pela cepa do sorotipo 1, enquanto todos os camundongos do grupo controle morreram de infecção em 5 dias. A análise por citometria de fluxo mostrou que um maior número de PMN é recrutado para as vias aéreas de animais protegidos após o tratamento sublingual com flagelina, sugerindo que essas células podem estar envolvidas no mecanismo de proteção induzido pela imunoterapia sublingual. 
Este vídeo mostra em detalhes como realizar a imunoterapia sublingual e também como recuperar o tecido relevante da mucosa sublingual, drenando os gânglios linfáticos, bem como os pulmões e as vias aéreas para realizar análises adicionais. Além disso, ilustra a técnica geral de preparação celular para análise FACS e mostra brevemente como preparar suspensões de Streptococcus pneumoniae e como realizar infecções intranasais em camundongos para configurar o modelo de infecção aguda.

<table><tbody><tr><td>Solução de cetamina (50 mg/ml)</td><td>Pharma Service, Uruguai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução de xilacina (2%)</td><td>Portinco S.A., Uruguai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa estéril de 1 ml</td><td>Modern, Uruguai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estéril agulha de 27 G</td><td>Modern, Uruguai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>General Electric Health Care</td><td>E15885</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>ATCC</td><td>302020</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Penicilina/Estreptomicina</td><td>SIGMA</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>PBS Estéril sem Ca2+/Mg2+</td><td>PAA</td><td>H21002</td><td></td></tr><tr><td>Tipo-I Collagenase</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I (DNAse-I)</td><td>SIGMA</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 rato conjugado anti camundongo IgG2b anti CD11b</td><td>BD</td><td>550993</td><td>Clone M1/70</td></tr><tr><td>APC hamster conjugado anti camundongo IgG1 anti CD11c</td><td>BD</td><td>550261</td><td>Clone HL3&nbsp;</td></tr><tr><td>APC-Cy7 rato conjugado anti camundongo IgG2a anti Ly6G</td><td>BD</td><td>560600</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>Solução salina estéril</td><td>Laboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ágar de soja tríptica</td><td>BD Difco, França</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Biokey de sangue de ovelha desfibrinado</td><td>, Uruguai</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri estéreis</td><td>Greiner</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>p10 Pipeta</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>p20 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000097</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipeta</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipeta</td><td>Capp</td><td>C200</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>3120000062</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de filtro estéreis p10</td><td>Pontas</td><td>de Filtro Estéril Greiner 771288</td><td></td></tr><tr><td>p200</td><td>Pontas</td><td>de Filtro Estéril Greiner 739288</td><td></td></tr><tr><td>p1000</td><td>Greiner</td><td>750288</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>BIOSAN</td><td>V1-plus</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de ponta fina de aço inoxidável&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>Z168785/Z168777</td><td>Curvado e reto</td></tr><tr><td>Pinça de tecido de curativo</td><td>SIGMA</td><td>F4392</td><td>Comprimento 8 polegadas</td></tr><tr><td>Pinça micro-dissecante</td><td>SIGMA</td><td>F4017</td><td>Reto&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinça de microdissecação</td><td>SIGMA</td><td>F4142&nbsp;</td><td>curvo</td></tr><tr><td>Tesoura Mayo</td><td>SIGMA</td><td>Z265993&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>SAKIRA MEDICAL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punção de biópsia estéril e oslash; 3mm</td><td>Stiefel Laboratories Ltd.