Name: Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprenda a analisar dinâmica de sódio em dendritos e espinhas de neurônios hipocampais usando imagem multiphoton e uncaging de glutamato por UV. Este método combina patch-clamp e técnicas ópticas para estudar sinalização neuronal em tecido intacto.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este estudo foi apoiado por uma bolsa da Fundação Alemã de Ciência (DFG, Ro2327 / 6-1) para CRR Os autores gostariam de agradecer a S. Durry e C. Rodrigo para assistência técnica especializada, e M. Dubbert (Laboratório de Eletrônica, Instituto Zoológico da Universidade de Colônia, Alemanha) para obter ajuda na implementação do controlador de célula Pockels eo interruptor HF.

<ol><li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+Na%2B+imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Pflueg.+Arch.%2C+Eur.+J.+Phy%22%5BJournal%5D)">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li>
<li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor-mediated+Na%2B+signals+in+spines+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li>
<li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+new+fluorescent+Na%2B+indicator+CoroNa+Green%3A+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li>
<li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li>
<li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Roy.+Soc.+B-Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li>
<li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li>
<li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+mismatch+between+the+Na%2B+flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li>
<li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B+imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na%2B+influx+between+axon+and+soma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li>
<li>Denk, W., Piston, D., Webb, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDenk%2C+W+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , Plenum Press. 445-458 (1995).</li>
<li>Jaffe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spread+of+Na%2B+spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2%2B+entry+into+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li>
<li>Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flash+photolysis+of+caged+compounds+in+the+cilia+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li>
<li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Ca%282%2B%29+and+Na%28%2B%29+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li>
<li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2FK+pump+current+and+%5BNa%5D%28i%29+in+rabbit+ventricular+myocytes%3A+Local+%5BNa%5D%28i%29+depletion+and+Na+buffering%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys%22%5BJournal%5D)">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li>
<li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li>
<li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+mobility+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li>
<li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li>
<li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm%3A+photochemical+advantages%2C+localisation%2C+phototoxicity+and+methods+for+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li>
<li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. Spatial light modulator microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNikolenko%2C+V+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22">Cold Spring Harbor protocols</a>. , 1132-1141 (2013).</li>
</ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes. Os autores receberam apoio financeiro permitindo Open Publication Acesso por Rapp optoeletrônicos (Wedel, Alemanha), que produz um instrumento usado no artigo de vídeo. A empresa não foi nem envolvidos nos experimentos, nem na manipulação de dados, nem na escrita manuscrita.

