Name: Fluorescent Rápida In Situ Protocolo de hibridação para Xist RNA combinado com imunofluorescência de Histone Modificação na inativação do cromossomo X (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Aprenda a hibridização in situ fluorescente combinada com imunofluorescência para estudar dinâmica do RNA Xist e modificações de histonas na inativação do cromossomo X em células-tronco embrionárias.

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Agradecemos a Hongjae Sunwoo pelos conselhos úteis para o design de oligonucleotídeos em RNA FISH. Agradecemos também a Serenity Curtis pela edição do manuscrito. NY foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado para pesquisa no exterior da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS). Este trabalho foi apoiado pelo NIH (RO1-GM102184), pela March of Dimes Research Foundation (# 6-FY12-337) e pelo Fundo de Desenvolvimento e Subsídio de Curadores do Centro Médico do Hospital Infantil de Cincinnati para YO.

1. Preparação Probe <ol><li> Obter vários oligonucleotídeos únicas em Xist (oligonucleotídeos 20-30 nucleotídeos de comprimento, 63-65 ºC de temperatura de fusão, a Tabela 1) com uma modificação 5&#39;-amino e suspender em água. </li><li> Piscina quantidades equimolares de oligonucleotídeos com 5&#39;-amino modificação (total 4,5 g) e etiqueta com corante fluorescente amino-reactivo seguindo as instruções do fabricante. <ol><li> Dissolve-se os oligonucleótidos reunidos no final de 5 ul de água isenta de nuclease e adicionar 3 mL de 1 M de bicarbonato de sódio à solução de oligonucleótido. </li><li> Adicionar 2 mL de DMSO para o frasco de corante e vortex brevemente reactivo com amina. </li><li> Misturar a solução de oligonucleótido com o corante reactivo em DMSO e incubar a mistura à temperatura ambiente durante 1 h no escuro. </li></ol></li><li> Purifica-se as sondas oligonucleotídicas marcadas com fluorescência por coluna G-25 seguido de precipitação com etanol. <ol><li&gt; Centrífuga coluna G-25 a 750 xg durante 1 min para remover o excesso de tampão de armazenamento. </li><li> Adicionar 40 ul livre de nuclease de água à mistura de rotulagem produzido no Passo 1.2.3 e aplicar à coluna de G-25. Centrifugar a 750 xg por 2 min. </li><li> Adicionar 50 ul de água livre de nuclease, 10 ul de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e 250 ul de etanol a sonda purificada a partir do passo 1.3.2. Armazenar a -80 ° C durante 30 min e centrifuga-se a 21.000 xg durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavar os oligonucleótidos precipitados uma vez com 1 ml de etanol a 70%. </li><li> Re-suspender em 50 ul de água isenta de nuclease ou TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; EDTA 1 mM) para uma concentração final de aproximadamente 10 pM. </li></ol></li><li> Dilui-se as sondas de oligonucleótidos marcados com fluorescência para uma concentração final de 250 nM com tampão de hibridação (formamida a 10%; 2 x SSC [NaCl 300 mM; citrato de sódio 30 mM], 2 mg / ml de BSA, 10% de sulfato de dextrano). NOTA: Com este protocolo FISH rápida, oligonucleotídeo pmantos de Xist foram concebidos e utilizados com uma concentração mais elevada do que o protocolo normal de FISH utilizando sondas oligonucleotídicas, a fim de encurtar o tempo de incubação para a hibridação. </li></ol> 2. Deslize Preparação NOTA: As lâminas podem ser preparados para imuno-FISH utilizando o rato-tronco embrionárias (ES) ou corpo embryoid (EB) diferenciação de células 20, 21 ou por cultivá-las diretamente em um slide tratados com poli-lisina ou usando cytospin com suspensão de células. Aqui, preparação da lâmina por cytospin é mostrado. <ol><li> Aspirar o meio de cultura em um prato de 6 poços. Lavar com PBS (temperatura ambiente), e aspirado cuidadosamente. </li><li> Adicionar 0,5 ml de tripsina para o prato de 6 poços, incubar durante 5-10 min a 37 ° C. </li><li> Adicionar 5 ml de meio e dispersar as células por suavemente pipetando para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Transferir as células para um tubo de 15 ml, centrifugar durante 5 minutos a 200 xg à temperatura ambiente. </li><li> Descartar o meio de umd suavemente suspender as células em 2 ml de PBS. </li><li> Contagem de células utilizando um hemocitómetro, e dilui-se a suspensão celular a 4 x 10 5 células / ml por PBS. </li><li> Montar uma corrediça, um cartão de filtro e uma câmara com um grampo e colocá-los dentro das ranhuras adequadas no rotor do cytospin. Adicionar 250 mL de cada amostra preparada no passo 2.6 em cada câmara das unidades montadas na cytospin. Centrifuga-se a 1.500 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Encher frascos de 3 coplin sobre gelo com 40 mL de cada um de tampão PBS, CSK gelado (10 mM PIPES, pH 6,8; NaCl 100 mM; sacarose 300 mM; MgCl2 3 mM) e tampão CSKT (CSK com tampão de 0,5% de Triton X-100), respectivamente. </li><li> Após a citocentrifugação está terminado, rapidamente transferir a corrediça em PBS gelado e incubar durante 5 min. </li><li> Transferir as lâminas para tampão CSK gelada e incubar durante 1 min. </li><li> Transferir as lâminas para tampão CSKT gelada e incubar durante 5 min. </li><li> Transferir as lâminas de volta para gelada CSK buffer e incubar durante 1 min. </li><li> Transferir as lâminas em 4% de paraformaldeído em PBS e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Imunofluorescência <ol><li> Colocar as lâminas em um frasco coplin com PBST (1x PBS com 0,1% de Tween-20) durante vários segundos. </li><li> Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido para fora do slide e colocá-lo em uma caixa de pipeta-tip vazio com água. Sobrepor a lâmina com 40 ul de solução de bloqueio (PBS 1x, 1% BSA, 0,1% de Tween-20), colocar suavemente uma lamela, e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Retirar as lamelas, remover a solução de bloqueamento e adicionar 40 ul de anticorpo de histona H3K27me3 primário diluído para uma concentração de 1: 500 em solução de bloqueio. Coloque a lamela de volta sobre a lâmina e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. NOTA: Um inibidor RNase na solução de bloqueio pode ser útil para preservar RNA neste RNA FISProtocolo de H quando são utilizados anticorpos policlonais. </li><li> Wash deslizar 2 vezes em frascos coplin cheios de PBST, durante 5 minutos cada, agitando suavemente durante a lavagem. </li><li> Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido e coloque a lâmina de volta na caixa de ponta. Sobreposição com 40 ul do anticorpo secundário (1: 500) diluídos em solução de bloqueio, colocar uma lamela, e incubar durante 15 min no escuro. Para os passos seguintes, manter o slide no escuro em todos os momentos. </li><li> Lavar duas vezes em frascos Coplin com PBST como no passo 3.4. </li></ol> 4. FISH RNA com Oligonucleotide Sondas <ol><li> Pré-aquecer uma caixa de pipeta-tip vazio com água na parte inferior para evitar slides de secagem a 37 ° C por RNA FISH no passo 4.3. </li><li> Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido para fora do slide a partir do passo 3.6 e coloque a lâmina na caixa de pipeta-ponta com water na parte inferior. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem de FISH (10% de formamida em 2 x SSC) sobre a lâmina e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Remover solução de lavagem FISH, adicione 8 mL de sondas de oligonucleotídeos para o slide, coloque uma lamela, e transferir o slide para uma caixa de pipeta-ponta pré-aquecido com água na parte inferior; incubar a 37 ° C durante 1-2 horas. </li><li> Coloque 3 frascos coplin pré-aquecido em banho-maria a 37 ° C com tampão de lavagem FISH, tampão de lavagem FISH com DAPI, e 2x SSC. </li><li> Depois de 1-2 incubação hr para RNA FISH, coloque o slide no tampão de lavagem FISH pré-aquecido. </li><li> Incubar a lâmina durante alguns minutos até que a lamela cai fora da lâmina. </li><li> Colocar a lâmina de volta para o tampão de lavagem, e continuar a incubação durante 5 min. </li><li> Transferir as lâminas para outro frasco coplin com tampão de lavagem pré-aquecido FISH com 0,5 ng / ml DAPI e incubar por 5 min. </li><li> Transferir as lâminas para outro frasco coplin com pré-aquecido 2x SSC e incubar por 5 min. </li><li> Colocar as lâminas em uma inclinação permitindo tampão restante flua no escorregador. Limpe cuidadosamente o excesso de líquido e coloque a lâmina de volta em uma caixa de ponta seca. Adicione 4 l de antifade com DAPI para o slide e colocar uma lamela. </li><li> Selar a lamela com unha polonês e observar ao microscópio. A corrediça pode ser armazenado a 4 ° C no escuro, por alguns meses. </li></ol>