</td><td>2079D</td><td>5 mm de diâmetro também pode ser usado</td></tr><tr><td>Tubos estéreis de 1,5 ml Deltalab</td><td></td><td>200400P</td><td></td></tr><tr><td>Tubos estéreis de 15 ml</td><td>Greiner</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Estéril Tubos de 50 ml</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas estéreis 5 ml</td><td>Greiner</td><td>606160</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas estéreis 10 ml</td><td>Greiner</td><td>607160</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas estéreis 25 ml</td><td>Greiner</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Cabine de segurança biológica, classe II</td><td>Thermo Scientific</td><td>série 1300, tipo A2</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Isolador&nbsp; Rack</td><td>RAIR&nbsp; IsoSystem&nbsp;</td><td>76144W</td><td>Super&nbsp; Rato&nbsp; 1800 AllerZone&nbsp;</td></tr><tr><td>Microcentrífuga Refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>Legend Micro 21R</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Heraeus</td><td>Biofuge-pico</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorval ST40R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora&nbsp;</td><td>Pipetas</td> pasteur estéreis de ponta fina <td>modelo 3111</td><td></td></tr> da <tr><td>Thermo Scientific Pipetas</td><td>pasteur</td><td>estéreis D210022</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>Placa estéril de 24 poços</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Solução azul de tripano&nbsp;</td>Contador de Células Automático <td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>- Countess</td><td>Life Technologies</td><td>C10227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de Câmara de Contagem de Células Countess</td><td>Life</td> Technologies <td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Citometria de Fluxo</td><td>BD</td><td>343675</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de Fluxo - FACS Canto-II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de PCR em Tempo Real - Rotor Gene Q ou ABI 7900</td><td>Qiagen / Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>Molecular Grau</td></tr><tr><td>de Biologia DNAse-I</td><td>Life Technologies</td><td>18068-015</td><td>Grau de Biologia Molecular</td></tr><tr><td>DNAse-I Buffer 10X</td><td>Life Technologies</td><td>18068015</td><td>Grau de Biologia Molecular</td></tr><tr><td>EDTA 25 mM</td><td>Life Technologies</td><td>18068015</td><td>Grau de Biologia Molecular</td></tr><tr><td>Água Ultra-Pura</td><td>Life Technologies</td><td>10977</td><td>Grau de Biologia Molecular</td></tr><tr><td>RNAse Out</td><td>Life Technologies</td><td>100000840</td><td>Primers</td></tr> de <tr><td>Hexâmero Aleatório</td> de Grau de Biologia Molecular <td>Life Technologies</td><td>N8080127</td><td>Grau de Biologia Molecular</td></tr><tr><td>M-MLV-RT buffer</td><td>Life Technologies</td><td>18057-018</td><td>Grau de Biologia Molecular</td></tr><tr><td>M-MLV-RT enzime</td><td>Life Technologies</td><td>28025-021</td> Kit <td></td></tr><tr><td>de PCR Verde Syber de Grau de</td> Biologia Molecular <td>Qiagen</td><td>204143</td><td>Primers específicos para biologia molecular</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td>Grau de Biologia Molecular</td> <td>da Life</td> Technologies</tr></tbody></table>