O presente estudo mostra que SBFI é bem adequado para dois fótons de imagem de transientes de cálcio intracelular em pequenos compartimentos celulares. Tem que se ter em mente, porém, que a eficiência quântica de SBFI é bastante baixo em 15 e relativos alterações na concentração de sódio são muito pequenas com atividade fisiológica. Assim, a medição de alta resolução de transientes de Na + em processos distintos é uma tarefa relativamente tedioso, e criação de faixas ou a média de vários ensaios, pode ser necessário para obter sinais satisfatórios. Além disso, a cinética de transientes de sódio são surpreendentemente lenta, tornando obrigatória a gravar por períodos de tempo prolongados. Esta observação corresponde àqueles em estudos anteriores, onde decaimento monoexponencial de transientes de sódio em dendrites neuronais e em astrócitos foi caracterizado por grandes constantes de tempo de decaimento no intervalo de 10 segundos à temperatura ambiente, 1,2,6. Transientes de sódio, portanto, parecem exercer uma vez co muito mais lentourse e muito maiores constantes de tempo de decaimento, em comparação com transientes de cálcio 16. Separe essas desvantagens, a imagiologia de sódio revela-se uma ferramenta valiosa para a investigação das propriedades fisiológicas de subdomínios neuronais. Por exemplo, a imagiologia de sódio pode servir para acompanhar a actividade sináptica excitatória no ou perto de sinapses activas. Porque não é essencialmente sódio tamponada 8,17, transientes sódio induzido da actividade são linearmente relacionado com uma vasta gama de libertação sináptica de glutamato aplicado exogenamente ou glutamato. Eles, portanto, representam indicadores diretos e imparciais sobre a atividade glutamatérgica neuronal. Além disso, os corantes indicadoras de sódio apresentam uma elevada K d &#39;s (da SBFI K d está na gama de 25 a 1 mM). Mesmo com as concentrações relativamente elevadas de corante intracelulares utilizados para atingir o brilho suficiente (geralmente 0,5-1 mM), a alta K d &#39;s significa que os próprios corantes não actuar como tampões para sódio. Por conseguinte, eles não se distorcem o campo de amplitude nem o tempo de transientes de sódio, o que é sempre uma preocupação quando corantes sensíveis ao cálcio são introduzidos nas células 18. Assim, pode-se presumir que os sinais detectados representam uma boa medida das mudanças &quot;reais&quot; em sódio intracelular. Seu curso lento tempo implica, então, que a velocidade de difusão intracelular de sódio nos neurônios é muito menor do que anteriormente se pensava 19. Um requisito essencial para a execução bem sucedida de experimentos que abordam as propriedades excitatórias transmissão e influxo de sódio vias sinápticas em espinhas e dendritos é a indução de uma ativação rápida e altamente localizada de estruturas pós-sinápticos. Isto pode ser obtido por aplicação rápida e local de glutamato ou agonistas de glutamato na vizinhança directa de uma coluna ou um dendrito pelo fotólise de compostos em gaiolas. Flash fotólise faz dama não mecanicamentege o tecido, é livre de artefatos de movimento e está bem estabelecido para a investigação de questões relacionadas (por exemplo, a sinalização local de cálcio). O diâmetro da mancha de 1,5 um foi uncaging no plano xy. Uncaging perto de um sinal de sódio espinhoso dendrito induzida em ambas as espinhas e a dendrite pai. Considerando que os sinais tendem a ser maior nas espinhas mais próximas ao local uncaging, as amplitudes do dendrito pai e espinhas mais longe ainda eram bastante semelhantes aos imediações do local uncaging. Uncaging foi realizada durante 300 mseg, durante o qual as correntes internas aumento na amplitude. Glutamato Uncaged poderia ter difundido no tecido durante o mesmo período de tempo, ativando os receptores de glutamato ionotrópicos e influxo de sódio em regiões dendríticas e espinhas mais longe do local uncaging. Um problema intrínseco que ocorre quando se utiliza um laser de UV para a fotólise de compostos engaiolados administradas através da solução do banho de célulasé &quot;filtragem interior&quot;. Devido à elevada taxa de absorção da gaiola, a luz UV é atenuada fortemente ao longo do caminho do objectivo para o local de estimulação 20,21. Uma maneira possível de evitar isso é a perfusão local com a gaiola que está restrito apenas ao sítio de estimulação, o qual, além disso, diminui a quantidade de composto necessária para enjaulado um mínimo. Em comparação com uncaging UV a laser de varredura-mediada, quase-infra-vermelho de dois fotões uncaging 22 é espacialmente mais precisa, principalmente porque a exactidão da estimulação é aumentada no eixo z. Por outro lado, devido à pequena secção transversal de gaiolas vulgarmente utilizados para os comprimentos de onda mais longos, como empregues com excitação de dois fotões, ou uma elevada concentração do composto em gaiolas ou muito elevada, são necessárias intensidades de luz potencialmente fototóxicos. Além disso, dois fótons uncaging exige um investimento muito maior no equipamento; entre outros, um laser de IR adicional além dos componentes ópticos, é necessário,. Ambos SBFI e MNI-glutamato são excitáveis ​​na faixa de comprimento de onda idênticas. Isto pode levar a uma indesejada interdependência de laser de UV e uncaging SBFI ou laser imagem IR e MNI-glutamato, o que resulta no branqueamento de SBFI pelo flash uncaging e / ou um uncaging contínua de glutamato por o feixe de luz infravermelha. No entanto, como mostrado na Figura 6C, nem um flash UV, por si só, nem a imagem de vários fótons causado tais efeitos recíprocos, nas condições experimentais. Sistemas de flash de UV semelhantes ao descrito aqui são utilizados rotineiramente em muitos laboratórios e outros podem ser relativamente facilmente incorporado em qualquer microscópio de imagem multi-fotão existente. Ele oferece a vantagem de que o feixe de laser para fotólise pode ser posicionado livremente no campo de visão. Além disso, o sistema permite um reposicionamento rápido e automático do feixe de laser e o volume de libertação, respectivamente, no campo de visão durante uma experiência. Our modificação simplifica e melhora o posicionamento preciso do local uncaging, de modo a que os quadros do software de imagem pode servir para ajustar quadros de imagem e uncaging congruentemente. Tomados em conjunto, de células inteiras de patch-clamp e imagem multi-fotão de sódio em dendritos e espinhas dos neurónios centrais, combinada com um procedimento modificado para uncaging luz UV-induzido de glutamato, permite a activação fiável e focal de receptores de glutamato no tecido. Pode, assim, servem para analisar as propriedades de transmissão sináptica excitatória e de sinais de sódio em neurónios pós-sinápticos no tecido intacto.

