Expressão de proteínas fluorescentes em Branchiostoma lanceolatum Por injecção de mRNA em oócitos não fertilizados

O objetivo geral deste procedimento é introduzir mRNA, codificando uma proteína fluorescente em oócitos de bronchos estoma lancia latam para permitir imagens fluorescentes in vivo de embriões em desenvolvimento. Isso é feito primeiro induzindo a desova de amfiais, machos e fêmeas maduros por um choque de temperatura de 24 horas. Após o choque de temperatura, fêmeas e machos são colocados em copos de desova individuais, permitindo a coleta de oócitos e espermatozoides, respectivamente.

Uma vez que os citos estão alinhados em um prato revestido de polilisina, uma agulha de microinjeção especialmente preparada é usada para injetar a solução dentro do núcleo do cito. A etapa final é a fertilização do cite com uma a cinco gotas de esperma. Em última análise, varredura a laser de dois fótons.

A microscopia é usada para mostrar a expressão ubíqua das proteínas fluorescentes produzidas a partir do mRNA microinjetado. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de microinjeção são difíceis de aprender devido às habilidades técnicas necessárias que são impossíveis de detalhar e cobrir na impressão. Para começar, prepare os pratos revestidos de polilisina usados para imobilizar os citos durante a injeção.

Para cada placa de Petri de cultura de células de 35 milímetros, cubra o fundo com solução de polilisina e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, transfira a solução de polilisina para outro prato e incube novamente em temperatura ambiente por cinco minutos. Descarte a solução e deixe as placas de Petri secarem de cabeça para baixo em temperatura ambiente por duas horas.

Quando estiver seco, armazene os pratos revestidos embrulhados em filme plástico a quatro graus Celsius por até uma semana. Para preparar os pratos revestidos de aros usados para cultivar embriões injetados, faça água do mar artificial e água de osmose reversa. Em seguida, dissolva o aros a uma concentração de 1% em um SW filtrado e despeje rapidamente a solução de aros quente de uma placa de Petri em outra para garantir uma camada de aros muito fina da placa.

Embrulhe os pratos revestidos em filme plástico Saran e guarde a quatro graus Celsius por até uma semana. Primeiro, prepare a mistura de injeção em RNAs e fenol de água livre de DNA. O vermelho colore a solução e permite a identificação de embriões injetados com sucesso.

Em seguida, centrifugue a mistura para pellet os cristais e mantenha no gelo até a hora de usar. Quando estiver pronto, carregue uma pipeta de 10 microlitros com 0,5 microlitros da mistura de injeção, evitando o fundo do tubo onde os cristais foram peletizados. Preencha a agulha de injeção pipetando a gota de 0,5 microlitro de injeção.

Misture na abertura grande da agulha. Prepare duas agulhas para o caso de uma quebrar durante a injeção. Guarde as agulhas num frasco com água no fundo para evitar a evaporação da injeção.

Misture e coloque a quatro graus Celsius. Deixe a mistura de injeção viajar lentamente até a ponta da agulha de injeção por pelo menos uma hora para minimizar a criação de bolhas. Para iniciar a coleta de oócitos e espermatozoides, machos e fêmeas são eletrocutados em um SW por 24 horas e depois transferidos para copos individuais uma a duas horas antes da desova.

Após a desova, colete imediatamente esperma e citos. Tome cuidado para não assustar os adultos durante a coleta. Movimentos adicionais podem se dissipar e, portanto, diluir espermatozoides e citos após a coleta.

Mantenha o esperma no gelo em um tubo de 1,5 mililitro e transfira os citos em um SW filtrado para placas de Petri pré-enxaguadas. Transfira de 100 a 500 citos para outra placa de Petri de 35 milímetros para realizar as injeções. Por fim, fertilize o restante da ninhada de citos como um controle para a qualidade do esperma e do cite ou para outros experimentos.

