Name: Os ensaios toxicológicos para efeitos de teste de uma droga epigenética no desenvolvimento, fecundidade e sobrevivência das mosquitos de malária (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprenda ensaios toxicológicos com DZNep para avaliar desenvolvimento, fecundidade e sobrevivência de mosquitos da malária. Este método auxilia pesquisadores no controle de vetores.

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Agradecemos a Victor Marquez por fornecer DZNep.HCl e Scotty Bolling por fabricar os alimentadores de sangue. As cepas Mopti e SUA2La de An. gambiae foram obtidas do Centro de Recursos de Reagentes de Referência e Pesquisa da Malária (MR4). Este trabalho foi apoiado pelo Fralin Life Science Institute e pela doação do National Institutes of Health 1R21AI094289 para Igor V. Sharakhov.

NOTA: As três partes do protocolo de descrever a exposição aquosa do fármaco DZNep para mosquitos larvais, uma exposição à base de sangue de fêmeas adultas DZNep para estudar o seu efeito de fecundidade, e SAH hidrolase inibição por DZNep medida utilizando uma técnica colorimétrica simples. Uma representação esquemática destes ensaios é mostrado na Figura 1. 1. imaturos Mosquito Desenvolvimento e sobrevivência Ensaios NOTA: Esta seção explica o uso de uma droga solúvel em água, que afeta o desenvolvimento da larva do mosquito e sobrevivência. <ol><li> Escotilha A. gambiae ovos a 28 ° C em água destilada (dH2O) e larvas los para 2ª traseira. </li><li> Dê uma DNAse de seis poços, RNAse placa de cultura celular livre e despeje 10 ml dH2O a cada poço. </li><li> Selecione as larvas do mosquito em 2º instar e adicionar 15 larvas por poço. Antes de adicionar larvas 2º ao prato, put-los em uma toalha de papel para 2-3 segundos para remover o excesso de água. </li><li> Poços etiqueta com fitas de diferentes cores para embaralhar experimento. Rotular dois poços para cada concentração de teste em cada placa (Figura 2). </li><li> Prepara-se uma cloridrato DZNep 1 mM (PM = 298,73) solução de estoque de 0,3 mg por dissolução DZNep em 1 ml de dH 2 O. Adicionar solução de estoque de DZNep.HCl a poços marcados para atingir uma concentração final de 0,5 uM e 5,0 uM. NOTA: A solução-mãe pode ser armazenado a 4 ° C durante curto prazo (1 dia a um mês) ou -20 ° C para o longo prazo (mais de um mês). NOTA: A adição da solução de estoque para concentrações acima mencionadas não irá alterar o volume de água nos poços significativamente. No entanto, no caso de concentrações muito mais elevadas, é aconselhável dissolver o composto no meio das larvas para evitar qualquer diluição desnecessária do composto. </li><li> Adicionar a mesma quantidade de ração de peixe a cada poço. Cobrir a placas e incubar a 28 ° C em uma incubadora. </li><li> Grave a mortalidade para os mosquitos larvais DZNep-tratados e não tratados, após um período de exposição de 24 horas. Retire e elimine qualquer larvas mortas. Repita esta gravação todos os dias até todas as larvas morrem ou pupa e emergem como adultos. Grave o tamanho das larvas de dois em dois dias, isto é, dias 0, 2, 4, 6, 8, até que eles formam ninfas. </li><li> Analisar o desenvolvimento e mortalidade de larvas de dados utilizando um software de análise estatística adequada. NOTA: Um gráfico de barras pode ser usado para representar os dados de mortalidade no Microsoft Excel. Análise de Variância Multivariada (MANOVA) realizada com um software como o JMP ou SPSS irá revelar se diferentes doses do medicamento resultar em valores diferentes de sobrevivência de larvas de mosquitos. </li></ol> 2. Fecundidade Assay pela administração de drogas por meio Feeder Artificial para fêmeas mosquitos NOTA: Esta seção detalha a adição da droga para o sangue de umnd