As recentes melhorias nas técnicas de microscopia óptica, como a microscopia multi-fotão têm permitido o estudo de parâmetros morfológicos e fisiológicos de células cerebrais no tecido intacto com alta resolução espacial e temporal. Combinado com eletrofisiologia, estas técnicas são agora amplamente utilizados para analisar os sinais elétricos relacionadas com a atividade dos neurônios, bem como sinais concomitantes de cálcio em pequenos compartimentos subcelulares, ou seja, em dendrites finas e espinhas dendríticas. Além de transientes de cálcio, actividade sináptica também induz sinais de sódio em dendritos e espinhas, que possuem propriedades que são largamente inexplorado. Tais sinais podem ser analisados ​​por dois fotões imagiologia de sódio intracelular ([Na +] i) que permite a medição em linha de [Na +] i transitórios durante períodos prolongados sem branqueamento significativo corante ou foto-dano 1,2. Para imagiologia de [Na +] i </sub&gt;, apenas alguns corantes indicador químico estão disponíveis, por exemplo, Corona Verde ou Asante Natrium Verde 3,4. A sonda fluorescente mais usada para Na + imagem é isophthalate benzofuran- (SBFI) de ligação de sódio. É uma medida proporcional, corante UV-animado semelhante ao conhecido corante sensível ao cálcio com fura-2, e tem sido empregada para imagiologia convencional de Na +, em muitos tipos de células (por exemplo, 5,6). Existem diferentes possibilidades de excitar o corante e coleta de sua fluorescência. Se a alta resolução temporal (ou seja, uma taxa de quadros alta de imagem) é necessária em combinação com a informação espacial, SBFI pode ser animado com uma lâmpada xenon arco ou um dispositivo de alta potência diodo emissor de luz (LED) e sua emissão detectada com uma carga de alta velocidade dispositivo -coupled (CCD) 7,8. Para resolução espacial máxima profunda no tecido, microscopia de varredura a laser multi-fotão é o método de escolha 9. A relativamente baixa efficie quantumNCY de SBFI exige concentrações relativamente elevadas de corante (0,5-2 mM), e o carregamento directo de forma a membrana impermeável de SBFI através de um microeléctrodo afiada 10 ou remendo pipeta 1. Usando SBFI, trabalho anterior realizado em fatias de tecido agudas do hipocampo de roedores demonstraram transientes de sódio relacionadas com a actividade em dendritos e espinhas de neurônios piramidais CA1 que são causadas principalmente pelo influxo de sódio através ionotrópico receptores NMDA 1,2. Para o estudo das propriedades de tais sinais de sódio locais em mais detalhe, a activação específica de receptores pós-sinápticos, por aplicação de agonistas do receptor é um método bem adequada de escolha. Para imitar a atividade pré-sináptica e liberação do transmissor, a aplicação deve ser relativamente breve e focada para permitir estimulação local. Isto, no entanto, provou ser um grande desafio em tecido intacto. Aplicação de pressão local de agonistas do receptor utilizando uma pipeta de ponta fina permite ap muito focalcação, mas hospeda o risco potencial para a produção de movimento da estrutura de interesse (por exemplo, como um dendrito ou espinhas dendríticas), e, portanto, impede a imagem de alta resolução. A adequação da iontoforese de substâncias neuro-ativa depende de suas propriedades elétricas e altas amplitudes atuais podem produzir artefatos celulares também. Uma maneira de contornar esses obstáculos é o emprego de compostos fotoativados e sua fotólise. Basicamente, dois princípios diferentes são usados ​​para a foto-ativação de substâncias enjaulados: I) Wide-campo do flash fotólise 11 e II) uncaging focal empregando módulos de digitalização em combinação com lasers 12. Enquanto todo o campo de flash fotólise é utilizada para activar grandes regiões de interesse, por exemplo, uma célula inteira, uncaging focal é utilizado para estimular especificamente pequenos compartimentos celulares. No presente estudo, nós demonstramos um procedimento de célula inteira de patch-clamp e multi-pimagiologia de sódio Hoton em dendritos e espinhas dos neurónios centrais, combinada com um procedimento modificado para uncaging induzida por luz UV de glutamato, o que permite a activação fiável e focal de receptores de glutamato no tecido.