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo, apresentamos um protocolo de imuno-FISH rápida, que leva menos de 5 horas para completar a preparação slide, Xist RNA FISH, e imunofluorescência para H3K27me3. Em comparação com a abordagem geral imuno-FISH para Xist RNA de detecção, que normalmente precisa de incubação durante a noite para RNA FISH, este protocolo não só reduz significativamente o tempo gasto, mas também melhora a sensibilidade imunológica-FISH usando sondas de oligonucleotídeos. Uma vez que é altamente Xist t...

Mammalian inactivação do cromossoma X (XCI) é uma estratégia para compensar o desequilíbrio de dosagem do gene ligado ao X e XY entre XX, em que um dos dois cromossomas X em fêmeas é transcricionalmente inactiva 1. Inativação do cromossomo X é um grande sistema modelo para RNA longo não-codificante (lncRNA) pesquisa. Inativação do cromossomo X é regulada por vários lncRNAs, e tem sido amplamente estudado ao longo das últimas décadas para descobrir os mecanismos de crosstalk entre lncRNAs, transcrição, estrutura da cromatina e organização nuclear 2, 3. O centro X inactivação (XIC) localizado no cromossoma X é um locus genético complexo composto de um número de genes que produzem não codificantes RNAs 4. X-inativo transcrição específico (Xist) lncRNA em mamíferos eutherian é um desses lncRNA que desempenha um papel crucial na inativação do cromossomo X 5,6. Transcrições XIST rodeiam o local do future Xi para iniciar inativação do cromossomo X, e aparecem como uma nuvem quando visualizada usando RNA FISH; esta formação é referido como o &quot;Xist Nuvem&quot; 7. Desde Xist ARN interage com vários enzimas de modificação de cromatina, a co-localização das nuvens XIST com diferentes modificações epigenética para cromatina silenciosa e repressor de transcrição é observado durante a inactivação do cromossoma X 8. Por exemplo, Xist ARN interage com Polycomb complexo repressor 2 (PRC2) que é responsável pela H3K27me3 e induz um estado repressivo 9 cromatina. A ocorrência da nuvem Xist no Xi e sua co-localização com a modificação intensiva H3K27me3 representa uma paisagem heterocromatina facultativa do Xi 10,11. Técnicas de citogenética, como o DNA / RNA FISH têm percorreu um longo caminho desde o método tradicional utilizando sondas radiomarcados 12 às técnicas recentes e avançados, com maior sensibilidade eimagens fluorescentes usando várias sondas de oligonucleotídeos 13,14. PEIXES ADN / ARN acoplado com a imunofluorescência foi rotineiramente usado como uma ferramenta para compreender citológico organização espaço-temporal nuclear, ARN de localização, a estrutura da cromatina e modificações. A preparação mais padrão sonda para RNA FISH envolve o uso de plasmídeo ou cromossoma artificial (BAC) clones bacterianas e sua rotulagem subsequente quer com tradução nick ou iniciação ao acaso 15. No entanto, cerca de 70% dos genes em ratos e 40% de genes em humanos mostram uma sobreposição de transcritos de sentido e anti-16, exigindo assim um método FISH específico de cadeia, a fim de distinguir o sentido e anti-transcrições. Em sondas de ARN transcritos in vitro (ribossonda ) são frequentemente utilizados para específicos de cadeia de ARN FISH 17,18; No entanto, isto envolve a preparação de um clone de plasmídeo ou com o produto de PCR de T7, SP6 ou T3 promotor e ribossondas sintetizar. Além disso, ribossondas derivado genomic DNA ou cDNA geralmente contêm regiões não-específicas e elementos repetitivos, que resultam em alto ruído de fundo. Outra questão é que ribossondas, que são algumas centenas de nucleótidos de comprimento e contêm vários fluoróforos, não pode penetrar de forma eficiente para o núcleo. Para contornar este, várias sondas de oligonucleótidos mais curtos marcados com um fluoróforo único no final foram desenvolvidos que possuem uma boa sensibilidade, a intensidade do sinal uniforme, e facilidade de purificação e de manuseamento 14. Além disso, os oligonucleótidos de ADN são geralmente mais estáveis ​​do que o RNA. Nós aplicamos uma estratégia similar de usar oligonucleotídeos em Xist RNA FISH 19 com imunofluorescência para entender a dinâmica epigenéticas do Xi induzidas por Xist lncRNA durante o processo de inativação do cromossomo X. Este protocolo descreve a criação de sondas de oligonucleótidos e preparação de células apropriada, bem como a utilização de imunofluorescência e ARN FISH. Xist RNA FISH usando oligonucle múltiplaotides é o custo abordagem eficaz a longo prazo, se Xist RNA FISH é realizada rotineiramente em um laboratório. Esta técnica pode ser usada para identificar lncRNAs em células, ao mesmo tempo mapeando sua co-localização com modificações epigenética ou factores. Uma das principais vantagens do protocolo é a capacidade de modificá-lo facilmente para atender um de interesses de pesquisa.

