Fluorescent Rápida In Situ Protocolo de hibridação para Xist RNA combinado com imunofluorescência de Histone Modificação na inativação do cromossomo X

O objetivo geral deste procedimento é investigar a dinâmica do RNA não codificante longo e sua modificação epigenética associada durante a inativação do cromossomo X usando uma hibridização in situ fluorescente rápida combinada com imunofluorescência. Este protocolo requer a preparação de citosina de lâminas com células do corpo embrionário diferenciadoras, que são permeadas e depois fixadas para coloração. Em seguida, o marcador fluorescente localizado por um anticorpo para a histona H, três trimetillisina 27 se acumula no cromossomo X inativo.

A etapa final usa sondas de oligonucleotídeos que contêm uma modificação de cinco aminoácidos primos e são marcadas com um fluoróforo reativo médio AM para executar a existência. Peixes de RNA. Em última análise, a microscopia de fluorescência é usada para mostrar a localização da nuvem de RNA existente e a modificação de histonas durante a diferenciação de células E ES.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que usamos vários oligonucleotídeos exclusivos, que são marcados com um único fluoro quatro. Isso nos fornece detecção trans específica, que reduz o fundo, e isso também aumenta a penetração no núcleo e aumenta ou aumenta a intensidade dos sinais. Além disso, quando aumentamos a concentração das sondas, podemos reduzir significativamente o tempo necessário para completar este experimento com peixes imunológicos.

Embora este método possa fornecer informações sobre a localização da AR existente no cromossomo ex inativo e sua modificação cromoscómica associada. Também pode ser aplicado a outros sistemas biológicos para a detecção de ARs e sua modificação epigenética associada, localização nuclear e regulação transgeracional. Para preparar as sondas primeiro, obtenha vários oligos de 20 a 30 nucleotídeos de comprimento com uma temperatura de fusão de 63 a 65 graus Celsius e que contenham uma sequência anti-sentido única para um RNA existente e uma modificação de cinco aminoácidos primos.

Suspenda esses oligos em quantidades equimolares de poças de água pura dos vários oligos para um total de 4,5 microgramas de DNA. Em seguida, seguindo as instruções do fabricante, rotule os oligos com um corante fluorescente reativo am mean após a rotulagem dos oligos. Passe-os por uma coluna G 25.

Em seguida, usando etanol e acetato de sódio, precipite os oligos. Isso requer um período de meia hora a 80 graus Celsius negativos antes de um giro de 21.000 G a quatro graus Celsius. Em seguida, lave o pellet uma vez com 70% de etanol após a lavagem.

Resus suspende os oligos em 50 microlitros de água livre de nuclease ou tris EDTA até uma concentração final de 10 DNA micromolar. Isso faz com que a solução de estoque da sonda para usar a sonda reconcentre-a em 250 nano molar em tampão de hibridização. Para começar, as células diferenciadoras de ES ou EB crescendo em seis placas de poço, aspire o meio de cultura dos poços e, em seguida, lave as células em temperatura ambiente.

PBS aspira completamente o PBS. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de solução de tripsina a cada poço e incube a placa por cinco a 10 minutos. Pare a reação de tripsin adicionando cinco mililitros de meio a cada poço e pipetando-os suavemente.

Em seguida, transfira as células para um tubo de 15 mililitros. Agora gire as células por cinco minutos a 200 Gs à temperatura ambiente, remova todo o sobrenadante e ressuspenda o palete de células em dois mililitros de PBS. Em seguida, contar as células e diluir a suspensão para 400.000 células por mililitro em PBS.

Agora, monte cada lâmina com um cartão de filtro, uma câmara e um clipe. Faça quantos forem necessários e posicione-os no rotor de um giro de cito. Adicione 250 microlitros de suspensão celular a cada lâmina e gire as lâminas a 1500 RPM por 10 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, faça permanente e corrija. Em primeiro lugar, transfira rapidamente as lâminas para PBS gelado por cinco minutos como uma etapa de enxágue. Em segundo lugar, transfira as corrediças para o amortecedor CSK gelado por um minuto para inchar, em terceiro lugar, mova as corrediças para o tampão CSKT por cinco minutos para permanenteizar as células.

Em quarto lugar, lave as células em tampão CSK gelado por um minuto. E, por último, fixe-os em temperatura ambiente 4% de aldeído paraforme em PBS por 10 minutos. Primeiro, remova as lâminas da solução PFA.