<table><tbody><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Hilgenberg</td><td>1405059</td><td>75 x 2 mm, espessura da parede 0,3 mm</td></tr><tr><td>Câmera</td><td>Jenoptik</td><td>ProgRes MF</td><td>IR-DIC câmera compatível</td></tr> Software <tr><td>de deconvolução</td><td>SVI</td><td>Huygens Pofessional X11</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de fibra óptica</td><td>Ocean Optics</td><td>USB 4000</td><td>Espectrômetro de fibra óptica em miniatura</td></tr><tr><td>Tubos de filtro</td>Filtro centrífugal <td>VWR</td><td></td><td>, 0,2 &micro; m</td></tr><tr><td>Software de imagem</td><td>Olympus Europe</td><td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de potência do feixe IR</td><td>Construído</td><td></td> à medida <td>Controlo da intensidade do feixe de laser + interruptor rápido para zero no flyback através do laser IR da célula pockels</td></tr><tr><td></td><td>SpectraPhysics</td><td>Mai-Tai</td><td>fs-pulsado Ti:Sa laser sintonizável (710 - 990 nm); CUIDADO</td></tr><tr><td>Monitor de potência IR</td><td>Micromanipulador personalizado</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Burleigh</td><td>PCS 5000</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio/Sistema de Imagem</td><td>Olympus Europe</td><td>BX51WI/FV300</td><td>Tanto o microscópio quanto os sistemas de imagem foram fortemente modificados</td></tr><tr><td>Roda de filtro ND</td><td>Newport</td><td>50Q04AV.2</td><td>Sílica fundida UV, densidade óptica 0,05 - 2,0</td></tr><tr><td>Objetiva</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>NIR Apo 60x/1.0w</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplificador</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de pipetas</td><td>Narishige</td><td>Modelo PP-830</td><td></td></tr><tr><td>Sistema pneumático de ejeção de drogas</td><td>NPI Eletrônico</td><td>PDES-DXH</td><td></td></tr><tr><td>Célula Pockels</td><td>Conoptics</td><td>350-80 LA-BK</td><td>EOM, usado como interruptor rápido e para ajuste</td></tr><tr><td>de potência Célula Pockels driver</td><td>Conoptics</td><td>M302-RM</td><td>Amplificador diferencial de alta tensão</td></tr><tr><td>Obturador</td><td>Vincent Associates</td><td>LS6ZM2</td><td>ALMgF2-revestido Lâminas BeCu</td></tr><tr><td>Controlador de obturador Driver</td><td>de obturador personalizado</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vincent Associates</td><td>Uniblitz VCM D1</td><td></td></tr><tr><td>Slicer/Vibratome</td><td>Thermo Scientific</td><td>Microm HM 650 V</td><td></td></tr><tr><td>Software de desenjaulamento</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td><td></td></tr><tr><td>UV laser</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>DL-355/10</td><td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CUIDADO</td></tr><tr><td>Sistema de varredura a laser UV</td><td>Rapp OptoElectronic</td><td>UGA 40</td><td>Sistema de varredura galvanométrica</td></tr><tr><td>Nome do composto</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários/ Descrição</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-127</td><td>Antagonista do receptor AMPA; CUIDADO</td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J64210</td><td>antagonista do receptor NMDA; CUIDADO</td></tr><tr><td>SBFI K+ sal</td><td>Teflabs</td><td>OO32</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Ascent Scientific</td><td>Asc-055</td><td>Inibidor de canais de Na+ dependentes de voltagem; CUIDADO</td></tr><tr><td>NMI-enjaulado-L-glutamato</td><td>Torcis</td><td>1490</td><td>Glutamato enjaulado liberado após absobção UV</td></tr></tbody></table>

multi-photon intracelular de sódio imagem combinado com mediada por uv uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais ca1

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Microscopia de fluorescência multi-fotão permitiu a análise de parâmetros morfológicos e fisiológicos de células cerebrais no tecido intacto com alta resolução espacial e temporal. Combinado com eletrofisiologia, é amplamente utilizada para estudar sinais de cálcio relacionadas com a actividade em pequenos compartimentos subcelulares, como dendritos e espinhas dendríticas. Além de transientes de cálcio, actividade sináptica também induz sinais de sódio pós-sinápticos, as propriedades dos quais são compreendidos apenas marginalmente. Aqui, nós descrevemos um método para a célula inteira patch-clamp combinado e imagem de sódio multi-fotão em micro domínios celulares de neurônios centrais. Além disso, apresentamos um procedimento modificado de ultra-violeta (UV) uncaging -Light-induzida do glutamato, o que permite a ativação confiável e focal de receptores de glutamato no tecido. Para este fim, as gravações de célula completa foram realizados em cornu Ammonis subdivisão 1 (CA1) neurónios piramidais em fatias de tecido aguda dahipocampo do rato. Os neurônios foram preenchidos com o corante fluorescente SBFI sensível ao sódio através do patch-pipeta, e multi-fotão excitação de SBFI permitiu a visualização dos dendritos e espinhas adjacentes. Para estabelecer uncaging focal induzida por UV, vários parâmetros, incluindo a intensidade da luz, o volume afectada pelo feixe uncaging UV, o posicionamento do feixe, bem como a concentração do composto testado foram engaiolados e optimizado. Nossos resultados mostram que a perfusão local com glutamato enjaulado (MNI-glutamato) e seu resultado UV-uncaging focal em correntes de entrada e transientes de sódio nos dendritos e espinhas. Curso de tempo e de amplitude dos dois sinais de correntes de entrada e de sódio correlacionar com a duração do impulso de uncaging. Além disso, os nossos resultados mostram que os sinais de cálcio intracelular são bloqueados na presença de agentes bloqueadores de receptores de glutamato ionotrópicos, demonstrando que são mediados por influxo de sódio que esta via. Em resumo, o método fornece uma ferramenta fiável para oinvestigação dos sinais de sódio intracelular induzida por activação do receptor focal em tecido cerebral intacto.