<table><tbody><tr><td>oligonucleotídeos com modificação 5'-amino</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Corante Reativo</td><td>Life Technologies</td><td>A32750</td><td></td></tr><tr><td>MicroSpin G-25 colunas</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2</td><td>Shandon</td><td>59900102</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino, Grau de Biologia Molecular (para tampão de hibridização)</td> <td>Roche</td><td></td><td></td>10715859103</tr><tr><td>Histone H3K27me3 anticorpo</td><td>Active Motif</td><td>61017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, altamente adsorvido</td><td>Life Technologies</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Reagente antidesbotamento ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescent rápida in situ protocolo de hibridação para xist rna combinado com imunofluorescência de histone modificação na inativação do cromossomo x

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Combinando ARN hibridização in situ fluorescente (FISH) com a imunofluorescência (imuno-FISH) cria uma técnica que pode ser empregue no nível da célula individual para detectar a dinâmica espacial de localização de ARN com visão simultânea para a localização de proteínas, modificações epigenética e outros detalhes que pode ser destacado por imunofluorescência. Inativação do cromossomo X é um paradigma para longo RNA não-codificante (lncRNA) silenciamento gênico mediado. Transcrição específico (Xist) acumulação lncRNA X-inactiva (chamado uma nuvem Xist) em um dos dois X-cromossomas em fêmeas de mamíferos é um passo crítico para iniciar a inactivação do cromossoma X. RNA Xist direta ou indiretamente interage com várias enzimas modificadoras da cromatina e introduz paisagens epigenéticas distintas para os inactivos cromossomo X (Xi). Uma característica conhecida da epigenética Xi representa a histona H3 trimetil-lisina 27 modificação (H3K27me3). Aqui, descrevemos um imuno-FISH simples e rápidaprotocolo para a detecção Xist RNA usando RNA FISH com várias sondas de oligonucleotídeos juntamente com imunofluorescência de H3K27me3 para examinar a localização dos Xist RNA e modificações epigenéticas associadas. Usando sondas oligonucleotídicas resulta em um tempo de incubação mais curto e de detecção mais sensível do Xist ARN em comparação com in vitro transcritos de sondas de ARN (ribossondas). Este protocolo fornece uma poderosa ferramenta para a compreensão da dinâmica de lncRNAs e sua modificação epigenética associados, estrutura da cromatina, organização nuclear e de regulação da transcrição.