imunoterapia sublingual como uma alternativa para induzir protecção contra infecções respiratórias agudas

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

A via sublingual tem sido amplamente utilizada para entregar pequenas moléculas na corrente sanguínea e modular a resposta imune em diferentes locais. Demonstrou-se que induz efetivamente respostas humorais e celulares em locais sistêmicos e mucosos, ou seja, pulmões e trato urogenital. A vacinação sublingual pode promover proteção contra infecções no trato respiratório inferior e superior; Também pode promover tolerância a alérgenos e melhorar os sintomas da asma. A modulação da resposta imune pulmonar por imunoterapia sublingual (ITSL) é mais segura do que a administração direta de formulações por via intranasal, pois não requer a entrega de moléculas potencialmente nocivas diretamente nas vias aéreas. Em contraste com a administração intranasal, os efeitos colaterais envolvendo toxicidade cerebral ou paralisia facial não são promovidos pela ITSL. Os mecanismos imunológicos subjacentes à ITSL permanecem indescritíveis e seu uso para o tratamento de infecções pulmonares agudas ainda não foi explorado. Assim, o desenvolvimento de modelos animais apropriados de SLIT é necessário para explorar ainda mais suas vantagens potenciais. 
Este trabalho mostra como realizar a administração sublingual de agentes terapêuticos em camundongos para avaliar sua capacidade de proteção contra pneumonia pneumocócica aguda. Aspectos técnicos do manuseio de camundongos durante a inoculação sublingual, identificação precisa da mucosa sublingual, drenagem de linfonodos e isolamento de tecidos, lavagem broncoalveolar e pulmões são ilustrados. Os protocolos para preparação de suspensão de célula única para análise FACS são descritos em detalhes. Outras aplicações a jusante para a análise da resposta imune são discutidas. Aspectos técnicos da preparação do inóculo de Streptococcus pneumoniae e do desafio intranasal de camundongos também são explicados.
SLIT é uma técnica simples que permite a triagem de moléculas candidatas para modular a resposta imune dos pulmões. Os parâmetros que afetam o sucesso do SLIT estão relacionados ao tamanho molecular, suscetibilidade à degradação e estabilidade de formulações altamente concentradas.