No presente estudo, nós demonstramos um método de microscopia multi-fotão de dinâmica de sódio celulares com o corante fluorescente SBFI dependente de sódio em neurónios piramidais CA1 do rato aguda fatias de tecido de hipocampo. Além disso, mostramos como combinar esta técnica de imagem com uncaging baseada no escaneamento a laser de compostos neuro-ativo (por exemplo, o glutamato enjaulado) e seu direcionamento preciso para micro-domínios celulares. Carregando os neurónios com SBFI através da pipeta patch-activada a visualização de toda a célula, incluindo dendrites finas e espinhas adjacentes, empregando múltiplos fotões de excitação (Figura 6A, B, D e figura 7A). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500"> Figura 6 sinais de sódio e correntes sinápticas induzidas por fotólise de glutamato enjaulado. (A) Maximimagem de projeção al de um neurônio CA1 piramidal carregado com SBFI via pipeta de patch (PP). A caixa indica a área mostrada ampliada em B. LP indica a posição e orientação da pipeta para a perfusão local de glutamato enjaulado. (B) de projecção de alta potência máxima de uma pilha de secções ópticas de uma dendrite com espinhas dendriticas adjacentes. As pilhas de secções ópticas sofreu z-alinhamento e deconvolução. A cruz vermelha indica a região alvo do feixe uncaging. A linha pontilhada laranja delineia a região de interesse a partir do qual a emissão de fluorescência foi registada. A caixa indica a área mostrada ampliada em D. (C) Esquerda: sinal de sódio (linha superior) e somático interior atual (linha inferior) induzida por fotólise de glutamato enjaulado (indicado pelo flash amarelo). A linha vermelha representa um ajuste dos dados experimentais. A área cinzenta representa o período em que o flash uncaging (300ms) obstruiu a imagem de fluorescência SBFI Direito.: Sem pré-perfusão com glutamato enjaulado, o mesmo-flash UV nem provocou uma mudança na emissão SBFI, nem uma corrente para dentro (D) À esquerda:. Imagem de alta potência do dendrito e adjacente espinhas, conforme esboçado na B. Ao lado, a mesma imagem com valores de cinza invertidos. As linhas tracejadas indicam as regiões de interesse, em que a emissão de fluorescência foi registado. A cruz vermelha indica a localização do feixe uncaging direita:. Transientes sódio induzida por fotólise-lampejo de UV de glutamato enjaulado. Traço azul: sinais de sódio no dendrito; traço vermelho: resposta média de três espinhas adjacentes ao local uncaging; traço verde: resposta média de três espinhas distantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">favor clique aqui para uma versão maior dessa figura.</a> Após a perfusão local com Cagedglutamato, a aplicação de um flash de UV perto de uma dendrite resultou numa diminuição transitória na emissão de fluorescência de SBFI, reflectindo um aumento na concentração de cálcio intracelular (Figura 6C, D e Figura 7B). Ao mesmo tempo, uma corrente de influxo foi registada a soma (Figura 6C e a Figura 7B). Aumentando a duração do flash de UV resultou no aumento da amplitude de ambos os provocada correntes para dentro e os sinais de sódio (dados não mostrados), indicando que o sistema foi bem dentro da sua gama dinâmica e que as respostas celulares nem uncaging nem estavam saturados. Aplicação de um aparelho de lampejo de UV de duração idêntica ou mais fatias para que não havia sido pré-perfusão com glutamato enjaulado, nunca provocou alterações na fluorescência SBFI nem correntes de entrada, indicando que estes sinais são devido à uncaging de glutamato (Figura 6C). Além disso, estes resultados mostram que nenhum dos componentes interdependência imaging- e observa-se u uncagingnder nossas condições experimentais. Sinais de sódio também pode ser detectado nas espinhas dendríticas (Figura 6D). Enquanto nós não tentou realizar a estimulação de uma única coluna apenas com glutamato uncaging, amplitudes de pico tende a ser um pouco maior em lombadas próximas ao local uncaging, enquanto que as espinhas mais longe mostrou alterações de fluorescência praticamente idênticas às do dendrito pai (Figura 6D). Por fim, estudou-se o caminho para o influxo de sódio em dendritos e espinhas em resposta a uncaging de glutamato. Para este fim, utilizou-CNQX e APV, que são bloqueadores selectivos para os sódio-permeável, os receptores do glutamato ionotrópicos do AMPA- e subtipo NMDA-, respectivamente. Os nossos resultados mostram que os sinais de sódio intracelular induzida pelo glutamato e as correntes somáticas eliciados foram omitidos na presença destes bloqueadores (Figura 7B). Após a lavagem para fora dos bloqueadores, os sinais são recuperados. Isso demonstra that uncaging de glutamato ativa os receptores de glutamato ionotrópicos em neurônios piramidais CA1, que medeiam o influxo de sódio em dendritos e espinhas, resultando em transientes de cálcio intracelular ea correntes de entrada. <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600"> Figura 7 Perfil farmacológico de sinais de sódio evocadas e correntes de entrada. (A) cheio de SBFI CA1 piramidal neurônio com o patch pipeta (PP) ligado à soma (B) À esquerda:. Transitória de sódio e atual somática induzida por foto-ativação de glutamato enjaulado em um dendrito e espinhos anexados Center:. Perfusão com o Os bloqueadores de receptores de glutamato ionotrópicos CNQX e APV inibe tanto o sinal de sódio e a corrente de influxo induzido por uncaging direita:. Ao wash-out dos bloqueadores, os sinais são restaurados. Os represen linha vermelhats um ajuste dos dados experimentais. A área cinza representa o período em que o flash uncaging (300 ms) obstruiu a imagem de SBFI fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">favor clique aqui para uma versão maior dessa figura.</a>

