Preparação de Mica Apoiado Lipid Bicamadas para alta resolução Microscopia Óptica de Imagem

O procedimento apresentado aqui mostra um método fácil de preparar lipídios suportados por MICA por camadas adequadas para imagens de alta resolução, como estudos de rastreamento de molécula única tur. A superfície de MICA é preparada dividindo um sanduíche de uma única folha de MICA colada entre a lâmina de microscópio de vidro e a lamínula usando adesivo óptico que expõe uma superfície plana e extremamente fina de mica fresca. Ao montar uma pequena câmara de plástico feita de um copo de frasco de um mililitro e meio, o volume de vesículas lipídicas necessárias para a formação de bicamadas pode ser tão baixo quanto 30 microlitros.

Como primeiro passo, pegue a folha multicamadas de MICA como vem do fornecedor e corte-a com uma tesoura em pedaços menores. Folheto de Al em dois ou três folhetos mais finos usando uma lâmina de faca nova. Agora limpe a tampa dorme completamente.

Isso envolve a colocação de uma cobertura de 0,17 milímetros. Dorme em um frasco de treinamento de vidro em cada capa. Durma em um slot separado e sonice em detergente por 30 minutos a 60 graus Celsius.

Lave a capa. Dorme de 10 a 20 vezes com mini água de chave e seque com um jato de ar ou nitrogênio. Pegue uma lâmina de vidro de microscópio e limpe-a com lugar.

Uma pequena gota de cerca de 15 microlitros de ahe óptico de baixa viscosidade na explosão do microscópio e no globo anteriormente. Corte o hasif do folheto em uma caixa de luz ultravioleta por alguns minutos. Use fita adesiva para descascar algumas camadas de mica.

As primeiras camadas serão fragmentadas, então faça isso até ver essas camadas anexadas ao uísque. As fitas são uniformes e totalmente. Cubra a fita.

Coloque uma gota de adesivo óptico de alta viscosidade na superfície de Miquéias. Certifique-se de que não haja bolhas de ar ali. Coloque suavemente o sono de cobertura limpa na gota ofensiva.

Use uma pinça para bater suavemente no copo para espalhar o ahe. Novamente, catalise o adesivo com luz ultravioleta por alguns minutos. Use uma faca para dividir o sanduíche de vidro.

Deslize o MICA e cubra o sono. Na maioria dos casos, apenas uma camada muito fina de MICA permanecerá colada ao sono da capa. Use um microscópio de dissecação para inspecionar a superfície do MICA, fazendo pequenos arranhões com a ponta de uma agulha ou pinça.

Você pode dizer facilmente se a superfície é realmente mica, onde a superfície é uniformemente arranhada, como aqui ou no adesivo óptico, como aqui, onde a superfície é brilhante. Pegue um copo de um frasco de vidro de um mililitro e meio, remova o gás e cole a tampa na superfície MICA usando esmalte. Deixe secar por alguns minutos.

Agora você pode preparar um lipídio de reparo de bicamada lipídica por camada usando um protocolo padrão aqui. Uma gota de 30 microlitros de vesículas lipídicas é colocada na câmara da tampa do frasco e será incubada por 60 minutos antes de lavar o tampão. Após a lavagem, a amostra está pronta para a geração de imagens.

Neste caso, é montado no suporte feito-à-medida da amostra. Moléculas individuais podem ser facilmente observadas em tal superfície MICA preparada. Aqui comparamos A-D-O-P-C por camada suportada em vidro e mica.

Observe que o tipo de movimento difere substancialmente entre essas duas superfícies. O caminho de moléculas individuais traçadas em cores nos painéis à direita mostra claramente que o comportamento de difusão no MICA difere daquele no vidro. No entanto, não há diferença significativa na qualidade da imagem.

A trama média da função reta na metade da intensidade máxima para 20 focos é quase a mesma para ambos os substratos, indicando que a superfície MICA é totalmente penetrável pela luz sem introduzir aberrações ópticas perceptíveis. No geral, a MSDS mostra uma diferença óbvia no comportamento de difusão. No entanto, para cada caso, duas populações de partículas se difundindo em taxas diferentes podem ser observadas.

Dois coeficientes de difusão diferentes, rápido e lento, foram extraídos da alimentação exponencial dupla para a probabilidade cumulativa de deslocamento quadrado. Para esta bicamada DOPC, ambos os componentes de difusão são mais rápidos na superfície MICA, as partículas em movimento lento no MICA são cerca de 10 a 20 vezes mais lentas que a rápida. A população lenta no vidro, no entanto, está perto de ficar imóvel por aqui.

Mostramos que esse tipo de superfície pode fazer diferença no comportamento de difusão de bicamadas lipídicas. Assim, é preciso ter cuidado ao comparar os resultados entre estudos em bicamadas suportadas em diferentes substratos, como MICA e as bicamadas de imagem de vidro em MICA, geralmente é bastante difícil devido à preparação complicada que mostramos, no entanto, maneira simples, mas eficaz, de preparar superfícies de alta qualidade.