Imunoterapia sublingual pode ser utilizado com êxito para modular a resposta imune pulmões. Mostramos que uma única dose de flagelina, o agonista TLR5 e NLRC4, pode induzir a regulação positiva significativa do mRNA que codifica a CXCL1 quimiocinas, CCL20 e a citocina IL-6, comparada com os controlos tratados com solução salina. Dobrar a indução de níveis de ARNm de um pico a 8 h após a ITSL e voltar aos níveis basais após 20 horas (Figura 1). No entanto, quando foi realizada a ITSL infecção intranasal antes de 2 horas com S. Pneumoniae, os níveis de mRNA de IL6 CXCL1 e permaneceu significativamente regulada até 24 horas após a ITSL em comparação com animais não tratados (Figura 2). Análise das populações de células no LBA e no tecido pulmonar por FACS revelou que os animais tratados com FliC por via sublingual havia aumento do número de neutrófilos nas vias respiratórias, mas não no tecido dos pulmões (Figura 3). Figura 4, com ITSL flagelina promoveu aumento da sobrevivência e protecção contra a pneumonia pneumocócica aguda. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6.7in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig1highresV2.jpg" width="680"> Figura 1: Cinética do perfil da transcrição dos pulmões após imunoterapia sublingual com flagelina. Oito a 10 semanas de idade BALB / c (n = 4) foram tratados com 10 ug de flagelina ou soro fisiológico por via sublingual, sob anestesia. Pulmões foram coletadas em momentos diferentes e colocados em conservante ácido nucleico. Extracção de RNA total foi realizada e o cDNA foi sintetizado. níveis de mRNA foram avaliadas por PCR em tempo real utilizando primers específicos constantes do Table 1 A quantificação relativa foi realizada de acordo com método ΔCt usando níveis ACTB mRNA para a normalização. Os resultados são apresentados como aumento de vezes em comparação com o grupo tratado com solução salina em mediana ± SEM. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significantes (p &lt;0,05), calculado de acordo com o teste de Mann-Whitney. Os resultados são representativos de duas experiências independentes. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6.2in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig2highresV2.jpg" width="660"> A Figura 2 o perfil de transcrição 'Pulmões durante pneumonia pneumocócica após imunoterapia sublingual com flagelina. Oito a 10 semanas de idade BALB / c (n = 4 por grupo de controlo e n = 7 por grupo tratado) foi tratado com 10 ug de flagelina ou salina por via sublingual, sob anestesia. 2 horas mais tarde, os ratinhos foram infectados por via intranasal com a dose letal mínima (MLD), provocando 10Mortalidade de 0% de um isolado clínico de S. pneumoniae serotipo 1 E1585, correspondente a 4x10 5 CFU / 50 ul. Os pulmões foram recolhidos 24 horas após o desafio e armazenado em conservante ácido nucleico até a extracção de ARN e a síntese de ADNc foram efectuadas. PCR em tempo real foi realizado (ver a lista de iniciadores na Tabela 1) e quantificação relativa foi realizada de acordo com método ΔCt utilizando os níveis de mRNA para ACTB normalização. Os resultados são apresentados como aumento de vezes em comparação com o grupo tratado com solução salina em mediana ± SEM. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significantes (p &lt;0,05), calculado de acordo com o teste de Mann-Whitney. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6.5in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig3highresV2.jpg" width="680"> Figura 3 Análise de polimorfonucleares neutrófilos (PMN) de recrutamento em tecido e vias aéreas nos pulmões após SLIT. Oito a10 semanas de idade BALB / c (n = 4) foram tratados com 10 ug de flagelina ou soro fisiológico por via sublingual, sob anestesia. 2 horas mais tarde, os ratinhos foram desafiados por via intranasal com o MLD de S. pneumoniae sorotipo 1 E1585. 24 horas após o desafio, a BAL foi realizada e os pulmões foram processados ​​por análise de FACS. PMN foram identificadas como células CD11b Ly6G alto / alto / CD11c negativos e com base no perfil FCS-SSC. Os resultados são expressos como percentagem de PMN em relação dos números de células totais na LBA ou pulmões. As barras representam a média ± SEM. Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significantes (p &lt;0,05), calculados de acordo com one-way teste de Mann-Whitney. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.3in" src="/files/ftp_upload/52036/52036fig4highresV2.jpg" width="530"> Figura 4. SLIT com flagelina protege ratinhos contra a pneumonia pneumocócica aguda. S. pneumoniae sorotipo 1 E1585. A sobrevida foi avaliada em uma base diária. Curvas de Kaplan-Meier foram comparadas segundo teste log-rank (Mantel-Cox). Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significantes (p &lt;0,05) .Results são representativos de dois experimentos independentes. <table align="center" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr><td> Nome </td><td> Sequência de 5'-3 ' </td><td> PCR comprimento do produto (pb) </td></tr><tr><td> MB-actin_F </td><td> GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT </td><td rowspan="2"> 68 </td></tr><tr><td> MB-actin_R </td><td> CGTCATCCATGGCGAACTG </td></tr><tr><td>mCCL20_F </td><td> TTTTGGGATGGAATTGGACAC </td><td rowspan="2"> 69 </td></tr><tr><td> mCCL20_R </td><td> TGCAGGTGAAGCCTTCAACC </td></tr><tr><td> mCXCL1_F </td><td> CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA </td><td rowspan="2"> 84 </td></tr><tr><td> mCXCL1_R </td><td> ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT </td></tr><tr><td> mIL-6_F </td><td> GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA </td><td rowspan="2"> 78 </td></tr><tr><td> mIL-6_R </td><td> AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA </td></tr><tr><td> mTNFalpha_F </td><td> CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA </td><td rowspan="2"> 63 </td></tr><tr><td> mTNFalpha_R </td><td> CCTCCACTTGGTGGTTTGCT </td></tr><tr><td> mCxcl2_F </td><td> CCCTCAACGGAAGAACCAAA </td><td rowspan="2"> 72 </td></tr><tr><td> mCxcl2_R </td><td> CACATCAGGTACGATCCAGGC </td></tr></tbody></table> Tabela 1 lista Primer usado para tempo real, análise de PCR. Seqüências de primers específicos utilizados para a análise de qPCR. Adiante e iniciadores para rato ACTB reversa, Cccl20, CXCL1, IL6, TNF e CXCL1 são apresentados como as sequências 5'-3 'e o comprimento do produto esperado é indicado em pares de bases (pb).