Imagens representativas de rápida imuno-FISH são apresentados na Figura 1A. A co-localização do sinal de Xist ARN nuvem e H3K27me3 no Xi foi detectado na diferenciação das células do sexo feminino. No dia 12 após a diferenciação, mais de 90% das células tinha uma nuvem EB Xist (Figura 1B). Sondas oligonucleotídicas curto eficientemente penetrou nos núcleos, levando a uma visualização de quase todos H3K27me3 sinais co-localizada com Xist ARN (Figura 1C; 97%, n = 150). </...

Desenvolvemos um protocolo de hibridização in situ fluorescente (FISH) específico para fitas facilmente personalizado combinado com imunofluorescência. Isso permite um exame detalhado da dinâmica do RNA com visão simultânea da estrutura da cromatina, organização nuclear e regulação transcricional no nível de célula única.

Fluorescent Rápida In Situ Protocolo de hibridação para Xist RNA combinado com imunofluorescência de Histone Modificação na inativação do cromossomo X

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

O objetivo geral deste procedimento é investigar a dinâmica do RNA não codificante longo e sua modificação epigenética associada durante a inativação do cromossomo X usando uma hibridização in situ fluorescente rápida combinada com imunofluorescência. Este protocolo requer a preparação de citosina de lâminas com células do corpo embrionário diferenciadoras, que são permeadas e depois fixadas para coloração. Em seguida, o marcador fluorescente localizado por um anticorpo para a histona H, três trimetillisina 27 se acumula no cromossomo X inativo.A etapa final usa sondas de oligonucleotídeos que contêm uma modificação de cinco aminoácidos primos e são marcadas com um fluoróforo reativo médio AM para executar a existência. Peixes de RNA. Em última análise, a microscopia de fluorescência é usada para mostrar a localização da nuvem de RNA existente e a modificação de histonas durante a diferenciação de células E ES.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que usamos vários oligonucleotídeos exclusivos, que são marcados com um único fluoro quatro. Isso nos fornece detecção trans específica, que reduz o fundo, e isso também aumenta a penetração no núcleo e aumenta ou aumenta a intensidade dos sinais. Além disso, quando aumentamos a concentração das sondas, podemos reduzir significativamente o tempo necessário para completar este experimento com peixes imunológicos.Embora este método possa fornecer informações sobre a localização da AR existente no cromossomo ex inativo e sua modificação cromoscómica associada. Também pode ser aplicado a outros sistemas biológicos para a detecção de ARs e sua modificação epigenética associada, localização nuclear e regulação transgeracional. Para preparar as sondas primeiro, obtenha vários oligos de 20 a 30 nucleotídeos de comprimento com uma temperatura de fusão de 63 a 65 graus Celsius e que contenham uma sequência anti-sentido única para um RNA existente e uma modificação de cinco aminoácidos primos.Suspenda esses oligos em quantidades equimolares de poças de água pura dos vários oligos para um total de 4,5 microgramas de DNA. Em seguida, seguindo as instruções do fabricante, rotule os oligos com um corante fluorescente reativo am mean após a rotulagem dos oligos. Passe-os por uma coluna G 25.Em seguida, usando etanol e acetato de sódio, precipite os oligos. Isso requer um período de meia hora a 80 graus Celsius negativos antes de um giro de 21.000 G a quatro graus Celsius. Em seguida, lave o pellet uma vez com 70% de etanol após a lavagem.Resus suspende os oligos em 50 microlitros de água livre de nuclease ou tris EDTA até uma concentração final de 10 DNA micromolar. Isso faz com que a solução de estoque da sonda para usar a sonda reconcentre-a em 250 nano molar em tampão de hibridização. Para começar, as células diferenciadoras de ES ou EB crescendo em seis placas de poço, aspire o meio de cultura dos poços e, em seguida, lave as células em temperatura ambiente.PBS aspira completamente o PBS. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de solução de tripsina a cada poço e incube a placa por cinco a 10 minutos. Pare a reação de tripsin adicionando cinco mililitros de meio a cada poço e pipetando-os suavemente.Em seguida, transfira as células para um tubo de 15 mililitros. Agora gire as células por cinco minutos a 200 Gs à temperatura ambiente, remova todo o sobrenadante e ressuspenda o palete de células em dois mililitros de PBS. Em seguida, contar as células e diluir a suspensão para 400.000 células por mililitro em PBS.Agora, monte cada lâmina com um cartão de filtro, uma câmara e um clipe. Faça quantos forem necessários e posicione-os no rotor de um giro de cito. Adicione 250 microlitros de suspensão celular a cada lâmina e gire as lâminas a 1500 RPM por 10 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, faça permanente e corrija. Em primeiro lugar, transfira rapidamente as lâminas para PBS gelado por cinco minutos como