alimentando-a mosquitos fêmeas adultas usando um sistema de alimentação artificial. <ol><li> Configure gaiolas adulta do mosquito, com igual número de mosquitos machos e fêmeas para controle e gaiola de teste. Fornecer solução de açúcar 10% embebido em bolas de algodão para ambas as gaiolas até as fêmeas estão prontas para a alimentação (3-5 dias é ideal para Anopheles gambiae). </li><li> 2 horas antes da alimentação de sangue, retire as bolas de algodão para garantir as fêmeas estão com fome. </li><li> Montar dois alimentadores sanguíneos artificiais que consistem de uma ampla funil invertido com fundo de vidro (diâmetro = 50 mm, comprimento = 70 mm) e um plástico circundante selada com cola industrial. Anexar tubos de plástico (diâmetro = 7 mm) para duas saídas &#39;alimentadores (diâmetro = 10 mm) através de conectores para entrada e saída de água. Rotular os dois alimentadores como &quot;Control&quot; e &quot;5 mM DZNep.&quot; </li><li> Usando um elemento de aquecimento comercialmente disponíveis, configurar o programa para a alimentação. Em &quot;Menu&quot; vá em &quot;Settings&quot;e selecione &quot;setpoints&quot;; programas pré-carregados aparecerá. Selecione &quot;SP1&quot; e ajustar a temperatura para 37 ° C. NOTA: O elemento de aquecimento assegura que o sangue administrado é mantida a uma temperatura constante. Configurações adicionais do programa pode ser usado para diferentes espécies de mosquitos ou de insecto. </li><li> Encha um balde com água e mergulhe o elemento de aquecimento na água. </li><li> Corte um pedaço quadrado de Parafilm (50 mm x 50 mm) e esticá-la para fazer um filme membranoso fina. Cubra o fundo dos alimentadores artificiais com o Parafilm. Corte outro pedaço de Parafilm (50 mm x 10 mm), esticá-lo e selar as arestas dos alimentadores. </li><li> Montar o sistema, que liga os alimentadores e elemento de aquecimento por os tubos. Depois de concluído, ligar o sistema e selecione &quot;SP1&quot;. Pressione &quot;Enter&quot; para iniciar o sistema. NOTA: A água vai ficar aquecido a 37 ° C e mantida a essa temperatura. </li><li> Monitorar the temperatura de água usando um termômetro no balde com água. NOTA: Os conectores de tubos e ajudar a manter um constante circulação de água através do sistema de modo que a temperatura do sangue continua a 37 ° C. </li><li> Encha uma bandeja de fundo plano com uma solução de água sanitária a 10% que será utilizado para descontaminar todos os derramamentos de sangue. </li><li> Adicionar 2 ml de sangue de ovelha desfibrilado a um tubo de microcentrífuga. Rotular isso como &quot;Control&quot;. Repetir o processo experimental para o tubo rotulado como &quot;5 uM DZNep&quot; .Add 6 uL de solução de estoque DZNep (ver passo 1.5) para o tubo experimental marcado &quot;5 uM DZNep&quot; Misturar suavemente o sangue e droga invertendo diversas vezes. Incubar o tubo 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Usando uma pipeta, adicionar 2 ml de sangue de teste e de controlo para o topo de alimentadores correspondentemente marcados. Descartar a pipeta na solução de água sanitária. Cobrir a gaiola com um saco escuro e respirar ar na gaiola periodicamente para incentivar females para a alimentação. </li><li> Deixe os mosquitos se alimentam por cerca de 30 min. Uma vez que a alimentação estiver concluída, desligue o elemento de aquecimento, tomar as alimentadores fora e tira o Parafilm. Mergulhe o alimentador em solução de água sanitária por cerca de 5 minutos e enxágüe bem em água deionizada. </li><li> Retire os alimentadores e colocar bolas de algodão com água com açúcar nas gaiolas durante 48 horas. Coloque um ovo prato contendo água e papel de filtro nas gaiolas durante a noite para facilitar a colocação de ovo. Escreva