Descreve-se a combinação de UV induzida por foto-ativação focal de compostos neuro-ativa com célula inteira patch-clamp e multi-fotão imagem de transientes de cálcio intracelular em dendritos e espinhas dos neurônios do hipocampo em fatias de tecido agudas do cérebro do rato.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

O objetivo geral deste procedimento é evocar e analisar a dinâmica do sódio em pequenos compartimentos celulares, como espinhas e dendritos de neurônios centrais no tecido intacto. Isso é feito preparando primeiro uma fatia aguda do hipocampo de camundongo, carregando um neurônio piramidal com o corante fluorescente sensível ao sódio SBFI por meio de uma pipeta de adesivo e visualizando a morfologia celular usando excitação multifóton. Os próximos passos são escolher um dendrito espinhoso para o experimento e injetar um composto fotoativado, como glutamato enjaulado, perto desse dendrito.Um flash UV é então aplicado ao glutamato desenjaulado de Foley usando um laser UV que foi posicionado com precisão para atingir um pequeno volume próximo ao dendrito de escolha. A etapa final é monitorar as mudanças resultantes na fluorescência do SBFI no dendrito e monitorar as mudanças resultantes no sódio nas espinhas adjacentes. As correntes de membrana que acompanham também são registradas.Em última análise, o uso de ferramentas farmacológicas apropriadas, como bloqueadores de receptores, permitirá o estudo dos mecanismos que geram os sinais de sódio intracelular evocados. Este método fornece uma ferramenta confiável para a investigação de sinais intracelulares de sódio em pequenos compartimentos celulares e em tecido cerebral intacto. Aqui, combinamos o grampo de remendo de células inteiras e a imagem de sódio multifotônica com um procedimento modificado para desenjaulamento induzido por luz UV.Com nos permite monitorar as respostas celulares em aplicações precisas e focais de compostos neuroativos. O procedimento será demonstrado por Karl KA e por Kaan Kleinhans, um estudante de pós-graduação em meu laboratório. Para iniciar a dissecção do tecido, coloque imediatamente o cérebro em uma placa de Petri com dissecção gelada, líquido cefalorraquidiano artificial ou LCR A e disseque um hemisfério realizando um corte sagital ao longo da linha média.Execute um segundo corte na orientação desejada como uma superfície de bloqueio. Em seguida, anexe-o ao estágio de corte de um vibram com super cola. Depois de retirar a câmara de corte e o elemento de resfriamento do vibram do freezer, coloque o corte stage com a seção do cérebro na câmara.Em seguida, coloque o elemento de resfriamento na câmara e mergulhe o tecido na dissecção gelada A CSF. Em seguida, corte com 250 micrômetros de espessura. Para fatias sagitais do hipocampo com um viome.Certifique-se de que os fluidos CS estejam borbulhando o tempo todo. Após o corte, manter o tecido em uma malha em um béquer com um LCR A normal e incubar a 34 graus Celsius por 30 minutos. Após a incubação, mantenha o tecido em temperatura ambiente.Este experimento deve ser executado em um ambiente escuro, mas é mostrado aqui sob condições de pouca luz para fins de filmagem. Para preparar o hardware primeiro, ligue os componentes do sistema multifóton e ajuste o alinhamento do feixe de laser infravermelho conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, ajuste o comprimento de onda do laser multifóton e a intensidade do feixe alterando as configurações da célula pcal e os fotomultiplicadores.Em seguida, ligue e calibre o sistema de desencaixotamento colocando uma lâmina de amostra fluorescente sob a lente objetiva. Inicie a rotina de calibração do software de controle da unidade de desencaixotamento. Defina o laser UV para vários pontos dentro de sua faixa de varredura enquanto a fluorescência é capturada com uma câmera CCD clicando no ponto do laser UV.Em cada ponto, ajuste o posicionamento dos espelhos de varredura galvânica para corresponder a uma determinada coordenada no software. O posicionamento preciso do ponto de desencaixotamento é obtido importando uma imagem do sistema de imagem por meio de uma conexão de rede entre computadores de desencaixotamento e de imagem. Usando o software de captura de tela, leia continuamente os quadros do software de imagem e ajuste a imagem.E, em quadros de gaiola, exporte de forma congruente cada 10º quadro do software de imagem como uma imagem de referência para a unidade de flash para garantir o ajuste adequado durante todo o experimento. Em seguida, ligue os componentes de eletrofisiologia dos micromanipuladores e o dispositivo de aplicação de pressão para entrega do composto enjaulado na região alvo. Puxe pipetas para grampo de remendo de célula inteira e profusão local usando capilares de vidro de boro silicato polido a fogo.Em seguida, coloque a fatia no banho experimental e para fixá-la com uma grade, coloque o banho no estágio de microscópio e perfunda permanentemente a fatia com A CSF. Comece o clampeamento do adesivo de células inteiras carregando a pipeta de adesivo com solução intracelular ou ICS contendo