uma etapa de enxágue. Em segundo lugar, transfira as corrediças para o amortecedor CSK gelado por um minuto para inchar, em terceiro lugar, mova as corrediças para o tampão CSKT por cinco minutos para permanenteizar as células.Em quarto lugar, lave as células em tampão CSK gelado por um minuto. E, por último, fixe-os em temperatura ambiente 4% de aldeído paraforme em PBS por 10 minutos. Primeiro, remova as lâminas da solução PFA.Em seguida, transfira-os para um frasco de coplan com PBST por alguns segundos, seguido de colocá-los em uma inclinação para drenar. Em seguida, carregue uma caixa de ponteira de pipeta vazia com água abaixo da inserção do porta-ponteira. Em seguida, limpe a parte de trás dos slides e transfira-os para esta caixa.Agora cubra cada lâmina com 40 microlitros de solução de bloqueio e cubra suavemente as lâminas com lamínulas. Deixe-os incubar na caixa por 10 minutos no banco. Em seguida, remova as lamínulas e coloque os slides em uma inclinação.Agora adicione 40 microlitros da solução primária de anticorpo. Recoloque as lamínulas e deixe as lâminas incubarem na bancada por 30 minutos após meia hora. Remova os anticorpos não ligados lavando as lâminas duas vezes em PBST em frascos de coplan.Agite suavemente e deixe cada lavagem agir por cinco minutos. Em seguida, retorne as lâminas para uma inclinação e deixe o PBST escorrer. Em seguida, limpe o excesso de solução da parte traseira da lâmina e retorne as lâminas para a caixa.Agora aplique 40 microlitros de uma a 500 soluções de anticorpos secundários em cada lâmina. Cubra as lâminas com lamínulas e deixe-as incubar na bancada por 15 minutos protegidas da luz que avança. Os slides devem estar sempre protegidos da luz.Remova os anticorpos usando PBST como antes e, em seguida, coloque as lâminas em uma inclinação para drenar. Ao realizar a imunofluorescência, pré-aqueça uma caixa contendo água a 37 graus Celsius. Depois de limpar o tampão de lavagem das costas das lâminas, coloque-as em uma caixa de ponteiras de pipeta com água de temperatura e aplique 500 microlitros de tampão de lavagem de peixe em cada lâmina.Deixe-os incubar por cinco minutos. Após cinco minutos, aspirar a solução das lâminas ao lado de cada lâmina a oito microlitros da sonda de trabalho à temperatura ambiente e aplicar uma lamínula. Agora transfira as lâminas para a caixa de lâminas pré-aquecidas e incube-as por uma a duas horas a 37 graus Celsius.Após a incubação, banhe as lâminas em tampão de lavagem de peixes em um frasco de coplan a 37 graus Celsius. Quando as lamínulas caírem, o que geralmente leva alguns minutos, remova as lamínulas e deixe as lâminas incubarem por cinco minutos. Em seguida, transfira as lâminas para uma jarra contendo tampão de lavagem de peixe com 0,5 nanogramas de mancha por mililitro, também a 37 graus Celsius.Deixe as lâminas incubarem nesta solução por cinco minutos. Agora lave o slide em dois XSSC cinco minutos a 37 graus Celsius. Para finalizar, coloque as corrediças em um dreno inclinado em excesso de dois XSSC.Limpe-os e monte-os com quatro microlitros de solução Antifa contendo dpi. Peixes de imuno rápido foram usados para observar a localização do RNA existente e a modificação de histonas. Na diferenciação de células EB femininas, o RNA se parece com uma nuvem verde cobrindo todo o comprimento do cromossomo X inativado Nessas células, a modificação da histona H três trimetil lisina 27 é visualizada em vermelho e os núcleos são contra-corados por DPI em azul.As células EB de camundongos fêmeas diferenciadoras foram processadas no dia 12 da diferenciação. Neste momento, mais de 90% das células mostraram uma nuvem existente nas células As sondas de oligonucleotídeos curtos dos núcleos foram eficientemente capazes de penetrar, resultando na coloração de quase todos os sinais de histona H três trimetil lisina 27 Com nuvens de RNA existentes em 150 núcleos, 97% dos sinais de RNA existentes foram encontrados para co-localizar com essas histonas metiladas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de cinco horas para completar uma leve preparação preparada.Imuno imunofluorescência para o seu é de três trimestres ly em 27 e existe RA. Se tivermos um desempenho adequado, Este protocolo de peixes imunológicos pode ser aplicado a outras modificações epigenéticas de RNA e proteínas de interesse. Para aplicar este protocolo a um sistema biológico diferente, você pode precisar de alguma otimização. Boa sorte com seus experimentos.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Montar toda a hibridização in situ é uma das técnicas mais utilizadas em biologia do desenvolvimento. Aqui, apresentamos uma alta resolução de dupla fluorescentes em protocolo de hibridização in situ para analisar o padrão de expressão precisa de um único gene e para determinar a sobreposição dos domínios de expressão dos dois genes. Incluímos uma propidium iodeto nuclear contra-coloração para destacar a organização do tecido.