em cada ovo prato com a respectiva concentração de teste ou controle. </li><li> Retire o ovo prato dia seguinte e examinar o número ea estrutura dos ovos sob um microscópio estéreo. Obter imagens utilizando o software Q-colors5. Contar o número de ovos. Analise diferença no número de ovos obtidos a partir de gaiolas de teste e de controlo. NOTA: Um teste t não emparelhado pode ser usado para determinar se o número de ovos são significativamente diferentes (p ≤0.05). </li></ol> 3. Bioquímica Ensaio de Inibição da Enzima Mosquitopor droga NOTA: Esta seção descreve um ensaio de atividade enzimática utilizando DTNB como um indicador para determinar o efeito da DZNep em SAH inibição hidrolases no homem adulto e mosquitos fêmeas. <ol><li> Prepara-se uma solução 0,1 M de Na 2 HPO 4 (fosfato de sódio dibásico), adicionando 14,19 g de Na 2 HPO 4 para 1 L de dH2O Em seguida, preparar uma solução 0,1 M NaH 2 PO 4 (fosfato sódio monobásico) pela adição de 13,79 g de NaH 2 PO 4 a 1 L de dH2O </li><li> Titula-se o M de Na 2 HPO 4 solução a 0,1 com a solução de 4 0,1 M NaH 2 PO a pH 8,5. NOTA: Esta será a solução estoque de trabalho de 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Prepara-se uma solução de homogeneização de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5) por adição de 0,3% de Triton X-100. Nota: A solução de homogeneização pode ser armazenado a 4 o C. </li><li> Prepare uma solução de HAS 1,6 mM (PM = 384,4) dissolvendo 6,15 mg de HAS em 10 ml de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Prepara-se uma solução 1,6 mM de DTNB (PM = 396,4) por dissolução de 6,3 mg de DTNB em 10 ml de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Manter a solução DTNB fresco no gelo até o uso. </li><li> Prepara-se uma DZNep.HCl 1 mM (PM = 298,73) em solução através da dissolução de 0,3 mg de DZNep em 1 ml de dH 2 O. Em seguida, dilui-se a solução 1 mM em DZNep uma série de concentrações de 1,000 uM a 0,002 uM em dH 2 O. </li><li> Para medir a inibição da SAH-hidrolase por DZNep, preparar um extracto de enzima em bruto de mosquitos: Homogeneizar a 10 mosquitos adultos não alimentados com sangue em 1 ml de gelo-frio 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), contendo 0,3% de Triton X- 100, usando um homogeneizador de tecidos de vidro. Transferir o homogeneizado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Centrifuga-se o homogenado durante 5 min a 10.000 xg, a 4 ° C. Transfira o sobrenadante para um ambiente limpoTubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Utilizar o sobrenadante como fonte de enzima para o ensaio bioquímico HAS. </li><li> Para o tratamento em branco (isto é, não DZNep, sem enzima), adicionar 50 ul HAS 1,6 mM, 50 ul de DTNB 1,6 mM, e 100 ul de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5) aos poços individuais de uma de 96 poços, microplaca fundo plano. </li><li> Para o controlo (ou seja, não DZNep), adicionar 50 ul HAS 1,6 mM, 50 ul de DTNB 1,6 mM, 50 ul de 0,1 M de Na 2 HPO 4 (pH 8,5) e 50 ul de enzima (SAH-hidrolase obtido a partir de extracto em bruto) para o indivíduo poços. </li><li> Para tratamentos DZNep, adicionar 50 ul HAS 1,6 mM, 50 ul de DTNB 1,6 mM, 50 ul de enzima e 50 ul seleccionado concentração DZNep para poços individuais. Prepare 4 repetições por tratamento e controle. </li><li> Leia a densidade óptica (DO) das amostras de enzima SAH a 405 nm durante 5 minutos a intervalos de 20 seg utilizando um leitor de microplacas de 96 poços. </li><li> Subtrair o OD em branco de um controlend tratamento OD obtido a partir de cada poço. Calcular a percentagem restante actividade de hidrolase SAH utilizando a seguinte equação:% Actividade Residual = (OD Tratamento / Controlo OD) x 100. </li></ol>