O presente trabalho ilustra a conveniência do uso da imunoterapia sublingual para aumentar a resposta imune inata nos pulmões e conferir proteção contra pneumonia pneumocócica aguda em camundongos.

Imunoterapia sublingual como uma alternativa para induzir protecção contra Infecções Respiratórias Agudas

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

O objetivo geral deste procedimento é usar a imunoterapia sublingual para aumentar a resposta imune inata nos pulmões e confortar a proteção contra pneumonia pneumocócica letal. Em camundongos, o primeiro passo consiste em administrar uma solução com o agente imunoestimulador bandeira na mucosa sublingual de camundongos anestesiados. Em seguida, uma suspensão contendo uma dose letal de uma cepa gênica de pneumonia por estreptococo é instilada pela raiz intranasal em camundongos anestesiados previamente tratados com linha plana ou solução salina como controle.Bronco-bilar lage é realizado para analisar a subpopulação infiltrante nas vias aéreas e o tecido pulmonar é processado para obter uma suspensão celular única para caracterização fenotípica da população celular. Por citometria de fluxo multiparamétrica mandibular, um linfonodo mandibular acessório, bem como tecido sublingual, também podem ser processados para realizar citometria de fluxo ou outra análise a jusante. Populações de células infiltradas nas vias aéreas.Pulmões ou mucosa sublingual podem ser identificados por fenotipagem imunológica e citometria de fluxo multiparamétrica A ativação imune em diferentes tecidos após imunoterapia sublingual também pode ser analisada pelo estudo do perfil de transcrição por PCR em tempo real. Bem-vindo ao Laboratório de Pesquisa de Vacinas do Departamento de Biotecnologia, estamos alocando a escola de medicina da Universidade de U. Um dos principais interesses do nosso laboratório é gerar novas estratégias de intervenção imunológica contra infecções respiratórias. A via internasal tem sido usada com sucesso para a administração de agentes imunoestimuladores para tratar ou prevenir infecções pulmonares ou outras teologias.Mostramos que o lin-de-entrega intranasal, o componente do gel bacteriano, pode ser efetivamente usado para quebrar a infecção pulmonar contínua causada por camundongos STO. Embora a raiz intranasal normalmente exija baixa dose do agente terapêutico e induza forte resposta no trato respiratório, ela apresenta algumas desvantagens, como a possibilidade de toxicidade do sistema nervoso central e paralisia da fácia associada à absorção de compostos imunoestimulantes através dos nervos oratórios. Assim, estabelecemos um modelo de imunoterapia com UAL como alternativa para induzir imunidade protetora contra pneumonia pneumocócica.A imunoterapia sublingual oferece uma alternativa mais segura em comparação com a instalação intranasal. É não invasivo, indolor e simples. Embora possa exigir doses mais altas de um agente terapêutico, ele pode ser usado para administrar NA ou produtos farmacêuticos para, em última análise, modular a resposta imune no comprimento.Vamos agora mostrar-lhe como realizar a administração sublingual em camundongos usando lisonjeiro como agente terapêutico. A imunoterapia com subin com lisonjeiro pode eventualmente proteger os camundongos de um desafio intranasal letal com uma pneumonia estreptocócica, desencadeando uma resposta imune inata no pulmão. Também abordaremos a caracterização do comprimento, resposta inata durante a infecção e após a imunoterapia sublingual usando geometria fluida e PCR em tempo real.Finalmente, mostraremos como coletar linfonodos de granulação local e tecido sublingual para análise posterior. Após o preparo da solução do estimulador a ser testado, anestesiar os animais administrando 200 microlitros da solução de Cetamina OSI por Injeção Interperitoneal Pet a solução contendo o imunoestimulante em volume máximo de 10 microlitros. Em seguida, pegue o mouse com a mão esquerda e segure-o usando o polegar e o indicador com a mão livre.Coloque suavemente a pinça fechada sob a língua e segure-a no lugar. Usando o dedo médio e anelar, pegue a pipeta e administre a solução