SBFI e, em seguida, carregue a pipeta de perfusão local com um composto enjaulado. Conecte as pipetas aos micromanipuladores correspondentes e coloque o eletrodo de referência no banho.Escolha uma célula piramidal CA com um soma localizado de 30 a 70 micrômetros abaixo da superfície da fatia para garantir a morfologia da célula intacta, bem como baixo espalhamento e atenuação do feixe de desenjaulamento. Aproxime-se desta célula com uma pipeta de remendo empregando microscopia de vídeo IR DIC. Aplique uma sucção suave até obter uma giga vedação.Compense a capacidade rápida. Em seguida, quebre a membrana e abra a célula para ganhar configuração celular. Finalmente, avalie a viabilidade celular no modo de pinça de corrente.Injete uma corrente despolarizante e verifique a atividade de pico resultante para realizar imagens e estimulação. Primeiro, adicione tetro DOIND a A CSF para evitar a ativação de canais de sódio dependentes de voltagem e geração de potenciais de ação. Visualize a morfologia celular usando excitação multifóton e fluorescência SBFI resultante.Escolha um dendrito espinhoso para o experimento. Aumente o zoom para imagens em uma resolução mais alta e coloque uma caixa de clipe ao redor do dendrito. Em seguida, coloque a pipeta com o composto enjaulado perto do dendrito.Posicione a pipeta para permitir uma perfusão local eficiente do dendrito de sua escolha. Ajuste o laser de desencaixotamento para posicionar o local de desencaixotamento próximo à estrutura de interesse. Em seguida, defina as regiões de interesse no dendrito escolhido e nas espinhas adjacentes usando um software de imagem.Aproxime-se da região de interesse e injete o composto enjaulado por vários segundos com remendo de partida de baixa pressão, clamp e registros de fluorescência através do sinal de disparo. Durante a profusão local do composto enjaulado, o feixe de excitação é completamente escurecido para evitar o branqueamento. Em seguida, pare a profusão local do composto enjaulado.Em seguida, aumente a intensidade do laser de dois fótons para permitir a excitação eficiente do SBFI e aplique um flash UV para inicializar no monitor de enjaulamento, as alterações na fluorescência do SBFI, bem como na corrente somática, interrompam a gravação após a fluorescência do SBFI ter se recuperado de volta à linha de base. Para obter a morfologia, registre uma pilha XY, Z da região da caixa de clipe definida para as medições realizadas. Certifique-se de que essa pilha seja superamostrada espacialmente para permitir a deconvolução ideal da imagem e aumentar a qualidade e a resolução da imagem.O carregamento de neurônios com SBFI através da pipeta de patch permitiu a visualização de toda a célula, incluindo dendritos finos e espinhos adjacentes, empregando excitação multifóton após perfusão local com glutamato enjaulado. A aplicação de um flash UV próximo a um dendrito resultou em uma diminuição transitória na emissão fluorescente de SBFI, refletindo um aumento na concentração intracelular de sódio. Ao mesmo tempo, uma corrente interna foi registrada na aplicação SOMA de um flash UV em fatias, que não haviam sido pré-perfundidas com glutamato enjaulado.Nunca provocou alterações na fluorescência SBFI nem nas correntes internas, indicando que esses sinais são devidos ao desenjaulamento do glutamato. As amplitudes de pico foram ligeiramente maiores nos espinhos próximos ao local de desenjaulamento, enquanto os padrões para espinhos adicionais se assemelhavam ao dendrito pai. A via para o influxo de sódio em dendritos e espinhas em resposta ao desenjaulamento do glutamato foi estudada usando bloqueadores seletivos para os receptores ionotrópicos de glutamato permeáveis ao sódio, sinais de sódio intracelular induzidos por glutamato e as correntes somáticas eliciadas foram omitidas na presença desses bloqueadores.Após a lavagem dos bloqueadores, os sinais são recuperados, demonstrando que o desenjaulamento do glutamato ativa os receptores citotrópicos de glutamato nos neurônios piramidais de ca um, resultando em transientes de sódio intracelular e correntes internas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de escolher a menor intensidade possível para o laser infravermelho para minimizar qualquer dano à preparação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão das etapas críticas de nossa abordagem experimental para estudar a sinalização de sódio em micro restos celulares Uma vez dominada, essa técnica permite imagens de alta resolução da atividade evocada sinais de íons intracelulares no tecido intacto, que está livre de artefatos de movimento introduzidos por outras técnicas.

multi-photon-intracellular-sodium-imaging-combined-with-uv-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Os procedimentos são descritos para realizar registros simultâneos do potencial ou corrente de membrana e alterações da concentração de cálcio intracelular. Os neurônios do núcleo supraquiasmático são preenchidos com o indicador de cálcio bis-fura-2 usando um eletrodo de patch clamp na configuração de patch clamp de célula inteira.

Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático

Aqui apresentamos técnicas para imagens de eventos locais de Ca2+ mediados por IP3 usando microscopia de fluorescência em células intactas de mamíferos carregadas com indicadores de Ca2+, juntamente com um algoritmo que automatiza a identificação e análise desses eventos.

Imagem local Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sinais em células de mamíferos em cultura

Aqui nós apresentamos um romance Ca 2+ -Imaging abordagem usando um repórter bioluminescente. Esta abordagem utiliza um GFP-aequorina constructo fundido que se liga a Ca 2+ e emite luz, eliminando a necessidade de excitação da luz. Significativamente este método permite imagem longa e contínua, o acesso a estruturas cerebrais profundas e alta resolução temporal.

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Apresentamos um método combinando dois fotões de imagem para gravar transientes de Ca2 + em dendritos neuronais em fatias cerebral aguda e gravações de células inteiras remendo-braçadeira.

Imagem de dois fotões cálcio em dendritos neuronais no cérebro fatias

Apresentamos um protocolo para avaliar o equilíbrio entre liberação de glutamato e liberação em sinapses glutamatergicas corticostriatais únicas em fatias agudas de camundongos adultos. Este protocolo usa o sensor fluorescente iGluu para detecção de glutamato, uma câmera sCMOS para aquisição de sinal e um dispositivo para iluminação a laser focal.

Indicadores únicos de sinapse de liberação de glutamato e absorção em fatias cerebrais agudas de ratos normais e huntington

Aqui apresentamos um protocolo para medir fluxos in vitro ca2+ em neurônios de cérebro médio e seus efeitos a jusante no caspase-3 usando culturas primárias de cérebro médio do rato. Este modelo pode ser empregado para estudar alterações fisiosiopatológicas relacionadas à atividade anormal do Ca2+ em neurônios do cérebro médio, e para tela de novas terapêuticas para propriedades anti-apoptóticas.

Quantificando fluxos espontâneos ca2+ e seus efeitos a jusante em neurônios midcérebros do rato primário

Este proctocol tem como objetivo fornecer um método para imagens in vitro e in vivo mitocondrial Ca2+ em astrócitos e neurônios.

Imagem Mitocondrial Ca2+ Absorção em Astrócitos e Neurônios usando Indicadores Ca2+ Codificados Geneticamente (GECIs)

Este protocolo descreve a exposição cirúrgica do gânglio da raiz dorsal (DRG) seguida de GCaMP3 (indicador Ca2+ codificado geneticamente; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Imagem de Ca2+ dos conjuntos neuronais usando camundongos Pirt-GCaMP3 enquanto se aplica uma variedade de estímulos na pata traseira ipsilateral.

In vivo Imagem com cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios intactos da raiz dorsal

Os métodos atuais descrevem uma abordagem não-ratiométrica para imagens subcompartimentais de cálcio de alta resolução in vivo em Caenorhabditis elegans usando indicadores de cálcio codificados geneticamente prontamente disponíveis.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECI) permitem uma análise robusta em nível populacional da sinalização de neurônios sensoriais. Aqui, desenvolvemos uma nova abordagem que permite a visualização in vivo do GECI da atividade dos neurônios dos gânglios trigeminais de ratos.

In-Vivo Imagem de cálcio de neurônios sensoriais no gânglio trigeminal de ratos

Este protocolo descreve imagens de cálcio GCaMP in vivo de neurônios intactos do gânglio do trigêmeo (TG). Esta descrição inclui cirurgia de exposição TG, imagem de microscopia confocal in vivo de neurônios TG, aplicação de estímulos somáticos durante imagens microscópicas de neurônios TG e análise de dados de imagem de cálcio GCaMP in vivo .

In vivo Imagem de cálcio de conjuntos neuronais em redes de neurônios sensoriais primários em gânglios trigêmeos intactos

Aprenda a analisar dinâmica de sódio em dendritos e espinhas de neurônios hipocampais usando imagem multiphoton e uncaging de glutamato por UV. Este método combina patch-clamp e técnicas ópticas para estudar sinalização neuronal em tecido intacto.

Multi-photon intracelular de sódio Imagem Combinado com mediada por UV uncaging focal de glutamato em neurônios piramidais CA1

Explorar mais vídeos