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Os autores não têm nada a divulgar.

Há vários passos vitais para o sucesso da aplicação deste protocolo. Para o ensaio larval, deve ser tomado cuidado para rotular e replicar cada concentração de ensaio corretamente. Randomizing amostras de ensaio e adicionar a quantidade designada de droga para as respectivas cavidades de teste é uma parte importante desta montagem experimental. Antes de adicionar 2 nd larvas de mosquito para a microplaca de 96 poços, cada larva pode ser colocado sobre uma toalha de papel para 2-3 segundos para remover o exces...

A malária é responsável pelo maior número de mortes relacionadas com o inseto no mundo. Estima-se que 219 milhões de casos ocorrem anualmente em todo o mundo, resultando em cerca de 660 mil mortes, principalmente na África 1. Apesar dos esforços concertados, os programas da malária enfrentam vários desafios. Enquanto insecticidas tratados com inseticidas e componentes-chave forma pulverização residual interna do programa, a resistência a inseticidas em populações locais impedem esses esforços 2. O rápido aumento da população de mosquitos resistentes inseticida é largamente atribuído à capacidade de os mosquitos da malária para se adaptar rapidamente às mudanças no seu ambiente e explorar diferentes nichos 3,4,5. Para superar os mecanismos existentes de resistência a inseticidas, a exploração de alvos inseticida compostos novos e de última geração se justifica. Um protocolo simples, passo-a-passo para determinar a eficácia de insecticidas experimentais sobre as diversas fases da vida de malária mosquitoes aumentaria significativamente esses esforços. Os estudos farmacológicos de efeitos de drogas em linhagens de células e modelos animais têm estabelecido o uso de drogas epigenéticas como uma ferramenta útil para a modulação da genética e fisiologia das células e organismos. A metilação do DNA e a modificação da histona são dois mecanismos que afectam epigenética expressão de genes em organismos multicelulares sem alterar a sequência de ADN subjacente 6. Modificações pós traducionais como a metilação desempenham um papel crucial na manutenção da integridade celular e expressão gênica, e pode afetar vários processos fundamentais 7,8,9. Pesquisa em algumas espécies de insetos têm destacado a importância da epigenética nos processos que envolvem oogenesis e haste manutenção de células 10, bem como a compensação de dosagem 11. No entanto, tais aspectos em vetores de doenças estão ainda a ser explorado. Usando um composto para modular o sistema em mosquitos pode nos fornecer emvistas para as novas vias alvo inseticida. 3-Uma Deazaneplanocin (DZNep) é um inibidor de histona-metilação conhecidas, que têm um impacto em vários tipos de cancros têm sido estudados 12,13,14,15,16. DZNep é uma droga solúvel em água estável que epigenética indirectamente inibe a histona-lisina N -metiltransferase (EZH2), um componente do complexo repressor Polycomb 2 (PRC2) em células de mamíferos. PRC2 desempenha um papel importante na regulação do crescimento das células estaminais em organismos multicelulares, e histona metilação é um aspecto chave do silenciamento de genes mediado PRC2. Em ratinhos imunocomprometidos, as células pré-tratadas com DZNep têm demonstrado ser menos 17 tumorigénico. Esta droga está sendo usada para o estudo de outras doenças, como a doença hepática gordurosa não alcoólica, em que está implicado EZH2 18. DZNep é uma S -adenosylhomocysteine ​​estabelecido (SAH) inibidor hydrolase 19, 20. A inibição da SAH-hidrolase numaacumulação de HAS e, por sua vez, leva à inibição da actividade da metiltransferase, limitando os grupos de doadores de metilo disponíveis. HAS é um derivado de aminoácido utilizado por muitos organismos, incluindo insectos, nas suas vias metabólicas. Um estudo recente mostrou que DZNep em doses baixas podem afetar diapausa e retardar o desenvolvimento dos insetos 21. Aqui, um protocolo robusto para investigar os efeitos de um composto solúvel em água em vários estágios de vida de mosquitos é desenvolvido. As três partes deste protocolo incluem instruções para examinar os efeitos de um composto solúvel em água na imaturos, fêmeas se alimentam de sangue de adultos, e atividade enzimática do adulto masculino e mosquitos fêmeas. Em primeiro lugar, DZNep é dissolvido em água para estudar o desenvolvimento e sobrevivência de mosquitos imaturos. Isto é realizado em duas concentrações de comparar as diferenças decorrentes de aumento de 10 vezes na exposição de drogas. Para explorar o efeito da droga em adultos mosquitos fêmeas, DZNepé adicionado ao sangue de carneiro desfibrilado e alimentados artificialmente o sangue para o sexo feminino. Subsequentemente, a solução do fármaco na fecundidade é examinada. Finalmente, um ensaio de actividade de enzima é realizado utilizando 5,5&#39;-ditiobis- (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) como um indicador para determinar o efeito de inibição DZNep em HAS hidrolase em adultos, machos e fêmeas de mosquitos. Embora este protocolo é desenvolvida com um mosquito da malária, Anopheles gambiae, ele pode ser facilmente adaptado para estudar os efeitos de compostos de interesse em quaisquer espécies de mosquitos ou outros insectos. As técnicas descritas neste protocolo não pode ser eficientemente aplicada a uma droga com pouca ou nenhuma solubilidade em água ou em meio aquoso.