no assoalho da boca e no lado dorsal da língua. Remova a pinça e deixe a boca descansar por três a cinco minutos antes de colocá-la de volta na gaiola.As principais características desta técnica são o volume total utilizado para tratar os animais e a anestesia. O pequeno tamanho dos camundongos da cavidade oral limita o volume máximo que pode ser aplicado à proporção sublingual a 10 microlitros. Uma vez decidida a dose, você deve ajustar a concentração da amostra para esse volume máximo.Volumes maiores podem resultar em deglutição indesejada ou aspiração da solução. A anestesia é fundamental para evitar a deglutição e permitir a penetração das substâncias através do epitélio. Aconselhamos que você não use a inalação para anestesia, pois os ratos acordarão muito cedo.Observe que alguns anestésicos injetáveis podem induzir salivação em camundongos. Se isso acontecer, use um pequeno pedaço de ajuste ou papel para eliminar a salivação excessiva antes de aplicar a solução com o agente terapêutico, a dose do agente terapêutico deve ser ajustada para maximizar seu efeito e testar várias doses é altamente recomendado. Se você já usou seu composto pela raiz intranasal, uma dose cinco a 10 vezes maior seria um bom ponto de partida para testar.Teste seu agente terapêutico pela raiz sublingual. Observe que a absorção através do epitélio será limitada pelo tamanho da molécula descongelar Uma alíquota de estoque de trabalho previamente preparado de pneumonia por estreptococos de número de UFC bacteriana conhecida centrifugue por cinco minutos a 2.500 Gs e descarte o supernat Suspender Em um mililitro de solução salina esterlina e centrífuga. Novamente, descarte o sobrenadante e descanse.Suspenda o pellet no volume apropriado de solução salina estéril para obter uma suspensão de quatro vezes 10 a cinco UFC em 50 microlitros, que corresponde à dose bacteriana mínima do sorotipo particulado utilizado que causa 100% de mortalidade no bulbo C. Os camundongos tomam 50 microlitros da suspensão bacteriana e instilam cuidadosamente o volume total nas narinas de um camundongo previamente anestesiado. Segure o mouse na posição vertical por dois minutos e deixe-o descansar na posição dorsal por mais dois minutos. Após o desafio, confirmou-se o número de UFC na suspensão bacteriana realizando uma diluição serial de dez vezes da suspensão e colocando-a no sangue.Placa de ágar Incube durante a noite a 37 graus com 5% de CO2 muco. As colônias de etno podem ser distinguidas pelo alo verde característico das bactérias alfa hemolíticas. Contar as unidades formadoras de colónias e registar a utilização da dose de provocação.Depois de sacrificar o animal, abra a cavidade torácica até o pescoço. Faça uma incisão ao longo das patas dianteiras para expor a traqueia e a área sublingual. Identifique os gânglios linfáticos inferiores.Estes geralmente aparecem como estruturas de forma oval esbranquiçada sobre as glândulas salivares. Usando a pinça de curva de ponta fina, puxe suavemente o tecido sublingual e exponha o lado dorsal do assoalho da boca. Pegue os gânglios linfáticos mandibulares puxando suavemente para cima com a pinça de ponta fina para liberá-los do tecido.Coloque-os em um tubo contendo C-R-P-M-I ou solução conservante de ácido nucleico de acordo com o procedimento a jusante. Isso seria realizado mais tarde. Agora identifique os gânglios linfáticos menores localizados mais profundamente em ambos os lados da garganta e retire-os.Estes são os linfonodos mandibulares acessórios. Abra a cavidade torácica para expor o pulmão e remover o timo. Corte o AVC inferior e remova o excesso de sangue com um tecido absorvente para realizar a lavagem bronco.Primeiro, exponha a traqueia. Em seguida, faça uma pequena incisão com um bisturi e introduza uma ponta fina. Transfira peppe previamente preenchido com um mililitro de PBS sem cálcio, magnésio mais um EDA milimolar Instilar cuidadosamente e aspirar o volume total pelo menos três vezes.Em seguida, aspire e transfira a suspensão celular para um tubo estéril de 1,5 mililitro. Perfunda os pulmões injetando cinco mililitros de PBS sem cálcio, magnésio mais um EDTA