Em seguida, transfira-os para um frasco de coplan com PBST por alguns segundos, seguido de colocá-los em uma inclinação para drenar. Em seguida, carregue uma caixa de ponteira de pipeta vazia com água abaixo da inserção do porta-ponteira. Em seguida, limpe a parte de trás dos slides e transfira-os para esta caixa.

Agora cubra cada lâmina com 40 microlitros de solução de bloqueio e cubra suavemente as lâminas com lamínulas. Deixe-os incubar na caixa por 10 minutos no banco. Em seguida, remova as lamínulas e coloque os slides em uma inclinação.

Agora adicione 40 microlitros da solução primária de anticorpo. Recoloque as lamínulas e deixe as lâminas incubarem na bancada por 30 minutos após meia hora. Remova os anticorpos não ligados lavando as lâminas duas vezes em PBST em frascos de coplan.

Agite suavemente e deixe cada lavagem agir por cinco minutos. Em seguida, retorne as lâminas para uma inclinação e deixe o PBST escorrer. Em seguida, limpe o excesso de solução da parte traseira da lâmina e retorne as lâminas para a caixa.

Agora aplique 40 microlitros de uma a 500 soluções de anticorpos secundários em cada lâmina. Cubra as lâminas com lamínulas e deixe-as incubar na bancada por 15 minutos protegidas da luz que avança. Os slides devem estar sempre protegidos da luz.

Remova os anticorpos usando PBST como antes e, em seguida, coloque as lâminas em uma inclinação para drenar. Ao realizar a imunofluorescência, pré-aqueça uma caixa contendo água a 37 graus Celsius. Depois de limpar o tampão de lavagem das costas das lâminas, coloque-as em uma caixa de ponteiras de pipeta com água de temperatura e aplique 500 microlitros de tampão de lavagem de peixe em cada lâmina.

Deixe-os incubar por cinco minutos. Após cinco minutos, aspirar a solução das lâminas ao lado de cada lâmina a oito microlitros da sonda de trabalho à temperatura ambiente e aplicar uma lamínula. Agora transfira as lâminas para a caixa de lâminas pré-aquecidas e incube-as por uma a duas horas a 37 graus Celsius.

Após a incubação, banhe as lâminas em tampão de lavagem de peixes em um frasco de coplan a 37 graus Celsius. Quando as lamínulas caírem, o que geralmente leva alguns minutos, remova as lamínulas e deixe as lâminas incubarem por cinco minutos. Em seguida, transfira as lâminas para uma jarra contendo tampão de lavagem de peixe com 0,5 nanogramas de mancha por mililitro, também a 37 graus Celsius.

Deixe as lâminas incubarem nesta solução por cinco minutos. Agora lave o slide em dois XSSC cinco minutos a 37 graus Celsius. Para finalizar, coloque as corrediças em um dreno inclinado em excesso de dois XSSC.

Limpe-os e monte-os com quatro microlitros de solução Antifa contendo dpi. Peixes de imuno rápido foram usados para observar a localização do RNA existente e a modificação de histonas. Na diferenciação de células EB femininas, o RNA se parece com uma nuvem verde cobrindo todo o comprimento do cromossomo X inativado Nessas células, a modificação da histona H três trimetil lisina 27 é visualizada em vermelho e os núcleos são contra-corados por DPI em azul.

As células EB de camundongos fêmeas diferenciadoras foram processadas no dia 12 da diferenciação. Neste momento, mais de 90% das células mostraram uma nuvem existente nas células As sondas de oligonucleotídeos curtos dos núcleos foram eficientemente capazes de penetrar, resultando na coloração de quase todos os sinais de histona H três trimetil lisina 27 Com nuvens de RNA existentes em 150 núcleos, 97% dos sinais de RNA existentes foram encontrados para co-localizar com essas histonas metiladas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de cinco horas para completar uma leve preparação preparada.

Imuno imunofluorescência para o seu é de três trimestres ly em 27 e existe RA. Se tivermos um desempenho adequado, Este protocolo de peixes imunológicos pode ser aplicado a outras modificações epigenéticas de RNA e proteínas de interesse. Para aplicar este protocolo a um sistema biológico diferente, você pode precisar de alguma otimização. Boa sorte com seus experimentos.