<table><tbody><tr><td>Microplaca de 96 poços</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565561</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall Fresco</td><td>76003758</td><td>Uma centrífuga diferente pode ser usada</td></tr><tr><td>Rolos de fita colorida</td><td>Fisher</td><td>S68134</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecção</td><td>Olympus</td><td>SZ</td><td></td></tr><tr><td>DTNB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>DZNep.HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SMLO305</td><td></td></tr><tr><td>Copos para pratos de</td><td></td><td></td><td></td>ovos</tr><tr><td>Papéis de filtro</td><td>Fisher</td><td>09-795E</td><td></td></tr><tr><td>Alimentadores de vidro</td><td>Virginia Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador</td><td></td><td></td><td></td>de tecidos de vidro</tr><tr><td>Elemento de aquecimento</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0520091</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Percival scientific</td><td>I36VLC8</td><td>Uma incubadora diferente pode ser usada</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga, 2&nbsp; ml</td><td>Axygen</td><td>22-283</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Microcentrífuga, 1.5&nbsp; ml</td><td>Micropipeta Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.069</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-3154</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4Medidor de</td> pH <td>Fisher Scientific</td><td>M-8643</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Mettler Toledo 7easy</td><td>S20</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>Spectramax</td><td>M2</td><td></td></tr><tr><td>SAH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9384</td><td>loja em -20 &#176; C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

os ensaios toxicológicos para efeitos de teste de uma droga epigenética no desenvolvimento, fecundidade e sobrevivência das mosquitos de malária

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Resistência inseticida representa um grande problema para os programas de controle da malária. Os mosquitos se adaptar a uma vasta gama de alterações no ambiente rapidamente, tornando a malária controlar um problema omnipresente em países tropicais. O aparecimento de populações resistentes inseticida garante a exploração de novas vias alvo de drogas e compostos para o controle do vetor mosquito. Drogas epigenéticas estão bem estabelecidos na pesquisa do câncer, no entanto, não se sabe muito sobre os seus efeitos sobre os insetos. Este estudo fornece um protocolo simples para examinar os efeitos toxicológicos de 3 Deazaneplanocin A (DZNep), uma droga experimental epigenética para terapia de câncer, no vetor da malária, o Anopheles gambiae. Foi observado um aumento dependente da concentração na mortalidade e diminuem de tamanho em mosquitos imaturos expostos a DZNep, enquanto que o composto diminuiu a fecundidade de mosquitos adultos em relação a tratamentos de controle. Além disso, houve uma diminuição dependente da droga em S -adenosilhomocisteína (SAH) hidrolase em mosquitos actividade após exposição a DZNep tratamentos em relação ao controlo. Estes protocolos fornecem o pesquisador com um procedimento simples, passo-a-passo para avaliar vários parâmetros toxicológicos para uma droga experimental e, por sua vez, demonstrar uma abordagem multifacetada única para explorar os efeitos toxicológicos de drogas ou compostos de epigenéticos solúveis em água interesse contra mosquitos vetores e outros insetos.

A Figura 1 é uma representação esquemática dos ensaios; que descreve os vários passos do processo listadas neste artigo. À medida que o protocolo baseia-se em diferentes fases da vida dos mosquitos, não existe uma sequência particular a ser seguido para as experiências aqui detalhadas. O utilizador pode escolher para conduzir um ou mais ensaios, ao mesmo tempo, dependendo da disponibilidade de amostras. A Figura 2 demonstra o prato criado para o desen...

Um protocolo é desenvolvido para examinar os efeitos de um medicamento epigenético DZNep no desenvolvimento, fecundidade e sobrevivência de mosquitos. Aqui descrevemos procedimentos para a exposição aquosa de DZNep a mosquitos imaturos e uma exposição sanguínea de DZNep a mosquitos adultos, além de medir a inibição da SAH hidrolase.

Os ensaios toxicológicos para efeitos de teste de uma droga epigenética no desenvolvimento, fecundidade e sobrevivência das mosquitos de malária