milimolar no ventrículo direito do coração para eliminar todos os glóbulos vermelhos e células imunológicas presentes nos vasos sanguíneos dos pulmões. Se a perfusão foi realizada corretamente, a cor dos pulmões mudará de rosa para branco.Remova o coração, pegue os pulmões perfundidos e coloque-os em meio completo ou solução conservante de ácido nucleico, dependendo da análise a jusante a ser realizada. Se você deseja analisar a população de células na mucosa sublingual, isole a cabeça do animal e remova as glândulas salivares e anexe os tecidos moles. Faça uma incisão em cada lado da boca até chegar à articulação da mandíbula e separe a mandíbula inferior junto com a língua e o assoalho da boca.Usando uma pinça de dente de rato romba, puxe a língua para cima e faça uma incisão onde a base da língua encontra o assoalho da boca. Esta área constitui a mucosa sublingual. Corte e remova a língua usando um punção de biópsia, fórceps e tesoura.Corte o tecido da mucosa sublingual e coloque-o em um tubo limpo. Transfira os pulmões para um prato de 24 poços e signifique-os com uma tesoura limpa. Adicione um mililitro de meio de digestão pipetando para cima e para baixo várias vezes e incube a 37 graus e 5% de CO2 por 40 minutos após a incubação.Pipet para cima e para baixo novamente para se certificar de que a maioria das células foi liberada do tecido. Transfira a suspensão celular para um filtro de células de micro malha de 40 e lave com cinco mililitros de PBAs. Centrífuga EDTA de cinco milimolares a 2.500 GS por cinco minutos.Reus suspende as células em um mililitro de fax EDTA composto com PBS sem cálcio, magnésio, um EDTA milimolar e 1% de soro fetal boing. Pegue um QU e faça uma diluição dupla das células com trip e azul e conte as células de Reus suspendidas a uma concentração de duas vezes 10 elevado a sete células por mililitro e adicione 50 microlitros por tubo. Adicione 50 microlitros de uma mistura de anticorpos duas vezes maior a cada tubo para análise imunofenotípica.Incube por 30 minutos no gelo no escuro depois de lavar três vezes com fatos. EDTA ressuspende as células em 200 microlitros de fatos EDTA e analisa em um citômetro mesmo procedimento pode ser usado para analisar a população de células no tecido sublingual usando meios de digestão contendo este espaço. A imunoterapia sublingual com colagenase e DS um usando flatline purificada, um agonista de TLR cinco e LC quatro induziu uma regulação positiva significativa dos níveis de mRNA de quimiocinas e citocinas envolvidas no recrutamento de neutrófilos nos pulmões.Isso também foi observado durante a infecção. O recrutamento de PMN para os pulmões foi confirmado por citometria de fluxo. O tratamento sublingual com TLR cinco agonistas correlacionou-se com o aumento da sobrevida dos animais e proteção contra pneumonia pneumocócica.Mostramos que a imunoterapia sublingual é um meio eficaz para induzir proteção nas linhas contra pneumonia pneumocócica invasiva do ENP. Isso foi conseguido pela instalação sublingual de lain, um alfaiate de cinco agonistas que não é produzido por histopneumonia. Instalação sublingual de lain induzida regulação positiva da quimiocina C Xcl L one nas linhas, bem como infiltração de neutrófilos.Um tipo de célula crucial para eliminar a imunoterapia sublingual com pneumococo com agonistas TLR pode ser usada para tratar infecções isoladamente ou em combinação com terapias atuais, como tratamento com antibióticos, a fim de prevenir a disseminação bacteriana e o desenvolvimento de formas graves de infecção. A raiz sublingual também pode ser usada para administrar a vacina e demonstrou ser eficaz na indução da imunidade protetora mucosa e sistêmica. Esta estratégia é de particular interesse no caso de infecções respiratórias e especialmente para pneumonias bro, uma vez que poderia não só prevenir a doença básica, mas também asal colonização bloqueando as bactérias no esporte de entrada.De modo geral, acreditamos que a via sublingual é uma alternativa atraente para desenvolver novas estratégias para tratar ou prevenir infecções respiratórias. Nós encorajamos você a experimentar esta técnica.

