Cirurgia Estereotáxica em Roedores

A cirurgia estereotipada é uma técnica poderosa utilizada para manipular o cérebro em animais vivos. Atingir regiões profundas dentro do cérebro intacto representa um problema único em que geralmente o alvo cirúrgico não pode ser localizado visualmente. A cirurgia estereotipada ou estereotática foi concebida para atingir regiões discretas do cérebro, conhecendo suas relações espaciais com marcos visíveis. Usando um sistema de coordenadas tridimensional, as ferramentas podem ser direcionadas para locais específicos a fim de medir a atividade cerebral, fazer uma lesão ou realizar manipulações genéticas. Este vídeo abordará os princípios da cirurgia estereotaxa, demonstrará etapas essenciais do procedimento e discutirá várias aplicações da técnica.

Antes de discutir os detalhes processuais, vamos rever os princípios básicos e ferramentas da técnica. Para começar, o estereotaxy depende da localização da região alvo do cérebro em um eixo tridimensional. Para isso, é usado um atlas estereotático. Este documento é uma reconstrução 3D do cérebro obtida a partir de seções seriais de cérebros manchados.

Neste quadro de referência, as relações espaciais são expressas utilizando-se um conjunto de 3 eixos: anterior-posterior, medial-lateral e dorsal-ventral. Para determinar a localização de uma região de interesse, encontre a região cerebral apropriada no atlas e use a grade para calcular as coordenadas mediolaterais e dorsoventra correspondentes. A coordenada anteroposterior é obtida na parte inferior ou superior da página. Esta coordenada é medida a partir de marcos no crânio formados pelas intersecções de placas ósseas, que são conhecidas como suturas. O marco mais proeminente, bregma, é definido como o ponto de intersecção da sutura sagital com a sutura coronal. O ponto conhecido como lambda é mais posterior; onde a sutura sagital cruza a sutura lambdoide.

Para direcionamento preciso ao local calculado durante a cirurgia, é utilizado um dispositivo conhecido como quadro estereotaxico . O quadro consiste no quadro principal, no micromanipulador e no suporte da sonda, que está preso ao grampo de montagem. As barras incisoras e de ouvido fazem contato com o animal para manter a cabeça em posição fixa. O micromanipulador é usado para o movimento preciso de sondas cirúrgicas para coordenadas predeterminadas dentro do cérebro, e é equipado com escamas Vernier deslizantes para medições exatas de distância em todas as três dimensões.

Para ler uma escala vernier, primeiro identifique a localização da linha 0 em relação às marcas de carrapato no lado direito da escala. Este lado da escala é rotulado em incrementos de 10 milímetros, de modo que 1 é 10 e 2 é 20. A localização da marca 0 aqui mostra que a leitura está entre 10 e 11 mm. Para determinar o primeiro número à direita do ponto decimal, encontre a linha na escala esquerda que se alinha melhor com uma marca no lado direito. Use a escala esquerda para identificar o valor desta marca, que neste caso é 9, fazendo a leitura final de 10,9 mm.

Você está familiarizado com os princípios básicos do estereotaxy, então vamos rever como o procedimento cirúrgico é realizado. Antes da cirurgia, o couro cabeludo de um animal anestesiado é raspado e desinfetado. Para segurar o animal no lugar na estrutura estereotaxa, as barras de ouvido são colocadas suavemente nas orelhas, e os dentes da frente são colocados nas barras incisivos. A pomada ocular é aplicada para evitar a secagem da córnea durante a cirurgia.

Para expor o crânio, faça uma pequena incisão com um bisturi. Separe o tecido muscular suavemente e limpe a superfície do crânio. Em seguida, use o micromanipulador para baixar uma sonda para bregma e tomar nota de sua coordenada dorsoventral. Em seguida, levante a sonda e repita este procedimento na lambda. Se a medição lambda estiver a menos de 0,1 mm da coordenada dorsoventral em bregma, o crânio é considerado nivelado e você está pronto para prosseguir. Se não, levante ou baixe a barra incisora e repita as medidas.

Agora que o cérebro está nivelado, retorne ao bregma e grave as coordenadas medio-lateral e antero-posterior. Com base nas coordenadas de destino do atlas cerebral, calcule os movimentos necessários para chegar a esse local e mude a sonda para a posição alvo. Marque esta posição no crânio e use uma broca para fazer cuidadosamente um buraco no osso.

Logo abaixo do crânio você encontrará a dura, uma membrana durável grossa que pode ser suavemente seccionada com a ponta de uma pequena agulha.

Em seguida, o braço micromanipulador é colocado em posição para baixar a sonda para a coordenada dorsoventral alvo, momento em que a manipulação desejada pode ser realizada.

Agora que você entende os passos básicos do procedimento, vamos dar uma olhada em algumas das muitas maneiras que os neurocientistas usam cirurgia estereotaxica para responder perguntas no laboratório.

Para começar, estereotaxy é extremamente útil para fornecer agentes experimentais em regiões cerebrais precisas. Esses agentes podem incluir corantes rastreadores usados para visualizar projeções neuronais e conectividade, compostos químicos ou reagentes para manipulação genética de neurônios. Por exemplo, a injeção de vírus geneticamente modificados resultará na entrega de um gene de interesse para células infectadas. Aqui, um vírus foi injetado no hipocampo, resultando na expressão GFP em uma pequena população de neurônios.

Por outro lado, a entrega viral de RNA de pequenas interferências pode impedir a expressão de proteínas desejadas. Neste exemplo, a expressão da proteína SOD1 foi suprimida em diferentes regiões cerebrais após injeção estereotaxica no ventrículo lateral.

Alternativamente, a cirurgia estereotaxa pode ser usada para colocar eletrodos no cérebro para registro dos sinais elétricos que acompanham a atividade neural. Após a recuperação do animal do procedimento cirúrgico, os eletrodos podem ser conectados a sistemas de gravação eletrofisiológica para observar o disparo neuronal enquanto o rato está se comportando livremente.

Além de medir a atividade neuronal, a cirurgia estereotaxica é fundamental para a microdiálise. Esta técnica permite o monitoramento contínuo de concentrações de drogas, neurotransmissores ou metabólitos no tecido cerebral de animais acordados. Para isso, uma pequena sonda cheia de fluidos com uma membrana semipermeável na ponta é implantada em uma região cerebral específica. Pequenos solutos, incluindo neurotransmissores, hormônios e drogas difusam na sonda, onde podem ser coletados para análise. Neste experimento, a concentração de glicose no hipocampo foi medida como uma leitura para a atividade neural local, enquanto os ratos concluíram uma tarefa que exigia o uso da memória espacial de trabalho.

Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre cirurgia estereotaxica. Neste vídeo, cobrimos os princípios e métodos do procedimento, bem como suas muitas aplicações em laboratórios de neurociência.

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