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

O objetivo geral do experimento a seguir é examinar os efeitos de uma droga epigenética em vários estágios da vida dos mosquitos da malária. Isso é conseguido dissolvendo a droga no habitat dos mosquitos imaturos para determinar seus efeitos nas larvas, sobrevivência e tamanho do corpo. A droga também é adicionada ao sangue de mamíferos e fornecida a mosquitos fêmeas adultas, que testarão o efeito da droga na reprodução.Finalmente, um ensaio enzimático é realizado para testar a inibição da enzima do mosquito pela droga. Os resultados mostram os efeitos das alterações epigenéticas na sobrevivência do mosquito da malária e para Conti com base na análise de bioensaio, tivemos a ideia para este protocolo. Quando aprendemos sobre o dine sendo desenvolvido como uma droga epigenética anticâncer promissora, essa droga induz a morte apoptótica em células cancerígenas humanas como um mecanismo de modificação histológica são animais hormonais conservados, nós meio que saboreamos como um aplicativo de efeito no mosquito da malária.Para começar, selecione as larvas do mosquito Novelis Gambi na segunda estrela e coloque-as em uma toalha de papel por dois a três segundos para remover o excesso de água. Em seguida, adicione delicadamente 15 larvas por poço de uma placa de cultura de células livres de nuclease de seis poços contendo 10 litros de água destilada por poço. Rotule os poços com fitas codificadas por cores para randomizar o experimento.Em seguida, rotule dois alvéolos por concentração de teste em cada placa. Em seguida, prepare uma solução estoque de cloridrato de NEP deasy de um milimolar dissolvendo 0,3 miligramas de deasy nep. Em um mililitro de água destilada, adicione a solução estoque de cloridrato de Z NEP aos poços marcados para atingir uma concentração final de 0,5 micromolar e 5,0 micromolar.A adição da solução estoque para as concentrações acima mencionadas não alterará significativamente o volume de água no poço. No entanto, no caso de concentrações muito mais altas, é aconselhável dissolver o composto no meio da larva para evitar qualquer diluição desnecessária do composto. Após a adição do composto, alimente-se e incube as larvas por 24 horas a 28 graus Celsius.Em seguida, registre a mortalidade dos mosquitos larvais tratados e não tratados com DZ NEP. Repetindo esta gravação todos os dias até que todas as larvas morram ou se transformem em pupas e surjam. Quando adultos, remova e descarte todas as larvas mortas todos os dias.Além disso, registre o tamanho das larvas a cada dois dias até que elas se preparem para realizar o ensaio de fecundidade. Primeiro, monte o sistema de alimentador artificial conectando os alimentadores e o elemento de aquecimento pelos tubos. Depois de concluído, ligue o sistema e selecione SP um.Pressione enter para iniciar o sistema. Monitore a temperatura da água usando um termômetro digital no sistema de aquecimento. Os conectores e tubos ajudam a manter uma circulação constante de água através do sistema, de modo que a temperatura do sangue permanece.A 37 graus Celsius. Encha uma bandeja de fundo plano com solução de alvejante a 10% que será usada para descontaminar qualquer derramamento de sangue. Em seguida, adicione dois mililitros de sangue de ovelha desfibrilado a um tubo de microcentrífuga e rotule como controle.Repita o processo para o tubo experimental rotulado como cinco micromolares DZ nep. Em seguida, adicione seis microlitros de solução estoque DZ NEP ao tubo experimental rotulado com cinco DZ nep micromolares. Misture suavemente o sangue e o medicamento, invertendo-o várias vezes antes de incubar o tubo por 10 minutos em temperatura ambiente.Usando uma pipeta, adicione dois mililitros de controle e teste de sangue na parte superior dos alimentadores rotulados correspondentemente. Descarte a pipeta na solução de alvejante. Respire ar na gaiola periodicamente para incentivar as fêmeas a se alimentarem.Cubra a gaiola com um saco escuro. Deixe os mosquitos se alimentarem por aproximadamente 30 minutos. Quando a alimentação estiver concluída, desligue o elemento de aquecimento.Retire os alimentadores e retire o filme para depois de embeber o alimentador e a solução de alvejante por cinco minutos. Enxágüe bem em água deionizada. Em