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JoVE Journal

Medicine

Medicina

Vacinação profilática e terapêutica, muitas vezes não estimulam fortes respostas imunes, devido à semana de drenagem da vacina para os gânglios linfáticos e, consequentemente, fraco envolvimento das células do sistema imunológico. Por injecção directa de vacina para os nódulos linfáticos, assim chamada injecção intralinfática, a eficácia da vacina pode ser fortemente melhorada e as doses de vacina podem ser reduzidos.

Intralinfática imunoterapia e vacinação em camundongos

A instilação intratraqueal mediada por intubação (IMIT) de reagentes é um método excelente e não invasivo para estudar doenças respiratórias, bem como um método para instilar reagentes terapêuticos diretamente no pulmão. É um método rápido e altamente reprodutível, adequado para testes pré-clínicos.

Intratraqueal (IMIT) instilação mediada por intubação: A não-invasiva, sistema de entrega Lung-specific

Há uma falta geral de conhecimento sobre como as vacinas funcionam. Aqui, propomos o uso combinado de genética reversa e camundongos quiméricos da medula óssea para obter informações sobre as respostas imunes iniciais do hospedeiro às vacinas, com foco especial nas células dendríticas e na imunidade das células T.

A administração intranasal de recombinantes Vacinas contra Influenza em quimérico rato Modelos para estudar a imunidade mucosal

Demonstramos o procedimento para inoculação intratraqueal de Haemophilus influenzae no trato respiratório inferior de camundongos. Esta é uma ferramenta muito útil para estudar as vias de sinalização que regulam a inflamação das vias aéreas em modelos de camundongos.

Administração intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; No mouse modelos para o Estudo de inflamação das vias aéreas

Detalhamos aqui a metodologia seguida para comparar a eficácia protetora e a resposta imune pulmonar induzida pela imunização intranasal e subcutânea com BCG em modelo de camundongo. Nossos resultados mostram os benefícios da vacinação pulmonar e sugerem um papel da resposta mediada por IL17 na proteção induzida pela vacina.

A eficácia de protecção e Pulmonar resposta imune Seguindo subcutânea e intranasal BCG Administração em Ratinhos

Procedimentos experimentais para a extração subsequente dos tecidos linfáticos para testar a ativação de células dendríticas linfoides são descritos após o tratamento de um nanomaterial imunoestimulante.

Immunostimulatory agente avaliação: Linfoide em injeção e extração de tecido ativação rota dependente de célula dendrítica

Descrito, é a preparação de nanopartículas lipossomas antigênicas e seu uso em estimulando células B ativação in vitro e em vivo. Respostas consistentes e robustas anticorpo levaram ao desenvolvimento de um novo modelo de alergia ao amendoim. O protocolo para a geração de lipossomas antigênicos pode ser estendido para antígenos diferentes e modelos de imunização.

Antigênicos lipossomas para a geração de anticorpos específicos de doença

Aqui nós apresentamos um protocolo elegante na vivo avaliação da vacina respostas imunes de eficácia e de acolhimento. Este protocolo pode ser adaptado para modelos de vacina que estudar virais, bacterianas ou parasitárias patógenos.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

É apresentado aqui um procedimento passo a passo para induzir ferimento de pulmão agudo nos ratos pela instilação intratraqueal direta do lipopolissacarídeo e para executar a análise de FACS de amostras de sangue, de líquido broncoalveolar do lavagem, e de tecido do pulmão. A invasividade mínima, o manuseio simples, a boa reprodutibilidade e a titulação da severidade da doença são vantagens dessa abordagem.

Induzindo lesão pulmonar aguda em camundongos por instilação de lipopolissacárido intratraqueal direto

Este artigo descreve e demonstra a administração de vacinas intranasais e a coleta de leite de coelhos lactadores (Oryctolagus cuniculus) como forma de avaliar a imunidade mucosa em um modelo translacionalmente apropriado de imunização materna.

Imunização Intranasal e Coleta de Leite em Estudos de Imunização Materna em Coelhos Brancos da Nova Zelândia (Oryctolagus cuniculus)

Neste estudo, uma técnica não invasiva de instilação endotraqueal demonstrou desenvolver ALI em ratos usando um laringoscópio básico para garantir a entrega precisa de LPS aos pulmões. O LPS é injetado por meio de um tubo endotraqueal usando um laringoscópio. A magnitude da lesão pulmonar é avaliada em vários momentos.

Administração endotraqueal não invasiva de lipopolissacarídeo para induzir lesão pulmonar aguda em roedores

Aprenda a usar imunoterapia sublingual para potencializar a resposta imune inata nos pulmões e proteger contra pneumonia pneumocócica letal em camundongos. Este método não invasivo oferece uma alternativa segura à administração intranasal.

Imunoterapia sublingual como uma alternativa para induzir protecção contra Infecções Respiratórias Agudas

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