Para iniciar o procedimento de injeção, instale a agulha no micromanipulador em um ângulo de 50 graus em relação ao plano horizontal sob um escopo de dissecação fluorescente com 25 ex oculares, transfira 30 citos para um prato revestido de polilisina e filtre um SW para ajudar a manter o controle dos citos injetados. Deposite-os ao longo de uma linha de forma ordenada. Sempre injete pequenos números para minimizar a exposição.

Tempo para polilisina, que tende a deformar embriões em desenvolvimento. Use a iluminação do campo escuro para tornar os citos o mais translúcidos possível. Em seguida, com o botão de movimento grosso, aproxime a agulha de injeção de um cite com uma pinça fina. Cortar.

Abra a agulha no nível em que a ponta começa a se curvar pulsando com o injetor. Verifique se a mistura de injeção vermelha está fluindo para fora da agulha com ampliação de 200 x. E com o botão de movimento fino, mova suavemente a agulha de injeção dentro do núcleo do citador.

Se inserida duas superficialmente, a solução injetada não permanecerá dentro do local da UO. Se inserido muito longe, o site UO será destruído. Injete com um a três pulsos.

Se a agulha estiver suficientemente fina, injectar com fluxo contínuo a pressão constante. Certifique-se de que o volume de injeção corresponde a um quinto a um terço do volume de um único oócito após a injeção. Puxe a agulha rapidamente para evitar vazamentos.

Verifique se a solução injetada permanece dentro do cite e se, após alguns segundos, a solução injetada se espalha por todo o cite. Passe para o próximo citador da fila. Mantenha alguns embriões injetados de cada série como controles negativos para estimar a fluorescência de fundo ao procurar embriões injetados fertilizar os oócitos assim que a série for injetada.

Como a qualidade do oócito diminui com o tempo, injete e fertilize os citos dentro de uma hora. Após a desova. Dependendo da concentração de espermatozoides, adicione de uma a cinco gotas de esperma ao UY e gire o prato.

O envelope de fertilização deve se tornar aparente nos embriões. Após cerca de um minuto, permita que os embriões se desprendam da placa revestida de polilisina enquanto injeta outra série de oócitos. Uma vez destacados, transfira os embriões para uma placa de Petri revestida com aros.

Remova os embriões do prato revestido de polilisina, se possível. Antes do estágio de duas células. No estágio de duas a quatro células, selecione embriões injetados com sucesso com o auxílio de um escopo de dissecação fluorescente.

Com um filtro DSR, uma injeção bem-sucedida é indicada pela morfologia normal que exibe um sinal fluorescente vermelho derivado do vermelho de fenol. Manter os embriões e filtrar um SW em placas de Petri revestidas com agros a 19 graus Celsius até o estágio desejado para imagens in vivo, essas imagens representativas de embriões de bronchos stoma lancia lato foram obtidas após microinjeção de mRNAs e revestimento de proteínas fluorescentes. Esta primeira imagem mostra que a expressão de EGFP nuclear obtida por microinjeção de uma construção H two B-E-G-F-P pode ser detectada em embriões já no estágio de 16 células.

Este embrião em estágio gastro é um exemplo de co-expressão onipresente de cereja m nuclear e EGFP direcionado à membrana. O sinal nuclear resulta da microinjeção de uma construção de cereja H two BM, enquanto a fluorescência nas membranas celulares é obtida por microinjeção de uma construção de caixa EEG FP CAAX. Uma seção óptica deste embrião em estágio gastro mostra como os núcleos e os contornos celulares são destacados, respectivamente, por mCherry direcionado a núcleos e EGFP associado à membrana.

A demonstração visual desta técnica de microinjeção apoiará os pesquisadores no desenvolvimento evolutivo da comunidade biológica para melhorar as abordagens existentes e desenvolver novas abordagens para imagens individuais, manipulação específica de genes e estabilidade em afi, um modelo importante para a compreensão da evolução animal.