seguida, coloque bolas de algodão com água com açúcar nas gaiolas por 48 horas.Coloque pratos de ovos rotulados com a respectiva concentração de teste ou controle que contenham água e papel de filtro nas gaiolas durante a noite. Para facilitar a postura dos ovos, remova o prato de ovos no dia seguinte e examine o número e a estrutura dos ovos em um microscópio estereoscópico. Obtendo imagens, contando o número de ovos e analisando a diferença no número de ovos obtidos das gaiolas teste e controle.Esta parte do vídeo mostra um ensaio de atividade enzimática usando DTNB como um indicador para determinar o efeito de dz NEP na inibição de SAH Hydro Lace em mosquitos adultos. Para medir a inibição do SAH Hydro Lace por DZ nep, prepare o extrato enzimático acumulado de mosquitos homogeneizados 10 mosquitos adultos não alimentados com sangue em um mililitro de fosfato de sódio monobásico mono molar gelado de 0,1 molar contendo 0,3% tritton X 100. Usando um homogeneizador de tecido de vidro, transfira o homogeneizado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.Depois de centrifugar o homogenato durante cinco minutos a 10 000 g e a quatro graus Celsius, transferir o supinato para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mililitros. Use o supinato como fonte enzimática para o ensaio bioquímico de HSA. Para o branco, adicione 50 microlitros de SAH, 50 microlitros de DTNB e 100 microlitros de fosfato de sódio diba para fazer uma mistura principal e adicione aos poços individuais de uma microplaca de fundo plano de 96 poços.Em seguida, para o controle, adicione 50 microlitros de SAH, 50 microlitros de DTNB, 50 microlitros de fosfato de sódio diba e 50 microlitros de enzima hidro renda SAH aos poços individuais. Finalmente, para tratamentos DZ NEP, adicione 50 microlitros de SAH, 50 microlitros de DTNB, 50 microlitros de enzima e 50 microlitros da concentração DZ NEP selecionada aos poços individuais. Prepare-se para réplicas por tratamento e controle.Leia a densidade óptica ou OD das amostras da enzima SAH a 405 nanômetros por cinco minutos em intervalos de 22 usando um leitor de microplacas de 96 poços. Por fim, subtraia a DO em branco da DO de controle e tratamento obtida de cada poço e calcule a porcentagem restante da atividade hidrolética da HAS Usando a equação encontrada no protocolo de texto, esses resultados demonstram que a droga epigenética DZ NEP suprime o crescimento e o desenvolvimento e induz a mortalidade em mosquitos imaturos. A maioria dos mosquitos expostos a 0,5 micromolar morreu no dia 10 do experimento, enquanto um grande número de mosquitos expostos a cinco micromolares morreu no dia oito.Em contraste, a mortalidade dos mosquitos no tratamento de controle permaneceu inalterada e vários emergiram como adultos no oitavo dia do experimento. O efeito do DZ NEP na fecundidade do mosquito é ilustrado aqui. Mosquitos fêmeas adultas alimentadas com sangue contendo DZ NEP exibiram uma redução significativa no número de ovos viáveis quando comparados ao controle.Um grande número de ovos obtidos da gaiola de teste era de cor mais escura e não tinha flutuadores e conjuntos semelhantes a rosetas quando comparados com ovos obtidos de mosquitos fêmeas alimentadas com sangue normal. A ausência de flutuadores junto com ovos de cor mais escura indica o papel potencial da epigenética na formação de exo corion. O efeito da DZ NEP na atividade de hidro renda SAH em mosquitos adultos machos e fêmeas da malária é demonstrado aqui.Uma diminuição dependente de DZ NE em OD é observada para cada tratamento medicamentoso em comparação com o tratamento controle, indicando que dz NP inibe a atividade hidrolaço de SAH após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia vetorial explorarem os efeitos das drogas epigenéticas no mosquito da malária.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nesta entrevista, George Dimopoulos enfoca os mecanismos fisiológicos utilizados pelos mosquitos para combater o Plasmodium falciparum e infecções por vírus dengue. Explicação é dada de como principais genes refratários, os genes que conferem resistência a patógenos vetor, são identificados no mosquito e como este conhecimento pode ser usado para gerar mosquitos transgênicos que são incapazes de transportar o parasita da malária ou dengue.