Zebrafish Whole Mount Alta Resolução Duplo Fluorescente In Situ Hibridização

Um método quantitativo para a análise da replicação do cromossoma de temporização é descrito. O método utiliza a incorporação de BrdU, em combinação com...

Tempo cromossomo Replicando Combinado com Fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

Todo o Monte RNA Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; A hibridação de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriões

Hibridização in situ fluorescente (FISH), permite a detecção de ácidos nucleicos no seu ambiente nativo dentro das células. Nós aqui descrever um protocolo para o combinado, a detecção simultânea de RNA e DNA, por meio de FISH, que pode ser usado para estudar inativação do cromossomo X em células-tronco embrionárias.

DNA-RNA combinado fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; A hibridização (FISH) para estudar inativação do cromossomo X em Diferenciada Feminino Rato Células-Tronco Embrionárias

Aqui, apresentamos um método simples para realizar hibridização in situ de DNA de fluorescência (DNA ISH) para visualizar sequências heterocromáticas repetitivas em cromossomos montados em lâminas. O método requer reagentes mínimos e é versátil para uso com sondas curtas ou longas, tecidos diferentes e detecção com sinais baseados em fluorescência ou não fluorescência.

Método simples para DNA de Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com Cromossomos Squashed

Localizar a expressão gênica em tipos específicos de células pode ser um desafio devido à falta de anticorpos específicos. Aqui descrevemos um protocolo para detecção tripla simultânea de expressão gênica combinando hibridização in situ de RNA de fluorescência dupla com imunocoloração.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

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Este vídeo demonstra de 2 cores montar toda hibridização in situ, um método pelo qual o padrão de expressão espacial e temporal de 2 genes diferentes podem ser visualizados em embriões de galinha jovens. Este método foi originalmente introduzido por David Wilkinson, Henrique Domingos, Phil e David Ingham Ish-Horowicz.

Monte Whole dupla hibridização in situ de embriões de galinha precoce

Aprenda a hibridização in situ fluorescente combinada com imunofluorescência para estudar dinâmica do RNA Xist e modificações de histonas na inativação do cromossomo X em células-tronco embrionárias.

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