Construção de uma melhor Mosquito: identificar os genes habilitação Malária e Dengue Febre Resistência em A. gambiae e A. aegypti mosquitos

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de teste tópico para determinar a toxicidade de um potencial inseticida em mosquitos fêmeas adultas. Usando um antagonista do receptor de dopamina que causa inibição letal da neurotransmissão em mosquitos, este método descreve uma maneira de avaliar os efeitos tóxicos dos inseticidas na aplicação tópica.

Ensaio de teste tópico: uma técnica para avaliar o potencial inseticida de antagonistas do receptor de dopamina em mosquitos fêmeas adultas por aplicação tópica

Este vídeo demonstra um ensaio de alimentação sanguínea para avaliar a mortalidade e a fecundidade de compostos de teste com novos modos de ação em mosquitos fêmeas. Essa técnica ajuda na triagem de novas classes de inseticidas para matar a população resistente de mosquitos e controlar a propagação de doenças.

Ensaio de alimentação de mosquitos: um método para avaliar os efeitos dos compostos de teste na mortalidade e fecundidade de mosquitos fêmeas adultas

Devido às semelhanças marcantes do ciclo de vida e biologia de parasitas da malária de roedores para parasitas da malária humana, modelos de malária de roedores tornaram-se indispensáveis para a pesquisa da malária. Neste documento, padronizamos algumas das técnicas mais importantes utilizadas na análise fenotípica de espécies selvagens e transgênicas de malária por roedores.

Análise fenotípica de roedores malária parasita assexuada e estágios do sangue sexual e estágios do mosquito

Os protocolos são descritos para avaliar a toxicidade de produtos químicos para mosquitos imaturos e adultos para o desenvolvimento como novas classes de larvicidas, adulticides e Endectocidas. Os protocolos permitem o elevado-throughput teste de químicas múltiplas na dose de ponto único e posterior avaliação através do ensaio de resposta de dose para determinar a toxicidade em contato ou ingestão.

Protocolos para testar a toxicidade de romance químicas inseticidas para mosquitos

Descrito é um método de economia de tempo e espaço para contar ovos e determinar as taxas de escotilha de mosquitos individuais usando 24 placas de cultura de tecido de poço, o que pode aumentar substancialmente a escala e a velocidade dos ensaios de fecundidade e fertilidade.

Ensaio melhorado de fecundidade e fertilidade para a Aedes aegypti usando 24 placas de cultura de tecido poço (placas EAgaL)

Descrevemos a metodologia e a importância do bioensaio de aplicação tópica para medir a suscetibilidade de inseticidas em mosquitos e moscas frutíferas. O ensaio apresentado é de alto rendimento, utiliza massa de insetos - permitindo assim calcular uma dose letal relativizada em massa em vez de concentração - e provavelmente tem menor variabilidade do que outros métodos semelhantes.

Bioensaio de aplicação tópico para quantificar toxicidade de inseticida para mosquitos e moscas de frutas

O ensaio padrão de alimentação de membrana (SMFA) é considerado como o padrão-ouro para a avaliação e identificação de potenciais compostos antimaláricos. Este sistema de alimentação artificial é usado para infectar mosquitos para avaliar ainda mais os efeitos desses compostos na intensidade e prevalência do parasita Plasmodium falciparum .

Ensaio padrão de alimentação de membrana para a detecção de infecção por plasmodium falciparum em Vetores de Mosquito Anopheles

Dada a sua anatomia simples, os testículos de Anopheles oferecem um bom modelo citológico para o estudo da espermatogênese. Este protocolo descreve a hibridização in situ por fluorescência total, uma técnica utilizada para investigar esse processo biológico, bem como o fenótipo de cepas transgênicas que abrigam mutações nos genes envolvidos na produção de espermatozoides.

Hibridação in situ por fluorescência de montagem total para estudo da espermatogênese no mosquito Anopheles

A genética química envolve a substituição de um resíduo de gatekeeper por um aminoácido contendo uma cadeia lateral diferente no locus alvo. Aqui, geramos um parasita mutante contendo um alelo hipomórfico de cdpk1 e identificamos vias compensatórias adotadas pelo parasita no fundo mutante.

Compreendendo o desenvolvimento de vias compensatórias em um parasita mutante da malária que abriga alelo hipomórfico de quinases semelhantes a plantas

O desenvolvimento sexual do Plasmodium ocorre no intestino médio do mosquito. Direcionar os estágios sexuais do parasita é uma estratégia promissora para bloquear a transmissão. Desenvolvemos o Ookluc, um P. berghei transgênico que expressa nanoluciferase após a formação do zigoto, permitindo a triagem de alto rendimento de compostos bloqueadores de transmissão. Este artigo detalha os métodos de triagem usando o Ookluc.

Ookluc: Uma linha de Plasmodium berghei para identificar compostos bloqueadores de transmissão

Aprenda ensaios toxicológicos com DZNep para avaliar desenvolvimento, fecundidade e sobrevivência de mosquitos da malária. Este método auxilia pesquisadores no controle de vetores.

Os ensaios toxicológicos para efeitos de teste de uma droga epigenética no desenvolvimento, fecundidade e sobrevivência das mosquitos de malária (Vídeo) | JoVE Journal

Os ensaios toxicológicos para efeitos de teste de uma droga epigenética no desenvolvimento, fecundidade e sobrevivência das mosquitos de malária

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